锯缘青蟹(Scylla serrata)Hsp70基因cDNA的克隆及序列分析
拟穴青蟹一种含CTLD结构域基因的克隆及表达分析
文章编号：１００４－２４９０（２０２０）０３－０３３２－０９拟穴青蟹一种含ＣＴＬＤ结构域基因的克隆及表达分析 收稿日期：２０１９－０４－１９基金项目：中央级科研院所基本科研业务费（２０１４Ｚ０１）；宁波市科学技术局农业重大科技专项（２０１６Ｃ１１００Ｂ）；上海农委“科技兴农”项目（２０１８ ０２ ０８ ００ ０７ Ｆ０１５５０）作者简介：王 田（１９８９—），女，硕士研究生，主要从事甲壳类生物技术研究。
Ｅ ｍａｉｌ：ｗａｎｇｔｉａｎｈｎ＠１６３．ｃｏｍ通信作者：马春艳，副研究员。
Ｅ ｍａｉｌ：ｍａｃｙ＠ｅｃｓｆ．ａｃ．ｃｎ王 田１，２，赵 明１，２，张凤英１，马凌波１，马春艳１（１．中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 ２０００９０；２．上海海洋大学水产与生命学院，上海 ２０１３０６）摘 要：从拟穴青蟹（ＳｃｙｌｌａＰａｒａｍａｍｏｓａｉｎ）中克隆得到一个含有ＣＴＬＤ（Ｃ ｔｙｐｅｌｅｃｔｉｎ ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎ）结构域的Ｃ型凝集素基因，经分析未发现同源基因，将其命名为ＳｐＣＴＬＤ。
该基因ｃＤＮＡ序列全长为１２３７ｂｐ，包含一个４６８ｂｐ的开放阅读框，编码１５５个氨基酸，预测分子量为１８．３２ｋＤａ，等电点为７．５６。
经一代测序，该基因在第３９０位（Ａ３９０Ｇ）和第１０２０位（Ｔ１０２０Ｃ）含有两个ＳＮＰ位点。
对ＳｐＣＴＬＤ基因在拟穴青蟹幼体不同时期和组织中的表达模式分析发现，ＳｐＣＴＬＤ在幼体的各个发育时期均有表达，其中在蟤状幼体Ⅴ期表达量最高，仔蟹Ⅰ期次之，仔蟹Ⅱ期最低。
对ＳｐＣＴＬＤ的组织分布分析表明，ＳｐＣＴＬＤ在鳃中表达量最高，其次为射精管，在血淋巴、肝胰腺等其他免疫组织中也有表达，其中在鳃和射精管的表达量远高于在其他组织中的表达量。
副溶血弧菌胁迫实验表明，活菌组的肝胰腺、血淋巴、鳃中的ＳｐＣＴＬＤ表达量发生显著上调，且都在１２ｈ达到最高。
根据研究结果，推测ＳｐＣＴＬＤ是一种含ＣＴＬＤ结构域的新基因，它可能参与了拟穴青蟹抗细菌反应。
养殖锯缘青蟹支原体病原的分离与鉴定
养殖锯缘青蟹支原体病原的分离与鉴定2004年入秋以来,浙江省三门县发生了严重的青蟹疾病,死亡率高,造成了极大的经济损失。
据不完全估计,2004年三门县由此造成的经济损失达1.5亿元左右。
至今尚无有效的控制方法。
本文主要针对三门县近年来发生的锯缘青蟹流行疾病开展研究,分离并确定病原,为病害的预防和控制技术研究提供实验依据和理论基础。
本文以浙江省台州市三门县患病养殖锯缘青蟹为研究对象,通过改良Frey培养基对青蟹支原体病原进行分离,利用理化试验和分子生物学研究对分离株进行鉴定,通过分离菌回接健康青蟹确定其致病力,同时利用电镜观察菌株超微结构,得出如下结果：1.本文成功从濒死患病的锯缘青蟹腮、肠组织中分离得到一株支原体,命名为My-1d。
在固体培养基上其菌落形态呈典型的“煎蛋状”。
理化试验初步确定菌株为支原体科。
通过已报道支原体16S rRNA基因序列设计PCR引物并进行扩增、克隆。
基因测序分析后证明分离株属于莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii),模式株为PG-8A(登录号：CP000896.1),同缘性达到99%以上。
2.菌株My-1d负染后,在电镜下观察发现支原体具高度多形态特征,以链珠状、分枝状、球状、双球状等为主,菌体整体形态呈两头大,中间小。
菌株内部切片超微结构观察到支原体无细胞壁,外部为一层原生质膜,胞质染色后类似细颗粒物,内部可见染色较深的核糖体。
3.病原回归感染实验证明该支原体能够使健康锯缘青蟹引起疾病和死亡。
人工感染患病青蟹症状与自然青蟹发病现象相似,通过电镜观察,可在组织电镜切片中观察到与菌株My-1d相似形态的支原体存在。
其中以注射方式感染效果最为显著。
锯缘青蟹一种新的阴离子抗菌肽scygonadin及其基因的分离与鉴定
锯缘青蟹一种新的阴离子抗菌肽scygonadin及其基因的分离与鉴定锯缘青蟹Scylla serrata (Forsk?l,1775)是我国最重要的海水养殖经济蟹类之一。
