实验三 柠檬酸发酵实验
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理柠檬酸是一种有机酸，化学式为C6H8O7。
它常见于柠檬、橙、柚子等柑橘类水果中，具有酸味和鲜味。
柠檬酸的发酵是指通过微生物在适宜环境条件下对柠檬酸底物进行代谢分解，产生新的化合物、气体或能量的过程。
柠檬酸发酵的过程可以分为两个阶段：引入柠檬酸菌和发酵反应。
首先，柠檬酸发酵的关键是引入柠檬酸菌。
柠檬酸菌是一类嗜酸性细菌，它们广泛存在于自然界中，常见于各种水果、土壤、植物等环境中。
这些细菌具有代谢柠檬酸的能力，并能分解柠檬酸为其他代谢产物。
在适宜的生长条件下，柠檬酸菌会在培养基中生长和繁殖。
柠檬酸菌需要一定的温度、pH值以及营养物质供应，如碳源、氮源、矿物盐等。
这些条件对于维持菌体生长和代谢活性都非常重要。
当柠檬酸菌引入培养基后，它们会开始与柠檬酸底物进行代谢，进而引发柠檬酸的发酵。
柠檬酸发酵可产生以下代谢产物。
首先，柠檬酸菌代谢柠檬酸的初始酶是柠檬酸酶，将柠檬酸分解为顺式-脱氢异柠檬酸。
柠檬酸酶存在于柠檬酸菌的细胞内。
随后，顺式-脱氢异柠檬酸经过酶促反应被还原为'顺式'脱氢酶异柠檬酸，再被脱氢酶反应转化为柠檬酸。
接下来，由于柠檬酸发酵过程中柠檬酸的分解和合成是相互竞争的，此时代谢产物多取决于柠檬酸菌生长条件的调节。
在有氧条件下（即有足够的氧气供应），柠檬酸将被完全代谢为二氧化碳和水，释放能量。
此时发酵的产物主要是气体，如二氧化碳。
这种情况下，柠檬酸发酵可以在其它微生物中应用。
然而，当在缺氧条件下进行柠檬酸发酵时（如在发酵罐中），由于氧气供应不足，柠檬酸菌会进一步代谢柠檬酸。
在此情况下，发酵的产物主要是有机酸，如乳酸、丙酸等。
这种发酵过程称为无氧呼吸。
结合柠檬酸菌自身特点和提供的环境条件，可以选择调控发酵过程中柠檬酸的转化路径，实现不同发酵产品的生产。
总结起来，柠檬酸发酵的原理是通过引入柠檬酸菌并在适宜条件下提供营养物质，利用柠檬酸菌的代谢能力，将柠檬酸转化为新的化合物。
柠檬酸发酵及产物提取
综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。
6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
7 麦明谦 柠檬酸的发酵
柠檬酸的发酵一．实验简介柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸或2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，是水果中含量极为丰富的一种有机酸。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸，黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径为：首先将玉米中的淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP途径转变为丙酮酸，丙酮酸再由氧化酶氧化成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰CoA,然后在柠檬酸合成酶的作用下生产柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰离子等金属离子的条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的a-酮戊二酸脱氢酶受到阻遏，TCA循环变成“马蹄形”代谢汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累，达到生产的目的。
二．实验的试剂和材料玉米淀粉、黑曲霉、a-淀粉酶、水、碳酸钙、无菌水、0.1429mol/LNaoH、酚酞指示剂三．实验仪器及设备三角瓶300ml 、玻璃棒、电子称、摇床、水浴锅、高压灭菌移液管、带塞的三角、接种环四．实验步骤1.黑曲霉孢子悬液的制备:(1)培养基的配制①配方：硝酸钠1.5g 磷酸氢钾0.5g 硫酸镁0.25g 氯化钾0.25g 硫酸亚铁0.005g 蔗糖15g 琼脂10g 蒸馏水500ml PH 5.0-6.0②称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入烧杯中。
③熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述烧杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。
④定容：将加热后的培养基倒入量筒中，用自来水进行定容，至500ml。
