细菌内毒素检查法培训课件
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❖ B、材料与器具：细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查 用水、漩涡混合器、37±1℃试管恒温仪、稀释、移液容器、试管架 或试管浮板、酒精灯、消毒酒精棉球、剪刀、砂轮、镊子、封口胶布 标记纸等。
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细菌内毒素检查法
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❖ (3)鲎试剂灵敏度的复核试验 ❖ A、复核的条件：本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒
移取注射液xml
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Vml MVD？ L·x/v=L×MVD ≥入,MVD≥ 入/L
EU/ml
细菌内毒素检查法
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❖ 3.检查方法 ❖ （1）检查程序：①实验试剂、仪器及用具等的准备；（除内毒素） ❖ ②确定药品的细菌内毒素限值L； ❖ ③选择鲎试剂的灵敏度入； ❖ ④计算供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度； ❖ ⑤鲎试剂灵敏度的复核； ❖ ⑥药品与鲎试剂的相容性的初选实验（无干扰浓度初选）； ❖ ⑦供试品的干扰实验的验证（正式干扰试验）； ❖ ⑧供试品日常的内毒素限量检查。 ❖ 在实际操作过程中，（1）→（4）顺序可变，（5）→（8）顺序不
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❖ 鲎的图片
鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在只有化 石)一样古老的动物。
鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试 剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品 工业中，可用它对毒素污染进行监测。
三、细菌内毒素检查法
❖ （一）概述
❖ 1.内毒素(Endotoxin)： 即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A，菌体死亡崩解后释放 出来。
❖ 2.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生 的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
❖ 3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌 冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固 蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和 （1,3）-β-葡聚糖激。
素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批 号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进 行鲎试剂灵敏度复核试验。
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clg 1( X/4)
❖ B、操作：
支
内毒素工作标准品或国家标准品
稀 释
内毒素检查用水溶解15min
0.1m 4支 l
在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的测定。 MVD=CL/入。
L：内毒素限值；c：供试品溶液浓度，当L以EU/ml表示时，
c=1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/u表示时， c的单位为mg/ml或
u/ml，如：供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD=1
例如：称取mg供试品
EU/mg
Vml C最大有效 L×m/v=L×c样≥入,c样≥入/L
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❖ 4.检查方法：包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后 者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中 任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规 定外，以凝胶法结果为准。
❖ 5.检查的意义：注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射 剂安全性的重要质量指标。
❖ ⑤细菌内毒素的限值（L）：哺乳动物对细菌内毒素的量有一定的耐 受力，只有内毒素超过一定的限度，才会引起热原反应。因此内毒素 的检查是一个限量检查，只要不超过限值，产品就合格。确定限值的 方法—从质量标准正文中查出。
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❖ ⑥最大有效稀释倍数（MVD）：供试品溶液被允许稀释的最大倍数，
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❖ （二）凝胶法 ❖ 1.原理：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内
毒素的方法。(限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数） ❖ 内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 ❖ 该法优点：快速、灵敏。 ❖ 2.细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂 ❖ ①细菌内毒素国家标准品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到的内
2.0λ 内毒素溶液
呈阳性
0.1ml/
支
规 格
0.1ml
复溶
鲎 试
内毒素检Fra Baidu bibliotek用水
4支 0.1ml 1.0λ 内毒素溶液 37±1℃
结
4支 0.1ml 0.5λ 内毒素溶液 保温1h
果 有
效
剂 原 安
4支
0.1m
l
0.25λ 内毒素溶液
18
瓿
2支
0.1m
l
内毒素检查用水
呈阴性
当λc在0.5λ～2.0λ时，方可用于内毒素
毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价、复核、仲裁鲎试剂灵 敏度。
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❖ ②细菌内毒素工作标准品（CSE）：系以细菌内毒素国家标准品为基 准进行标定，确定其质量的相当效价。1ng工作标准品效价应不小于 2EU，不大于50EU。用于鲎试剂灵敏度的复核、干扰试验及设置的 各种阳性对照。
❖ ③细菌内毒素检查用水（BET水）：系指内毒素含量小于0.015EU/ml 的灭菌注射用水。是细菌内毒素检查专用水。
❖ ④鲎试剂和鲎试剂灵敏度：a、鲎试剂的生产：利用鲎血制备而成。
❖ 鲎试剂的种类：美洲鲎试剂（LAL）、中国鲎试剂（TAL）、圆尾鲎 试剂（CAL）。
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❖ B、鲎试剂的规格：是指每支鲎试剂的装量，如：0.1ml、0.5ml。一 般来说，规格是多少就用多少细菌内毒素检查用水复溶。如：0.1ml 就用0.1ml细菌内毒素检查用水复溶。
❖ C、鲎试剂标示灵敏度：细菌内毒素检查的规定条件下，使鲎试剂产 生凝集的内毒素的最低浓度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。
能变。
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❖ (2)实验准备