本论文运用液相色谱技术分离纯化获得一种新抗菌肽,命名为Scygonadin,利用分子生物学技术克隆获得Scygonadin全长基因序列,利用生物信息学的方法阐明其基因结构,运用分子生物学的方法分析该基因在锯缘青蟹体内各组织器官中的转录表达情况等,为阐明锯缘青蟹的先天性免疫及生殖免疫机制奠定基础。
通过研究获得了如下结果:1、分离纯化获得一种新抗菌肽。
以锯缘青蟹的精液为材料,通过酸性溶液萃取,联合利用阳离子交换层析和反相高效液相层析技术进行分离纯化,获得一种单成份,Tricine-SDS-PAGE测定其分子量约为10.8 kDa。
胰蛋白酶裂解该多肽后,用MALDI-ToF-MS法分析了肽指纹图谱。
Edman降解进行数据库法测定其N-端20个氨基序列为H-GQALNKLMPKIVSAIIYMVG-OH,BLAST检索,发现与已知抗菌肽的同源性很低,是一种新的抗菌肽,由于从Scylla serrata的雄性生殖腺中获得,具有抗菌活性,故命名为Scygonadin。
2、克隆获得Scygonadin全长cDNA序列。
利用简并反转录-聚合酶链式反应(Degenerated RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆获得了Scygonadin全长cDNA序列,并登录GenBank数据库,登录号:AY864802。
Scygonadin cDNA全长539 bp (不包括poly A),其中5’非翻译区56 bp、蛋白质编码区381 bp(包括终止密码子TAA)和3’非翻译区102 bp。
3’非翻译区包括保守的信号序列(AATAAA),其后紧接着16个非腺苷酸序列和多聚腺苷酸序列。
推导的全长氨基酸含有126个氨基酸残基,由信号肽(24个氨基酸残基)和成熟肽(102个氨基酸)两部分组成。
拟穴青蟹HSP70基因的克隆与组织表达
拟穴青蟹HSP70基因的克隆与组织表达李文杏;刘元婧;叶海辉;黄辉洋;李少菁【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(050)004【摘要】Heat shock protein 70 (HSP 70) is an in evolutionarily highly conserved protein, with a variety of biological functions. A full-length cDNA of HSP 70 was cloned from Scylla paramamosain using RACE and gene cloning method in this study. The full-length HSP 70 cDNA was 2 189 bp,including a 5'untranslated region (UTR) of 110 bp.a 3'UTR of 126bp,and an open reading frame (ORF) of 1 953 bp nucleotides. The ORF encoded a polypeptide of 650 amino acids with calculated molecular mass of 71. 2 ku and theoretical point of 5. 38. Amino acid sequence alignment showed the S. Paramamosain HSP70 had high homology with that in some model animals. It suggested HSP70 was highly conservative. Phylogenetic tree based on comparison of HSP70 proteins, was consistent with the evolution relationship. The tissue expressions in 8 different tissues were tested by RT-PCR. The results showed that the expected PCR products were amplified from every tested tissues. It suggested that HSP 70 can be constitutively expressed in S. Paramamosain. The highest expression of HSP 70 was found in ovary,the following was in brain,this was possibly related with the functions of HSP 70 .