⑤调PH：待培养基稍冷却后，用精密的PH试纸测量培养基的原始PH，若偏酸，用1mol/LnaoH边滴边加边搅拌，使之达到PH5.0-6.0；若偏碱，则用1mol/L调节。
⑥分装：用分装装置将培养基装入培养皿中，高度在培养皿高度的三分之一左右。
⑦灭菌：将培养皿用牛皮纸包扎好，放在0.1Mpa，121℃，20min 高压蒸汽灭菌。
实验三 柠檬酸发酵
实验二柠檬酸发酵【课前预习】复习微生物学及实验过程、发酵工程、生物分离工程所学到的微生物培养及生物物质分离的分离方法，了解影响微生物生长及生物物质提取过程中的各种影响因素。
【实验目的】1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；3. 通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
【实验要求】1. 10-15 人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
2. 总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
【实验原理】黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2C6H8O7+2H2O【实验用品】1. 实验主要仪器设备摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；析天平；蒸发器；分光光度计；比色管；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡萄糖；草酸铵结晶紫液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。
发酵工程应用实例 柠檬酸发酵
a 麸曲培养基： 新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与第二级扩大培 养基所用液体培养基相同。 b琼脂固体培养基： 与斜面培养基相同。
② 表面发酵
（1）一般发酵法 • 根据菌种的产酸能力，液层一般在8~12cm，一次性发酵至结束。
（2）置换法 • 一次发酵结束，将酸液从菌膜下排走，然后在菌膜下通入无菌
水，静止1小时，待菌膜中酸液渗入水中，排走洗水至贮酸桶， 再通入置换液，液层视菌种生产能力而定，一般在6~8cm。
② 表面发酵
（3）添加法 • 有两种方法：一是分菌膜生长期和产酸期，生长期的液层3cm左右，
a 浅盘发酵
③ 固体发酵
a 浅盘发酵
• 浅盘固态发酵在发酵室内进行，发酵时也叫曲房，需要配置 无菌空调设备，室内放置盘架，以8~10层为宜，架盘层垂直 间距为15~20cm。
• 浅盘发酵的容器可以采用发酵盘（曲盘、竹盘等）曲盘的厚 度在6~8cm，材料可以是木质，铁质或不锈钢等，盘底最好是 多孔篩板，以利于通气。
在薯干粉发酵柠檬酸中，初始pH不加调节,约5.5。当接入菌 种后，菌种生长繁殖，消耗氮源和铵离子，使培养基的PH下降， 前期pH下降较快，活力强的菌种微生物培养12h后，ph可以降至 2.5-3.0，24小时后可以降至2.2-2.3，这时会有少量的柠檬酸产 生，但要到48小时后柠檬酸才大量产生，才使pH下降至2.0以下。
• 置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖， 待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发 酵液用来提取柠檬酸。
柠檬酸发酵实验
食品生物工程与设备实验指导书编者：西北农林科技大学食品科学与工程学院二00九年五月《生物工程与设备》综合性实验大纲一、实验课开设目的。
通过综合性实验要求学生掌握发酵的过程及发酵产物的分离提取的方法及一般步骤，增强学生的动手能力，培养工程素养。
二、实验课学时分配。
本课程总学时36，其中讲课27，综合性实验6。
序号实验题目学时1柠檬酸的发酵、提取及精制6合计6三、实验课教材、参考数目1、理论讲授教材梁世中主编,生物工程设备,中国轻工出版社,2002年2月。
2、实验指导书自编实验指导书3、参考书(1)程丽娟,薛泉宏,微生物学实验技术,兴界图书出版公司,2000年4月。
(2)贾世儒主编，生物工艺与工程试验技术，中国轻工业出版社，2002年9月。
四、实验内容及要求实验柠檬酸的发酵、提取及精制(6学时)柠檬酸的发酵一、目的要求了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产方法。
二、基本原理用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等。
本实验以糖为发酵原料，黑曲霉为产生菌。
黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强。
ph1.6～1.7时尚能生长。
且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以在pH2-3为宜。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等。
若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸。
柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。
三、实验材料1．菌种黑曲霉斜面菌种3支。
2．器材柠檬酸发酵培养液硝酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS040.25g，蔗糖150g，lmol／L HCl17ml，水1000ml。
取100ml上述培养液，加入500ml三角瓶中，包扎灭菌。
Deniges试剂(HgO1g溶于20ml0.2L／L H2S04中)；0.1mol／L标准NaOH 0.1mol／L H2S04;酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml 量筒；广泛pH试纸；玻璃棒；牛角勺；布氏漏斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管，天平。
柠檬酸液态发酵及提取工艺
柠檬酸液态发酵及提取工艺综述摘要:发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，从而改良提取工艺。
关键词：柠檬酸液态发酵提取工艺一、前言柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸发酵
柠檬酸发酵【实验目的】 1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；【实验原理】黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
【实验用品】1. 实验主要仪器摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；分析天平；蒸发器；分光光度计；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。
取A液20mL，B 液80mL混合，静置48 小时后使用2. 材料菌种黑曲霉【方法步骤】1.柠檬酸发酵菌种培养基1升（蔗糖合成培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g，麦芽汁20ml，用水定溶至1000ml）分装、灭菌。
1.4 接种活化的黑曲霉孢子（约0.5%）接种入培养基中，在33-36℃，200-300r/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。
柠檬酸发酵的原理及工艺流程
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柠檬酸发酵的实习报告
实习报告一、实习背景及目的近年来，随着食品、饮料、制药等行业的快速发展，柠檬酸及其衍生物的需求量逐年增加。
作为一种重要的有机酸，柠檬酸在食品添加剂、饮料工业、制药工业等领域具有广泛的应用。
为了了解柠檬酸的生产工艺及其发酵过程，提高自身的实践能力，我选择了柠檬酸发酵实习项目。
本次实习的主要目的是：1. 学习并掌握柠檬酸的生产工艺流程；2. 了解柠檬酸发酵过程中的微生物及其代谢机制；3. 探讨发酵条件对柠檬酸产量的影响；4. 提高自己在实验室分析和解决问题的能力。
二、实习内容及过程1. 柠檬酸生产工艺流程学习在实习过程中，我首先了解了柠檬酸的生产工艺流程，包括原料准备、菌种选育、发酵、提取、精制等环节。
通过对生产工艺的学习，我对柠檬酸的生产过程有了更深入的认识。
2. 微生物代谢机制研究在发酵过程中，微生物是关键因素。
我学习了柠檬酸发酵过程中所用到的微生物种类，如黑曲霉、青霉等，并了解了它们的代谢机制。
发酵过程中，微生物通过代谢产生柠檬酸，同时还会产生其他代谢产物。
这些代谢产物对柠檬酸产量和品质有一定影响。
3. 发酵条件优化为了提高柠檬酸的产量，我参与了发酵条件的优化研究。
通过调整发酵温度、pH 值、湿度、转速等参数，探讨了不同发酵条件对柠檬酸产量的影响。
实验结果表明，适宜的发酵条件可以显著提高柠檬酸产量。
4. 实验室分析与问题解决在实习过程中，我学会了使用酸度计、折光仪等仪器设备，对柠檬酸溶液进行分析和检测。
同时，针对实验过程中出现的问题，如发酵液污染、柠檬酸提取效率低等，我与导师和同学进行了讨论，并提出了相应的解决措施。
