利用gfp报告基因优化农杆菌介导的水稻遗传转化

利用gfp报告基因优化农杆菌介导的水稻遗传转化

唐甜甜;李浩;段永波;李莉;陆徐忠;梁永亚;杨剑波

【摘要】To improve the Agrobacterium-mediated transformation frequency of Japonica rice Wanjing 97, an orthogonal experiment L9 (33 ) was designed to optimize the factors regulating rice genetic transformation, and the impacts of innoculum OD600 , coculture temperature and coculture duration on transformation using gfp gene to monitor the expression of target gene were analyzed. Results showed that the optimal conditions for Agrobacterium-mediated transformation of Wanjing 97 were determined to be innoculum OD660 of 0. 1, cocultured at 21℃ -23 t dark for 72 h. Under this condition, the rate of gfp-positive calli was up to 70. 9% . The results suggested that gfp could be used as an effective reporter gene to improve rice genetic transformation.%为提高农杆菌介导的水稻遗传转化效率,以晚粳97为转化材料,绿色荧光蛋白gfp基因为报告基因,采用正交试验L9(33)对影响农杆菌介导水稻的遗传转化因子进行优化.通过观察愈伤组织荧光表达情况,分析菌液浓度、共培养温度与共培养时间对农杆菌转化水稻的影响.结果表明,在OD660值为0.1、共培养21℃～23℃黑暗条件下,农杆菌与水稻愈伤共培养72 h,最有利于水稻的遗传转化,该条件下晚粳97 愈伤组织荧光表达率达到70.9%.

【期刊名称】《生物学杂志》

【年(卷),期】2012(029)001

【总页数】4页(P88-91)

【关键词】水稻;农杆菌;愈伤组织;绿色荧光蛋白基因;遗传转化

【作者】唐甜甜;李浩;段永波;李莉;陆徐忠;梁永亚;杨剑波

【作者单位】安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031;安徽省农业科学院水稻研究所,合肥,230031

【正文语种】中文

【中图分类】S511;Q943.2

水稻作为重要的粮食作物和遗传学研究的模式植物，其遗传改良一直受到人们的高度重视。转基因技术是实现水稻品种定向改良的重要手段。自1988年Zhang等［1］转化水稻原生质体获得成功以来，水稻转基因技术不断发展。Hiei等［2］建立了农杆菌介导的水稻遗传转化体系，使水稻转基因技术更加趋于成熟和完善。目前，农杆菌介导的转基因已作为水稻遗传转化的主要方法被广泛地应用到水稻的遗传研究和性状改良的实践中［3－9］。

在植物遗传转化过程中，通常采用报告基因来监测转化效率、跟踪外源基因在植物细胞中的表达情况。目前使用的报告基因主要有荧光素酶基因(luc)［10］和β-葡萄糖苷酶基因(gus)［11］两类。检测LUC表达时需要向试验材料内渗入荧光素;GUS组织化学检测时，需要昂贵的反应底物4－甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸(X-Gluc);另外，这两种检测方法对植物材料都有破坏性，因此，在活体中的检

测受到一定的限制，难以做到实时动态追踪［12］。克隆于海洋动物水母体内的

绿色荧光基因(gfp)是一种检测方便、适于活体观察、又不需要外源底物或辅助因

子的报告基因。Shimomure等［13］首先从多管水母中分离出荧光蛋白，Prasher等［14］成功地克隆了gfp基因，随后的研究指出:由于GFP含有特殊的六肽生色基团，可以在长波紫外灯下发出荧光，便于活体检测和显微观察。gfp作为报告基因用于植物的遗传转化研究更是方兴未艾［15－17］。

本研究利用gfp作为报告基因，用农杆菌介导法对水稻品种晚粳97的成熟胚愈伤组织进行转化实验。探索农杆菌菌液浓度、共培养温度与共培养时间等对水稻遗传转化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

粳型水稻品种晚粳97种子由安徽省农业科学院水稻研究所繁殖并保存。用于组织培养及主要生化试剂购自Sigma公司。

1.2 质粒与菌株

植物转化载体p35S∶∶bar-pUbi∶∶gfp-pRact1∶∶pmi由先正达生物科技(中国)有限责任公司惠赠。农杆菌菌株为EHA105。

表1 水稻转化过程中所用的培养配方Table 1 Media and their compositions

for rice transformation培养基成分(mg/L)诱导培养基 NB(N6 macro，B5 micro，B5 vitamins)+CH 300+Pro 500+Gln 500+2，4－D 2.0+sucrose

3%+agar 0.8%，pH值5.8悬浮培养基 NB+2，4－D 2.0+As 39.6+CH

300+sucrose3%，pH值5.2共培养基 NB+2，4－D 2.0+CH 300+Pro

500+Gln 500+As 39.6+sucrose 3%+agar 0.8%，pH值5.8恢复培养基 NB+2，4－D 2.0+CH300+pro500+Gln 500+sucrose 3%+ agar

0.8%+Carb250+Cefo200+KT1，pH值5.8筛选培养基 NB+CH3 00+Pro