%热休克蛋白70 (HSP70)是一种重要的功能蛋白.利用RACE和基因克隆等分子生物学技术,获得拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)HSP 70全长cDNA序列,全长共2189 bp,包括110 bp的5'UTR(untranslated regions)、126 bp的3'UTR和一个1 953 bp的开放阅读框(ORF).ORF可编码650个氨基酸残基,总分子质量约为71.2 ku,pI为5.38.同源蛋白的比较结果显示,拟穴青蟹HSP70序列与其他一些物种具有很高相似性,推测HSP 70基因具有很高的遗传保守性,而基于HSP70氨基酸序列比对而绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测雌性拟穴青蟹一些组织中的HSP 70表达,结果显示各待测组织中均能扩增得到HSP 70,说明HSP 70在拟穴青蟹为组成型表达.其中,HSP 70在卵巢中表达量最高,其次为脑神经节,推测这与HSP70作为分子伴侣的功能相关.【总页数】6页(P759-764)【作者】李文杏;刘元婧;叶海辉;黄辉洋;李少菁【作者单位】厦门大学海洋与环境学院,福建厦门361005;厦门大学海洋与环境学院,福建厦门361005;厦门大学海洋与环境学院,福建厦门361005;厦门大学海洋与环境学院,福建厦门361005;厦门大学海洋与环境学院,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】Q781【相关文献】1.拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）两种I型高血糖激素基因全长cDNA的克隆及组织表达分析 [J], 舒妙安;张龙韬;周宇芳;胡杭娇;徐宾朋;郭晓令2.拟穴青蟹β-肌动蛋白基因的克隆、组织表达及作为内参的可靠性分析 [J], 徐真;马洪雨;马春艳;冯娜娜;李新苍;李淑娟;蒋伟;马凌波3.拟穴青蟹14-3-3基因全长cDNA的克隆及组织表达分析 [J], 舒妙安;张龙韬;徐宾朋;胡杭娇;郭晓令4.杂交黄颡鱼hsp70基因核心序列的克隆、表达及其在高温应激下的组织表达 [J], 朱凌威;杨世勇;张朝阳;刘钊;李良玉;唐洪;赵仲孟;陈雨薇;武佳韵;黄小丽5.淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异 [J], 刘庆全;罗武松;郑映荷;许耀;高峰;秦志浩;倪雯雯;王金秋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
锯缘青蟹抗菌肽Scygonadin基因的转录表达特性研究
检测 了该 基 因在 锯缘青蟹 幼 体不 同发育 阶段 和成蟹 不
同组织 器官 的表 达 以及 在远洋 梭子 蟹成 蟹 中不 同组 织
器 官中的表达． 研究 将 为 阐 明该 基 因的 表 达特 性 和 本
其 他组 织器 官样 品 ： 剖青 蟹 （ 解 或远 洋梭 子蟹 ） 取
表达 ？这些 问题 有必 要 澄 清． 文采 用 Ｄ ｔｂｏ 方 法 本 ｏ—ｌｔ
以上 引物委 托上 海博 亚生 物技术 有限公 司合成．
１ ３ 实 验 方 法 ．
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血细胞 的分 离 ： 预 先装 有 海 洋抗 凝 剂［ 的一 次 用 ３ ］ 性注 射器 ， 取 等 体 积 的 锯 缘 青 蟹 血 淋 巴液 ， 速 于 吸 迅 ４ ，０ 心 １ ｎ 弃上 清． ℃ ８ ０ｇ离 ５ｍｉ， 沉淀用 海洋 抗凝 剂溶
１ Ｓ ５＿ ８ Ｒ： ｔ ＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡＡＡＣ ＣＴＴＧＴ－ ３； Ｓ Ｉ ５－ Ｆ ：＇ ＣＧＧＡＡＴＴＣ ＧＧＣＣＡＧＧＣＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡ（ ３ ； ’ ． Ｓ ３： ＇ Ｉ Ｒ ５ － ＧＣ ＧＧＣＣ ＣＧ ＡＡ Ｇ Ｌ ＧＡＡＧＣＡ ｄ ℃ＣＡ ℃Ｃ 一 Ｇ１ Ｔ ３．