三、实习收获通过本次实习，我全面了解了柠檬酸的生产工艺流程，掌握了柠檬酸发酵过程中的微生物代谢机制，探讨了发酵条件对柠檬酸产量的影响，并提高了自己在实验室分析和解决问题的能力。
本次实习使我认识到，理论知识与实践操作相结合的重要性，为我今后从事相关领域的研究和工作打下了坚实基础。
四、实习总结本次柠檬酸发酵实习使我受益匪浅。
实验三 柠檬酸发酵实验附录
图1 柠檬酸生物合成途径1. 柠檬酸鉴别1．取少量试样，用直火炽灼，即缓慢分解，但不发生焦糖臭。
2．试样溶液用4.3％氢氧化钠溶液调至中性，加硫酸汞溶液加热至沸。
再加1滴0.1N高锰酸钾溶液，振摇，紫色即消退，并产生白色沉淀。
3．试样溶液用4.3％氢氧化钠溶液调至中性，加过量的7.5％氯化钙溶液，冷时无变化，煮沸，即发生白色颗粒状沉淀。
在一部分中加4.3％氢氧化钠溶液，沉淀不溶解，另一部分中加24％盐酸，则溶解。
4．试样溶液用4.3％氢氧化钠溶液调至中性，加过量的0.1N硝酸银溶液，即发生白色沉淀。
白色沉淀能在硝酸或40％氨溶液中溶解。
取氨溶液于试管中，在水浴上加热至60～70℃，管壁不显银镜。
2. 柠檬酸含量测定1、NaOH标准溶液的标定NaOH易吸收水分及空气中的二氧化碳，因此，不能用直接法配制标准溶液。
需要先配成近似的浓度的溶液再标定，标定使用邻苯二甲酸氢钾为基准物进行标定。
以酚酞为指示剂，当滴定终点呈浅红色，半分钟内不退色，反应如下：KHC8H4O4+NaOH=KNaC8H4O4+ H2O2、柠檬酸的测定原理：根据酸碱中和原理，用碱标准溶液滴定试样液中的酸时，以酚酞为指示剂。
当滴定至终点溶液呈浅红色，且30s不褪色时，根据滴定时消耗的标准NaOH溶液的体积，可算出试样中的总酸度。
其反应式为：HOOCCH2C(OH)(COOH)CH2COOH+3NaOH———NaOOCCH2C(OH)(COONa)CH2COONa+3H2 O三、实验用品榨汁机、小刀、碱式滴定管、试剂瓶、锥形瓶、移液管、量筒/烧杯、容量瓶、胶头滴管、洗耳球、洗瓶、水浴锅、铁架台、电子天平、玻璃棒、滤纸、0.1000mol/LNaOH溶液、邻苯二甲酸氢钾、酚酞指示剂、柠檬式样、蒸馏水、四、实验步骤1、0.1000mol/LNaOH标准溶液的配制和标定（1）称取固体NaOH约2.0 g放置在烧杯中，先加入100 mL蒸馏水将其溶解，再转移至试剂瓶中加水稀释至500ml，混匀，待标定。
《柠檬酸发酵机制》课件
厌氧条件
微好氧条件
在微好氧条件下，微生物通过好氧糖 酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸，再 经过一系列生物化学反应生成柠檬酸 。
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途 径将葡萄糖转化为丙酮酸，再经过一 系列生物化学反应生成柠檬酸。
柠檬酸发酵的原理
01
糖酵解途径
在厌氧条件下，微生物通过糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸的过程。
医药行业
用于生产抗生素、解热镇痛药等。
其他领域
如环保、化妆品等。
柠檬酸发酵的发展趋势
高效发酵技术
环保生产
通过优化发酵工艺和提高菌种性能，提高 柠檬酸产率。
减少柠檬酸生产过程中的环境污染，实现 绿色生产。
生物工程技术的应用
市场需求变化
利用基因工程和代谢工程手段，改良菌种 性能，提高发酵效率。
随着人们对健康和环保意识的提高，对天 然、健康的食品添加剂需求增加，柠檬酸 作为天然食品添加剂的市场前景广阔。
实验操作步骤与注意事项
菌种接种与培养
按照规定的操作步骤，将菌种接种到培 养基中，控制好温度、湿度、pH等培 养条件。
取样与检测
在发酵过程中按规定时间间隔取样， 检测柠檬酸含量等指标，记录数据。
发酵罐操作
启动发酵罐，控制好罐内压力、温度 、溶氧等参数，确保发酵过程顺利进 行。
异常情况处理
如发现异常情况，如菌种退化、发酵 异常等，应及时采取措施处理，并记 录实验过程。
营养物质的消耗
随着菌体生长和产物生成，发 酵液中的营养物质如葡萄糖逐 渐被消耗。
代谢产物的积累
在适宜的条件下，柠檬酸等代 谢产物在发酵液中积累。
发酵过程控制的方法和策略
温度控制
保持适宜的发酵温度，有利于菌体生 长和产物生成。
柠檬酸发酵实验
糊化
灭菌
接种
摇瓶培养
五、实验结果与讨论 （一）实验结果 要求记录发酵开始0h、20h、42h和发酵结 束时对照组和实验组的变化. (二)思考题 1、实验中为什么不需要糖化完全？ 2、加入CaCO3在培养基中会怎样？为什么 会出现这种情况 3、经EMP途径合成柠檬酸的特点？ 4、经HMP途径合成柠檬酸的特点？
本实验以玉米淀粉为原料,采用黑曲霉经摇 瓶发酵产生柠檬酸,柠檬酸需进一步分离纯化 得到产品.
