实验三 柠檬酸发酵实验

实验三柠檬酸发酵实验

一、目的要求

1.了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分析方法。

2. 通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的接种、培养与发酵产物的分析测定等技术。

二、基本原理

CH2—COOH

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1.柠檬酸结构式：HO—C—COOH

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CH2—COOH

柠檬酸分子式：C6H8O7

2. 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3为宜。

用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌（合成途径见图1）。在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。本试验用中柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。

2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O

HOOCCH2C(OH)(COOH)CH2COOH+3NaOH———NaOOCCH2C(OH)(COONa)CH2COONa+3H2O

三、实验材料

1．菌种黑曲霉斜面菌种。

2．实验器材

0.1mol/L标准NaOH；0.1mol/L H2S04；

Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2L/L H2S04中)（有毒）；

酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广范pH试纸；玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，滴管，天平。

3. 柠檬酸发酵培养基：硫酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS04 ·7H2O 0.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／L NaOH约2滴。取50ml上述培养液，加入250 mL三角瓶中，包扎灭菌，待用。

四、实验步骤（实验内容）

1．菌种活化：

菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种黑曲霉，移至斜面培养基，经25~28℃斜面培养至孢子长好，作为活化后的种子。发酵用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养基，得到的培养物作为发酵用的种子。

2. 种子液的制备：取活化好的斜面菌种，无菌操作（不要在无菌室），取5ml无菌水至黑曲霉斜面，用接种环轻轻刮下孢子，轻轻振荡制成孢子悬浮液。

3．发酵：无菌操作（不要在无菌室），取柠檬酸发酵培养基（液）3瓶，吸取3 ml孢子悬浮液接种于柠檬酸发酵培养液中。摇床转速250 rpm，26~28℃摇床培养5~7d，另1瓶不接种留作对照。观察发酵过程中pH的变化并记录。

（注意：当pH3左右是积累柠檬酸的最佳时期）

4．发酵液预处理

取发酵液经过滤将3瓶培养液过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后弃去。

5. 发酵产物的检验与分析

定性检验：取过滤液和对照液各约5ml，放入试管内，加Deniges液l mL，在酒精灯上缓缓加热至沸。逐滴加入20 g/L KMn04溶液，若有柠檬酸存在，则出现白色沉淀。

6．柠檬酸含量的初步测定

酸度滴定法：将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10ml放入150ml三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH滴定酸度。对照亦按同法滴定。二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸(g／L)的大约数。

计算公式：C NaOH×(V滴定发酵液-V滴定对照) ×10-3

C柠檬酸= ━━━━━━━━━━━━× 192

3 × 10 ×10-3

式中 C柠檬酸――柠檬酸的浓度(g／L)

C NaOH――NaOH标准溶液浓度(mol／L)

V滴定发酵液――滴定发酵液所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)

V滴定对照――滴定对照所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)

五、实验结果与与讨论

1、影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素有哪些？

2、记录发酵过程产酸变化情况并进行结果分析(pH变化曲线)；

3、柠檬酸定性、定量测定结果与分析，并对菌种产酸能力等进行评定。