幼 体 和大 眼 幼 体 ） 成 体 锯 缘 青 蟹 （ 性 和雌 性 ） 鳃 、 和 雄 的 甲壳 、 、 细 胞 、 胰 脏 、 脏 、 肉 、 眼 血 肝 心 肌 甲壳 下 皮 层 、 胃和 生 殖 系 统 等 １ 个 不 同组 织 器 官 中的 转 录 表 达 情 况 ． 果 显 示 ， Ｏ 结 该基 因仅 在 雄 性 生 殖 系 统 中 转 录 表 达 ． 一 步 分 析 该 基 因 在 性 成 熟 进 雄 性锯 缘 青 蟹 和远 洋 梭子 蟹 生 殖 系 统 中不 同部 位 （ 巢 、 精 管 、 精 囊 和 射 精 管 ） 精 输 贮 的转 录 表 达 情 况 ， 果 显 示 ，ｃｇ ｎ・ 结 Ｓ ｙ ｏａ ｄ ｉ 因 主要 在性 成 熟 锯 缘 青 蟹 的射 精 管 中转 录表 达 ． ｎ基
锯缘青蟹血淋巴和血蓝蛋白免疫活性研究
锯缘青蟹血淋巴和血蓝蛋白免疫活性研究锯缘青蟹是我国沿海名贵重要的经济蟹类品种。
随着蟹类人工养殖的迅速发展,病害给养殖业带来了巨大损失。
因此,对锯缘青蟹病害的综合防治的研究和探索,特别是其有关免疫学特性的研究,寻找与抗菌、抗病有关的防御因子将有助于了解蟹类的免疫机理,对于控制蟹类疾病具有重要价值。
本课题采用1-DE蛋白质组学技术对锯缘青蟹感染副溶血弧菌后,血淋巴、肝胰腺、肌肉等多种组织中蛋白表达的差异进行比较,鉴定到血蓝蛋白、cryptocyanin等免疫相关蛋白。
并在此基础上,对血淋巴和血蓝蛋白在血细胞凝集、细菌凝集以及抑制细菌中的作用进行比较系统的研究,探讨了血蓝蛋白的免疫活性问题。
实验结果显示,锯缘青蟹感染副溶血弧菌后,血淋巴中出现1条明显差异蛋白条带(命名为SP),鉴定为cryptocyanin。
此外,我们还鉴定出ion transport-like peptide、actin和bacteria responsive protein 2等三种分别存在于锯缘青蟹肌肉和肝胰腺中可能参与防御作用的蛋白。
通过对锯缘青蟹血淋巴和肝胰腺蛋白样品的1-DE及1-D immunoblot分析后发现,相对分子质量为75kDa的蛋白条带均能与兔抗血蓝蛋白特异性结合,说明此蛋白确实是锯缘青蟹的血蓝蛋白。
其后,在对锯缘青蟹感染副溶血弧菌后0-36 hr的血淋巴中血蓝蛋白浓度的分析中发现,血蓝蛋白浓度出现先逐渐减少后上升,然后再恢复至正常水平的变化。
由此说明,血蓝蛋白确实是锯缘青蟹体内的一个重要的免疫效应因子。
在此基础上,为了进一步探讨血蓝蛋白的免疫活性问题,我们分别进行了凝集实验和体外抑菌实验。
凝集实验结果表明锯缘青蟹血淋巴和血蓝蛋白对细菌和脊椎动物红细胞均具有一定凝集作用,表现出明显的凝集活性。
实验还发现大肠杆菌K12的FadL、YbjP、OmpG、Tsx、OmpF和NlpB等六种外膜蛋白能与血蓝蛋白特异性结合。
锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究
锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病,随着社会进步和全球化进程的不断发展,食物过敏的发病率越来越高,成为全球关注的食品安全问题。
食物过敏主要由食物中蛋白质引起,主要症状有哮喘、荨麻疹等,严重的甚至会危及到生命。
水产品是最常见的过敏食物,水产食品中原肌球蛋白、小清蛋白等作为主要过敏原已得到国内外学者的广泛研究,而对于精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)是否为过敏原,其理化特性及致敏性如何,仍有待于进一步的研究证实。
锯缘青蟹(Scylla serrata)肉质鲜美,营养丰富,是我国蟹类增养殖的重要对象,深受我国消费者喜爱,同时其远销日本、东南亚等国家,也是全球的主要经济蟹类。
本研究以国内产量丰富的锯缘青蟹为研究对象,从分离纯化、抗体制备、分子克隆、原核表达、过敏原性等方面对精氨酸激酶进行了研究。
首先采用70-90 %硫酸铵沉淀及HiTrap Q亲和层析方法,从锯缘青蟹肌浆蛋白中分离得到分子量为40 kDa的天然蛋白(nAK),SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)及2D-PAGE(Two dimensional-PAGE,2D-PAGE)分析结果显示该蛋白的分子量为40 kDa、等电点为6.5,这与虾类精氨酸激酶Pen m 2性质相近。