三、实验仪器及试剂
试剂：玉米淀粉、黑曲霉孢子悬液、α-淀粉 酶、水 仪器：三角瓶 300ml、玻璃棒、电子秤、摇 床、水浴锅、高压灭菌锅、移液管
四、实验步骤
1、试验流程
保藏菌株 活化菌株 α-淀粉酶 玉米淀粉 72h） 糊化液化 灭菌 孢子悬液 接种 300ml三角瓶摇瓶培养（150r.p.m
发酵工艺学实验——
柠檬酸发酵试验
中国海洋大学 食品科学与工程学院
一、实验目的 1、了解柠檬酸发酵的原理及过程； 2、掌握柠檬酸好气发酵操作；
三、实验原理 柠檬酸有称枸枸橼酸，学名2-羟基丙烷三 羧酸或2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸，是水果 中含量极为丰富的一种有机酸。柠檬酸因无毒 水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉的 优点，被广泛的应用于食品、医药、化工、洗 涤等工业部门。 能够产生柠檬酸的微生物有很多，青霉、 毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些 菌株都能利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬 酸。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发 酵生产柠檬酸
பைடு நூலகம்
2、按下表的顺序进行实验操作
培养基制备
取两个300ml三角瓶标号，各加入30g淀粉和75ml水 ，搅拌均匀，对照组中加入CaCO3 2g. 两三角瓶内各加入0.6g α-淀粉酶 ，混合均匀后置 于75摄氏度的水浴锅内糊化1h. 将糊化后的三角瓶用八层纱布包扎置于灭菌锅内， 121℃下灭菌20min. 在超净工作台上按无菌操作用已灭菌的10ml移液管 移去10ml孢子悬液加入两三角瓶中. 将接完种的三角瓶，在150r.p.m 72h，在培养过程 中注意定期观察菌丝体生长情况并记录实验现象， 当ph达到2时发酵结束.
柠檬酸发酵
用途： 用于香料或作为饮料的酸化剂，在食品和医学上 用作多价螯合剂，也是化学中间体。 柠檬酸与钙离子结合则成可溶性络合物，能缓解 钙离子促使血液凝固的作用，可预防和治疗高血 压和心肌梗死。所以可以起抗凝血作用。 所以柠檬酸钠和草酸钠被称为抗凝血剂。 柠檬酸促进脂肪分解，快速实现减肥。 生产方法 � 提取：植物原料中提取 � 发酵法：进行柠檬酸发酵制得
萃取法： 用溶媒将柠檬酸从发酵滤液中分离出来。 1.含碳氢氧的乙酸乙酯二乙醚甲基异丁酮 2.含磷氧键的磷酸三丁脂 3.含硫氧键的亚砜 4.有机胺
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离子交换和渗析法提取 用弱碱性OH—型701阴离子树脂吸附，用 5％氢氧化铵洗脱，得到柠檬酸铵溶液，然 后通过强酸性H型732树脂交换，柠檬酸 游离出来。
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直接提取法： 适用柠檬酸含量高杂质少的发酵滤液。 过滤清液先用活性炭脱色去除杂质，浓缩 结晶。 用CFCl2- CFCl2抽提蛋白质及其他杂质，将 滤液分离浓缩结晶。 以甲醇沉淀蛋白质，洗涤沉淀回收沉淀后 浓缩结晶。 活性炭将滤液脱色、浓缩再用3倍丙酮沉淀 蛋白质分离回收丙酮然后再浓缩结晶。
生产菌种
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工业生产几乎都是用黑曲霉作为生产菌
大多数微生物在代谢过程中都能合成柠檬酸， 正常生理状况下很少积累柠檬酸。 黑曲霉产酸量高，转化率也高。且能利用多 种碳源，因而是柠檬酸生产的最好菌种。 用石油副产品为原料生产柠檬酸，主要以假丝酵 母属为生产菌种，其次是毕赤酵母、球拟酵母、 汉逊氏酵母和红酵母属的一些种。
液体通风发酵
18 ％的薯干 发酵条件： 培养基为 培养基为18 18％的薯干 0.05 粉，为浓醪发酵，灭菌前加入 粉，为浓醪发酵，灭菌前加入0.05 α—淀粉酶：发酵温度为 ％的 ％的α 12h 前为 1：0．1(v ： 32℃，通风量在 ，通风量在12h 12h前为 前为1 1(v： ，12h 后为 1：0．2，一般发酵周 v) v)， 12h后为 后为1 l12 －120h 。 期为 期为l12 l12－ 120h。
柠檬酸摇瓶发酵实验
实验9-3 柠檬酸摇瓶发酵实验1目的要求掌握柠檬酸摇瓶发酵的方法。
2实验原理目前，柠檬酸的生产都是采用微生物发酵法。
由于所用的菌种、原料和其他生产条件的不同，生产方法也不一样。
工业生产方法主要有深层液体发酵法、浅盘液体法以及固体原料的浅层制曲或厚层通风制曲法。
3实验器材3.1 材料黑曲霉CICC 2206。
3.2 试剂3.2.1 试管斜面培养基4 Be°麦芽汁，1.2 %的营养琼脂，pH自然。
2.2 平皿培养基20 %玉米粉糖化液，0.05 % K2HPO4，0.3 % NH4NO3，0.05 % MgSO4•7H2O，0.0015 % FeSO4•7H2O，0.05 % KCl，1 %～2 %的营养琼脂，pH自然。
3.2.3 摇瓶培养基玉米粉发酵液20 %，K2HPO4 0.05 %，NH4NO3 0.3 %，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4•7H2O 0.0015 %，KCl 0.05 %，1 %～2 %营养琼脂。
以上培养基在接种前均经过121 ℃，20 min灭菌。
3.3 仪器摇床，培养箱，三角瓶等。
4实验步骤（1）斜面试管菌种将单菌落接种在麦芽汁培养基斜面上，35 ℃培养4～5 d。
（2）三角瓶液体摇床培养500 mL三角瓶装50 mL发酵液，接种新鲜斜面两环孢子，351 ℃，235 r/min，摇床培养96 h，并称量上摇床质量M1，下床质量M2。
5实验结果（1）详细记录各个指标的数据。