❖ A、除去干扰：试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内 毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰 细菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配 套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操 作过程应防止微生物的污染。
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❖ (3)鲎试剂灵敏度的复核试验 ❖ A、复核的条件：本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒
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❖ 3.检查方法 ❖ （1）检查程序：①实验试剂、仪器及用具等的准备；（除内毒素） ❖ ②确定药品的细菌内毒素限值L； ❖ ③选择鲎试剂的灵敏度入； ❖ ④计算供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度； ❖ ⑤鲎试剂灵敏度的复核； ❖ ⑥药品与鲎试剂的相容性的初选实验（无干扰浓度初选）； ❖ ⑦供试品的干扰实验的验证（正式干扰试验）； ❖ ⑧供试品日常的内毒素限量检查。 ❖ 在实际操作过程中，（1）→（4）顺序可变，（5）→（8）顺序不
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❖ 鲎的图片
鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在只有化 石)一样古老的动物。
鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试 剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品 工业中，可用它对毒素污染进行监测。
三、细菌内毒素检查法
❖ （一）概述
❖ 1.内毒素(Endotoxin)： 即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A，菌体死亡崩解后释放 出来。
❖ 2.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生 的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
❖ 3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌 冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固 蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和 （1,3）-β-葡聚糖激。
素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批 号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进 行鲎试剂灵敏度复核试验。
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❖ B、操作：
支
内毒素工作标准品或国家标准品
稀 释
内毒素检查用水溶解15min
0.1m 4支 l
在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的测定。 MVD=CL/入。
L：内毒素限值；c：供试品溶液浓度，当L以EU/ml表示时，
c=1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/u表示时， c的单位为mg/ml或
u/ml，如：供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD=1
例如：称取mg供试品
EU/mg
Vml C最大有效 L×m/v=L×c样≥入,c样≥入/L
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❖ 4.检查方法：包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后 者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中 任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规 定外，以凝胶法结果为准。
❖ 5.检查的意义：注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射 剂安全性的重要质量指标。
❖ ⑤细菌内毒素的限值（L）：哺乳动物对细菌内毒素的量有一定的耐 受力，只有内毒素超过一定的限度，才会引起热原反应。因此内毒素 的检查是一个限量检查，只要不超过限值，产品就合格。确定限值的 方法—从质量标准正文中查出。
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❖ ⑥最大有效稀释倍数（MVD）：供试品溶液被允许稀释的最大倍数，
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❖ （二）凝胶法 ❖ 1.原理：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内
毒素的方法。(限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数） ❖ 内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 ❖ 该法优点：快速、灵敏。 ❖ 2.细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂 ❖ ①细菌内毒素国家标准品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到的内
2.0λ 内毒素溶液
呈阳性
0.1ml/
支
规 格
0.1ml
复溶
鲎 试
内毒素检Fra Baidu bibliotek用水
4支 0.1ml 1.0λ 内毒素溶液 37±1℃
结
4支 0.1ml 0.5λ 内毒素溶液 保温1h
果 有
效
剂 原 安
4支
0.1m
l
0.25λ 内毒素溶液
18
瓿
2支
0.1m
l
内毒素检查用水
呈阴性
当λc在0.5λ～2.0λ时，方可用于内毒素
毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价、复核、仲裁鲎试剂灵 敏度。
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❖ ②细菌内毒素工作标准品（CSE）：系以细菌内毒素国家标准品为基 准进行标定，确定其质量的相当效价。1ng工作标准品效价应不小于 2EU，不大于50EU。用于鲎试剂灵敏度的复核、干扰试验及设置的 各种阳性对照。
❖ ③细菌内毒素检查用水（BET水）：系指内毒素含量小于0.015EU/ml 的灭菌注射用水。是细菌内毒素检查专用水。
❖ ④鲎试剂和鲎试剂灵敏度：a、鲎试剂的生产：利用鲎血制备而成。
❖ 鲎试剂的种类：美洲鲎试剂（LAL）、中国鲎试剂（TAL）、圆尾鲎 试剂（CAL）。
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❖ B、鲎试剂的规格：是指每支鲎试剂的装量，如：0.1ml、0.5ml。一 般来说，规格是多少就用多少细菌内毒素检查用水复溶。如：0.1ml 就用0.1ml细菌内毒素检查用水复溶。
❖ C、鲎试剂标示灵敏度：细菌内毒素检查的规定条件下，使鲎试剂产 生凝集的内毒素的最低浓度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。
能变。
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❖ (2)实验准备
❖ A、除去干扰：试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内 毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰 细菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配 套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操 作过程应防止微生物的污染。