兔抗白虾精氨酸激酶IgG抗体及兔抗锯缘青蟹精氨酸激酶IgG抗体的Western-blot结果表明纯化的锯缘青蟹40kDa蛋白为精氨酸激酶。
通过分子生物学技术方法,克隆得到锯缘青蟹精氨酸激酶开放阅读框基因序列。
测序结果显示,该开放阅读框基因的序列长度为1071 bp,编码356个氨基酸残基,该序列登录Genbank(GQ:851626)。
序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)精氨酸激酶基因的序列同源性高达94 %,与岸蟹(Carcinus maenas)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等甲壳类动物的精氨酸激酶也有较高的同源性(均>90 %)。
锯缘青蟹阴离子抗菌肽SCY2基因克隆、表达特性及其抗菌活性的研究
锯缘青蟹阴离子抗菌肽SCY2基因克隆、表达特性及其抗菌活性的研究本研究根据实验室获得的SCY2部分cDNA序列,设计特异性引物,以雄性锯缘青蟹的性腺组织RNA为模板,利用RT—PCR及5’,3’-RACE等方法,克隆获得了抗菌肽SCY2的全长cDNA序列947bp,编码100个氨基酸,预测分子量约为10925.4Da,等电点PI为4.84,与已发表的锯缘青蟹抗菌肽Scygonadin基因的氨基酸序列相似性为65.08%,因而认为SCY2是在锯缘青蟹中发现的又一个新的阴离子抗菌肽。
主要结果如下:采用PCR及反向PCR等方法,对基因组DNA及其侧翼序列进行扩增,获得了SCY2基因组DNA的全长序列,该基因组全长为2607bp,包含3个外显子和2个内含子。
与Scygonadin具有相似的基因结构组成;获得了SCY2基因的上下游侧翼序列,5’上游序列含有转录起始位点以及TATA box等启动子所具有的特征序列。
用RT-PCR和Northern-blot等方法,分别检测了SCY2基因在锯缘青蟹(雄性和雌性)不同组织器官(鳃、甲壳、眼、血细胞、肝胰脏、心脏、肌肉、甲壳下皮层、胃和生殖系统等)中的转录表达情况,发现该基因仅在雄性生殖系统中表达。
该表达特性与Scygonadin相似。
检测细菌感染条件下锯缘青蟹各组织SCY2及Scygonadin表达情况,发现在感染后48 h内,SCY2和Scygonadin mRNA在性腺组织中的表达水平均无明显变化,说明外部细菌感染不是SCY2的直接诱导表达因素。
为确定SCY2的抗菌功能,根据SCY2编码序列,构建了pTrc-CKS/SCY2融合基因表达载体。
将表达载体质粒转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,通过变性复性后获得融合蛋白SCY2-CKS。
利用金属鏊合层析纯化获得SCY2融合蛋白,并以3C蛋白酶酶切获得重组表达的SCY2。
用0.4mg/ml重组SCY2在11种海洋动物病原菌和耐药性细菌进行抗菌活性检测(细菌杀伤指数(KI)),结果显示:SCY2能够选择性的抑制革兰氏阴性菌和阳性菌的生长,对水产动物病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophia A.h)有显著的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌,溶壁微球菌,谷棒杆菌等也具有较强的抑菌作用。
锯缘青蟹(scyllaserrata)孵化
锯缘青蟹(scylla serrata) 孵化
亲蟹产卵后的培育过程也是卵子孵化过程，但这里的孵化是指人工育苗过程中幼体破膜而出的生产环节。
刚产出的卵呈黄色，卵径在280-320微米，随着胚胎的发育，卵子的颜色由桔黄色变成青褐色，最后变为深紫色，卵径达到360-400微米，卵内搏动达到200-240次/分钟时，将在1-2天后孵出。
将要孵出时，亲蟹会浮向水面，在池四周游动，并将头部朝下游泳足快速划动并用步足不断地分散开刚孵出的蚤状幼体。
由于亲蟹产卵、抱卵的时间不完全同步，因此幼体孵出时间也不同步。
生产中最好将快要孵化的亲蟹单独挑选到专用孵化池、孵化槽或孵化桶里孵化，这样孵出的幼体不会因期别相差过大而到了大眼幼体期互相残食。
孵化时，要专人守护，待蚤状幼体全部孵出后，及时捞出亲蟹，统计幼体数量，以便调整幼体的密度，可利用蚤状幼体的趋光性用抄网捞或用虹吸江将幼体分到其他池中培育。