（2）根据测定的实验数据对整个发酵过程进行分析。
6思考题比较柠檬酸发酵与乳酸发酵的异同。
实验三 柠檬酸发酵实验
实验三柠檬酸发酵实验一、目的要求1.了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分析方法。
2. 通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的接种、培养与发酵产物的分析测定等技术。
二、基本原理CH2—COOH｜1.柠檬酸结构式：HO—C—COOH｜CH2—COOH柠檬酸分子式：C6H8O72. 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3为宜。
用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌（合成途径见图1）。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。
2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2OHOOCCH2C(OH)(COOH)CH2COOH+3NaOH———NaOOCCH2C(OH)(COONa)CH2COONa+3H2O三、实验材料1．菌种黑曲霉斜面菌种。
2．实验器材0.1mol/L标准NaOH；0.1mol/L H2S04；Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2L/L H2S04中)（有毒）；酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广范pH试纸；玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，滴管，天平。
3. 柠檬酸发酵培养基：硫酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS04 ·7H2O 0.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／L NaOH约2滴。
取50ml上述培养液，加入250 mL三角瓶中，包扎灭菌，待用。
黑曲霉发酵柠檬酸
黑曲霉发酵生产柠檬酸（中北）生物技术18083108 陈园园摘要：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。
大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。
黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。
黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤，了解产物提取的几种方法，学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理，掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。
关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸实验材料和试剂：样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处）培养基：查氏培养基、马铃薯培养基无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0.1M NaOH 、0.1M H2SO4 实验器材：无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱实验步骤一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养1.黑曲霉的分离培养①土壤样品的采集用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。
编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。
一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。
②制平板：在融化好的查氏培养基中加入链霉素0.2mL/瓶制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。
③制备土壤稀释液：1. 称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。
2. 另取无菌离心管2支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水。
取10－1的土壤稀释液，吸取0.1mL加入第一只离心管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。
柠檬酸摇瓶发酵及提取byLeMon
分装： 每小组2瓶，每瓶100ml；棉塞或8层纱布；0.08Mpa， 20min
3、制备孢子悬液及接种 （以小组为单位）
向每支斜面菌种加入5ml无菌水，用接种环
刮菌苔表面或用无菌tip头轻轻吹打制备孢子悬
液；将悬液接入灭菌并冷却至室温的培养基。 注： 勿接入过多孢子，否则菌丝过于浓密，影响产 酸和后处理中的过滤
且结晶色泽变深
提取工艺流程
实验器材
1、菌种：黑曲霉 Aspergillus niger
2、培养基： PDA(马铃薯葡萄糖琼脂 )培养基,发酵培养基(土豆 200g 煮 汁、 蔗糖20g、NH4NO3 2g，KCl 0.15g，MgSO4 0.25g，水1000ml；
pH=5 )
3、器材：三角瓶2个，棉塞2个，纱布若干，接种环，小烧杯，水浴加热 锅，离心机，离心管，PH试纸，电子天平，滤纸，大试管, 电炉（加石