孵化时，充气量适当加大，水温25℃左右，盐度0.030左右。
幼体分池时，各池水温、盐度必须保持一致。
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拟穴青蟹线粒体COI基因序列克隆及SNPs位点分析
拟穴青蟹线粒体COI基因序列克隆及SNPs位点分析马群群;马洪雨;马春艳;崔海玉;马凌波【摘要】根据拟穴青蟹(Scylla paramamosain)线粒体全序列设计引物,采用PCR 产物双向测序法,克隆了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因部分序列(761 bp),并筛选、分析了拟穴青蟹的SNPs位点.共分析了采自福建省宁德市的16只拟穴青蟹,另外,从GenBank数据库中下载了31条前人提交的拟穴青蟹COI基因序列(长度在425-522 bp之间).利用MEGA 4.0软件对所有序列进行比对分析,结果表明碱基T、C、A和G的平均含量分别为37.6％、17.8％、28.9％和15.7％,G+C的含量平均为33.5％.分析结果表明,在所克隆的761bp的COI基因序列中共发现29个SNPs位点,其出现频率为3.8％.在这29个SNPs位点中,13个为C/T转换(占44.8％),12个为A/G转换(占41.4％),2个为A/T颠换(占6.90％),1个为G/C颠换(占3.45％),另有一个位点(201 bp处)发生了A/C颠换和C/T转换两种类型的碱基替换.氨基酸分析表明,在29个SNPs位点中,有9个位点属于非同义突变,引起了氨基酸的变化；其他20个位点属于同义突变,未引起氨基酸的变化.这将为拟穴青蟹遗传背景和群体遗传多样性研究提供新的分子标记.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)007【总页数】6页(P111-116)【关键词】拟穴青蟹;COI基因;SNPs;聚合酶链式反应【作者】马群群;马洪雨;马春艳;崔海玉;马凌波【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海200090;上海海洋大学水产与生命学院，上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海200090;上海海洋大学水产与生命学院，上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室，上海200090【正文语种】中文拟穴青蟹(Scylla paramamosain)隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，广泛分布于我国东南沿海，包括浙江、福建、台湾、广东、广西和海南沿岸水域，是我国青蟹的优势种，具有较高的经济价值和营养价值。
锯缘青蟹Scylla serrata (Forsk(？)l)大眼幼体和第Ⅰ期仔蟹的行为生态研究
锯缘青蟹Scylla serrata （Forsk（？）l）大眼幼体和第Ⅰ期仔蟹的行为生态研究本研究从行为生态学角度,结合生产实际,采用实验生态方法系统地探讨了锯缘青蟹(Scylla serrata,Forsk?l 1775)大眼幼体和第Ⅰ期仔蟹的生境选择、摄食行为和争斗-相残行为等,研究成果丰富了甲壳动物学的基础资料,并为解决生产实践中的问题提出了新的见解。
主要结果如下:1.锯缘青蟹大眼幼体和第Ⅰ期仔蟹的生境选择1.1大眼幼体和仔蟹的底质、照度和隐蔽物选择性实验结果表明,大眼幼体和仔蟹对海泥和泥沙底质的选择性显著高于各种粒径的沙底(粗砂0.2～2mm,中等砂60～200μm,细沙<60μm),原因可能与海泥和泥沙底质在流动海水中物理稳定性高于沙砾有关。
大眼幼体选择的照度高于仔蟹,明适应、暗适应(游动)和暗适应(静息)3种条件下照度选择高于1,000 lux的大眼幼体比例分别为52.3、54.4和47.5%,照度选择低于500 lux仔蟹比例分别为68.8、52.1和58.6%,显示仔蟹对低照度环境比大眼幼体更为适应。
大眼幼体和仔蟹对隐蔽物材质没有明显的选择性,但对隐蔽物结构(构型和规格)选择性非常明显。
在本实验使用的3种构型×3种规格的隐蔽物中,大眼幼体和仔蟹对5mm草丛型隐蔽物选择性最高,分别达30.92和25.9%。
1.2通过对大眼幼体和仔蟹栖息在底质表面和埋栖的频度予以分别统计,以埋栖选择性和相对埋栖率为指标考察了大眼幼体和仔蟹的栖息方式,发现白昼大眼幼体栖息在底质上的比例,特别是埋栖在底质中个体的比例显著高于仔蟹,也高于夜间;夜间大眼幼体栖息方式与仔蟹差别不明显。
揭示出大眼幼体栖息方式的昼夜差异和昼夜节律性。
首次发现锯缘青蟹大眼幼体对底质的选择性、在底质上栖息的方式和对光照的反应表现出适应FTT机制的特点。
1.3与泥沙、砂和无底质条件比较,海泥底质可缩短大眼幼体的蜕皮时间(TTM)约6.45～7.9hr.。
锯缘青蟹副溶血性孤菌分离鉴定及抗TLH单克隆抗体的制备
锯缘青蟹副溶血性孤菌分离鉴定及抗TLH单克隆抗体的制备锯缘青蟹(Scylla serrata)为十足目,短尾次目,梭子蟹科,青蟹属,是我国重要的食用蟹。
近年来,我国的东南沿海海域发生严重病害,造成锯缘青蟹的大量死亡,使我国的水产养殖业蒙受巨大的经济损失。
副溶血性弧菌是主要致病菌之一。
本试验从病蟹中通过划线培养,挑取优势菌落,经青蟹攻毒感染试验,分离出一株致病菌S,并通过菌落形态、生理生化特征等方面,初步将S菌鉴定为副溶血性弧菌。
从该菌中克隆不耐热性溶血毒素基因(tlh基因),并将含有tlh基因的
pET32a(+)质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),在LB培养基中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出TLH蛋白。
以纯化的TLH免疫小白鼠,经过间接ELISA 法检测血清的效价,通过细胞融合方法获得了一株能稳定分泌抗TLH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为:CH-112。
锯缘青蟹Scylla serrata(Forsk(？)l)胚胎发育的基础研究
锯缘青蟹Scylla serrata（Forsk（？）l）胚胎发育的基础研究锯缘青蟹Scylla serrata(Forsk?l,1775)是我国重要的养殖经济蟹类,胚胎发育在个体发生中处于重要地位。
本实验采用组织学、光学显微镜、电子显微镜观察以及离体培养等技术与方法,对锯缘青蟹胚胎发育过程进行了系统的研究,主要结果如下:1锯缘青蟹排卵大多发生在晚12:00前后,成熟卵子入水后,无论受精与否,最外层卵黄膜都会举起形成壳膜,随即壳膜形态结构和性质发生变化,其外层膜不连续的地方形成微孔,而内层膜去致密化的絮状粘稠物形成粘胶,粘胶通过微孔渗出到卵子表面,壳膜变得富有粘性、延展性和可塑性。
在亲体腹肢不断摆动和水流的作用下,壳膜或其上的皱褶相互接触或接触到刚毛上而分别形成卵索和卵柄,卵索和卵柄与壳膜是连续一体的,并逐渐固化变得坚硬和韧性,最终卵子通过卵索和卵柄而牢固附着在亲体的腹部。
本实验首次在十足目甲壳动物卵子中发现微孔和粘胶,证实了卵子粘性来自于卵子本身;从而提出卵子附着的壳膜粘连固化的学说。
2锯缘青蟹精子入卵后,发生皮层反应而形成受精膜。
皮层反应包括致密颗粒首先胞吐以及环形颗粒(Rg)的相继多轮胞吐。
每轮Rg的胞吐可以分为受精膜(Fm)的平缓期、形成期和举起期三个阶段。
Rg的形成与卵黄颗粒和脂滴以及线粒体密切相关。
本实验首次提出线粒体的形态、数量及分布可以很好反映Fm形成的不同阶段,并在国内首次报道Rg的发生以及其胞吐的全过程。
3锯缘青蟹成熟卵子为初级卵母细胞,核相处于第一次成熟分裂的中期。
在卵子产出30min内第一极体排出并分裂成两个小极体;第二极体随着Fm的形成和举起而排放,在卵子产出后50-60min内排出;第一,二极体分别位于Fm 的内外两侧。
雄性原核形成早于雌性原核;雌雄原核形成后向卵子中央移动,最后发生联合形成联合核。
排卵后的6-8hr内,合子核才开始第一次核分裂。
锯缘青蟹为数精入卵,单精受精。
锯缘青蟹碱性磷酸酶分离纯化及部分理化性质研究
锯缘青蟹碱性磷酸酶分离纯化及部分理化性质研究
陈清西;张喆;庄总来;陈祥仁
【期刊名称】《海洋与湖沼》
【年(卷),期】1998(29)4
【摘要】于１９９５年２月在厦门海域采集锯缘青蟹，取其内脏经正丁醇抽提，硫酸铵分级分离ＤＥＡＥ－５２离子交换柱层析及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００凝胶过滤柱层析纯化，获得碱性磷酸酶制剂，以快速蛋白液相色谱及聚丙烯酰胺凝胶电泳检验萁纯度，获得单一蛋白纯的酶制剂。
【总页数】1页(P362)
【作者】陈清西;张喆;庄总来;陈祥仁
【作者单位】厦门大学生物系
【正文语种】中文