酸度测定方法：
取发酵液滤液或离心液1ml，以酚酞为指示剂，用0.1429～ 0.1430mol/L标准NaOH溶液滴定至淡粉红色，所消耗的NaOH 毫升数即为发酵液酸度。
6、柠檬酸提取（部分）
1） 2C6H8O7· H2O + 3CaCO3 → Ca3(C6H5O7)2· 4H2O + 3CO2↑ + H2O
应计算应为106.7%。
总反应式：2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O
实验分工
时间
第一天 第二天
内容 发酵培养基制作、 灭菌、接种
观察菌悬液生长情 况、pH值测定记 录 观察菌悬液生长情 况、pH值测定记 录、补糖 观察菌悬液生长情 况、pH值测定记 录 提取、测定、拍照
分工
全体组员 廖维华、刘露
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实验三柠檬酸发酵实验
一、目的要求
1.了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分析方法。
2. 通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的接种、培养与发酵产物的分析测定等技术。
二、基本原理
CH2—COOH
｜
1.柠檬酸结构式：HO—C—COOH
｜
CH2—COOH
柠檬酸分子式：C6H8O7
2. 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3为宜。
用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌（合成途径见图1）。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。
2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O
HOOCCH2C(OH)(COOH)CH2COOH+3NaOH———NaOOCCH2C(OH)(COONa)CH2COONa+3H2O
三、实验材料
1．菌种黑曲霉斜面菌种。
2．实验器材
0.1mol/L标准NaOH；0.1mol/L H2S04；
Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2L/L H2S04中)（有毒）；
酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广范pH试纸；玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，滴管，天平。
3. 柠檬酸发酵培养基：硫酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS04 ·7H2O 0.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／L NaOH约2滴。
取50ml上述培养液，加入250 mL三角瓶中，包扎灭菌，待用。
四、实验步骤（实验内容）
1．菌种活化：
菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种黑曲霉，移至斜面培养基，经25~28℃斜面培养至孢子长好，作为活化后的种子。
发酵用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养基，得到的培养物作为发酵用的种子。
2. 种子液的制备：取活化好的斜面菌种，无菌操作（不要在无菌室），取5ml无菌水至黑曲霉斜面，用接种环轻轻刮下孢子，轻轻振荡制成孢子悬浮液。
3．发酵：无菌操作（不要在无菌室），取柠檬酸发酵培养基（液）3瓶，吸取3 ml孢子悬浮液接种于柠檬酸发酵培养液中。
摇床转速250 rpm，26~28℃摇床培养5~7d，另1瓶不接种留作对照。
观察发酵过程中pH的变化并记录。
（注意：当pH3左右是积累柠檬酸的最佳时期）
4．发酵液预处理
取发酵液经过滤将3瓶培养液过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后弃去。
5. 发酵产物的检验与分析
定性检验：取过滤液和对照液各约5ml，放入试管内，加Deniges液l mL，在酒精灯上缓缓加热至沸。
逐滴加入20 g/L KMn04溶液，若有柠檬酸存在，则出现白色沉淀。
6．柠檬酸含量的初步测定
酸度滴定法：将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10ml放入150ml三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH滴定酸度。
对照亦按同法滴定。
二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸(g／L)的大约数。
计算公式：C NaOH×(V滴定发酵液-V滴定对照) ×10-3
C柠檬酸= ━━━━━━━━━━━━× 192
3 × 10 ×10-3
式中 C柠檬酸――柠檬酸的浓度(g／L)
C NaOH――NaOH标准溶液浓度(mol／L)
V滴定发酵液――滴定发酵液所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)
V滴定对照――滴定对照所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)
五、实验结果与与讨论
1、影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素有哪些？
2、记录发酵过程产酸变化情况并进行结果分析(pH变化曲线)；
3、柠檬酸定性、定量测定结果与分析，并对菌种产酸能力等进行评定。