【中图分类】TQ464.8
【相关文献】
1.锯缘青蟹(Scylla serrata)凝集素的分布及部分性质研究 [J], 戴聪杰;王桂忠;何剑锋;李少菁
2.钒酸盐和脲对锯缘青蟹碱性磷酸酶的抑制作用 [J], 周兴旺;史渊源;刘晓丹;陈忠;陈清西
3.乙醇对锯缘青蟹碱性磷酸酶活力与构象的影响 [J], 郑文竹;黄璜;刘晓丹;史渊源;陈清西
4.关于锯缘青蟹的人工养殖技术之一锯缘青蟹人工苗的中间培育技术 [J], 丁理法;
周友富;周素琴;程岩雄;李利卫;李海伟
5.关于锯缘青蟹的人工养殖技术之二锯缘青蟹人工养殖技术 [J], 周素琴;张小冬;丁理法;程岩雄;周友富;颜正荣;陈海伟;李利卫
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分 析发 现２个 Ｈ ｐ ０ ｓ７ 家族 的签名 序列 ：ＩＤ Ｇ Ｇ Ｆ Ｖ Ｉ ，Ｉ Ｌ Ｇ Ｓ ＲＰ Ｏ Ｆ Ｌ Ｇ Ｔ Ｄ ＳＬ ｖ ｖ Ｇ Ｔ ＩⅪ Ｋ；Ｄ ａ特 征 基序Ｄ Ｇ Ｔ ＳＶ；非 细胞器 ｎｋ Ｌ Ｔ ．．
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第２ ７卷
第 １ 期
生
态
科
学
２ （）２ —０ ７ １：４３
Ｆｅ ． ２ ｏ ｂ ０８
２０ ０ ８年 ２月
Ｅｃ ｏ ｉａ Ｓ ｉ ｎ ｅ ｏｌ ｇ ｃ ｌ ｃｅ ｃ
锯缘 青蟹 （ ｃ ｌ ｅｒｔ）Ｈ ｐ ０ ￣ｃ Ｎ ｌ 克隆 Ｓ ｙｌ ｓ ｒ ａ ｓ ７ 基 ａ ａ Ｄ Ａｆ Ｃ Ｊ 及序 列分 析
袁嘉恩，许忠能，韩博平 ，孔义军，雷腊梅 ，谢数涛
暨南大 学水 生生物研 究所 ，广 州 ５０３ １６ ２ 【 摘要 】 采 用Ｒ ．Ｃ 及 Ｒ Ｃ 技术 克 隆锯缘 青蟹 （ｃｌ ｒ ｔ）的热休 克蛋 ＩＨ ｐ ０ 因并进 行序列 分 析 。克 隆测序 ＴＰ Ｒ Ａ Ｅ Ｓｙｌ ｓ ｒ ａ ａｅａ ￣ ｓ７ 基 ｔ 后 拼接 得 到一条 长２ ８ ｐ Ｄ Ａ ４２ 的ｃ Ｎ 序列 ，该序 列Ｏ Ｆ （ ｐｎｒ ｄｎ ａ ，开放 阅 读框 ）为 １５ ｐ ｂ Ｒ Ｏ ｅ ａｉｇ ｒ ｅ ｆ ｍｅ ９ ０ ，编码６ ９ 个氨 基酸 ， ｂ ４
缘青蟹 的抗逆 机理 及其 遗传 改 良奠 定 了基础 。
关 键词 ：Ｈ ｐ ０ 因；Ｒ Ｃ ；Ｒ －Ｃ ；锯 缘青蟹 ｓ７ 基 Ａ Ｅ ＴＰ Ｒ 中图分类 号 ：Ｑ １． ９ ． ９ ５ １＋６ ８ 文 献标识 码 ：Ａ 文章编 号 ：１０ —８３２０ ）１ ４０ ０ ８８７ （０８０． ．７ ２
基序 ：ＲＡ Ｆ Ｅ ；核 定位信 号标 签 ： ０ Ｐ Ｅ ｌ ＡＬ Ｊ ； 质Ｈｓ ７ 特 征基 序Ｅ ＶＤ。同源 性 分析 表 明，锯缘 青蟹 Ｈｓ７ ＲＥＬ ｌ Ｓ Ｓ Ｒ 胞 ｐ０ Ｅ ｐ０
编 码 区核 苷 酸 序 列 与 凡 纳滨 对 虾 （ ｉｐ ｎｅｓｖｎａ ｅ） 、斑 节 对 虾 （Ｐ ｎ ｅｓｍ ｎｄ ｎ、 罗 氏 沼虾 （ ｃ ｂａｈ ｍ Ｌｔ ｅａｕ ａｎ ｍ ｉ ｏ ｅａｕ ｏ ｏｏ ） Ｍａｒ ｒｃｉ ｏ ｕ ｒｓｎ ｅ ｉ的相似 性分 别 为８． ｏｅｂｒ ｉ ｇ） ４ ２％、８ ． ０ ３ ７％和 ７． ８ ９ ０％：核 苷酸 序列 所推 导 出的Ｈ ｐ０ 基酸序 列 ． 凡纳滨 对虾 、斑 节 ６ ｓ７ 氨 与 对虾和 罗 氏沼虾 的相似 性 分别 为９ ． ２ ９％、９ ． ％和９ ． ％。本研 究 克隆 了锯 缘青蟹 Ｈ ｐ ０基 因 ，为进 一步 深入 研 究锯 ７ ２１ ７ ６７ ４ ｓ７
ｏ ｔｉ ｅ ４ ２ｂ ｃ ｎ ｉｉ ｇａ ｂ ａ ｎ ｄ ２ ８ ， ｏ ｔ ｎ ｎ ＯＲＦ ｏ ９ ０ ｂ ， ｎ ｏ ｉ ｇ ６ ９ ａ ｉ ｏ ａ ｉ ｅ ｉ ｕ ｓ ｗｉ ｓｉ ａ ｅ ｏ ｅ ｕ ａ ｉ ｈ ｆ７１０ Ｄ ａ ｎ ｆ１ ５ ｐ ｅ ｃ ｄ ｎ ４ ｍ ｎ ｃ ｄ ｒ ｓｄ ｅ ｔ ｅ ｔ ｈ ｍ ｔ ｄ ｍ ｌ ｃ ｌ ｒｗｅ ｇ ｔ ．６ ｋ ｏ ｎ ｏ ｅｉ ｌ ｉｏ ｌ ｃｒｃ ｐ ｉ ｔ ｏ ．４ ’ Ｒ ｆ １ ８ ｂ ，ａ ５’ ａ ｄ ｔ ｅ ｒ ｔ ａ ｓ ｅ ｅ ｔｉ ｏ ｎ ｆ ５２ ，ａ ３ ＵＴ ｏ ５ ｐ ＵＴＲ ｆ ４ ｐ ｈ ｃ ｏｕ ｅ ｎ ｌ ｓ ｆ ａ ｈ ｐ ｏ ，ｔ ｉ ｎ ｔ ｒ ｈ ｎ
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