基于载体的RNA干扰技术

Biochemical and Biophysical Research Communications《生物化学与生物物理学研究通讯》

题目：

基于载体的RNA干扰导致转基因斑马鱼中肌肉生长抑制素基因抑制从而引起双肌效果

摘要：

肌肉生长抑制素属于转化生长因子（TGF）-β超家族，对骨骼肌的形成和增长具有很强的负调节作用。我们利用显微注射反义RNA的表达载体，构建了一个肌肉生长抑制素基因抑制而产生双肌表型并且能遗传稳定的斑马鱼品种。实时PCR和免疫染色显示，在纯合的转基因斑马鱼中肌肉生长抑制素mRNA和蛋白水平分别是非转基因对照的33％和26％。此外，肌肉生长抑制素抑制的转基因鱼MyoD、肌细胞生成素、Mrf4和Myf5这类生肌调节因子的mRNA水平相比于非转基因对照有显著的升高。虽然在体长上没有显著的差异，但纯合的转基因斑马鱼比非转基因对照重45％。组织化学分析表明，纯合转基因鱼的肌纤维的横截面积是非转基因对照的两倍。这是第一个能稳定遗传的肌肉生长抑制素抑制基因型以及双肌表型的斑马鱼模型。

关键词：

肌肉生长抑制素

斑马鱼

RNA干扰

前言：

McPherron和Lee在Belgian Blue和Piedmontese 这两种牛中发现了对肌肉的生长具有负调节作用的肌肉生长抑制素。作为肌肉生长的调节物质，肌肉生长抑制素一般在骨骼肌中表达，是属于转化生长因子（TGF）-β超家族，拥有该超家族所有共同的结构组分。在许多种牛和小鼠中，肌肉生长抑制素的基因突变会导致“双肌”现象。此外，在猪和鸡中也观测到类似的肌肉生长抑制素的表达模式。

在成年哺乳动物中，肌肉生成抑制素主要是在该物质的靶组织——骨骼肌中表达。然而，随后在研究中发现肌肉生长抑制素在乳腺、心脏、脾、脑中也有较低水平的表达，它会影响心肌的生长以及脂肪细胞的分化。由于在子宫内进行研究比较困难，因此肌肉生长抑制素在哺乳动物胚胎发育时的表达模式大多仍不清楚。在大鼠胚胎发育早期，肌肉生长抑制素只在体节中表达；而在胚胎发育后期，肌肉生长抑制素的表达始终伴随着肌肉的生长。

肌肉生长抑制素在鱼类中不仅抑制骨骼肌生长，在维持组织稳态增长、渗透压调节以及生殖组织的功能上也起着重要作用。相比于哺乳动物，人们在在不同品种的鱼类的胚胎发育过程中，进行了许多定性和定量实验来研究肌肉生长抑制素的表达情况。在斑马鱼中，发现了两种形式的肌肉生长抑制素（Ⅰ和Ⅱ）的基因。肌肉生长抑制素Ⅰ的信使（m）RNA是母性遗传的，在受精后48小时的胚胎中表达量达到最高；而肌肉生长抑制素Ⅱ在受精后13小时，也就是8-体节阶段才能检测到。对组织表达谱研究发现，肌肉生长抑制素Ⅰ基因广泛表达于肌肉，大脑，眼睛，肾脏，睾丸，卵巢，消化道和心脏中，但肌肉生长抑制素Ⅱ的基因表达谱则比较有限，大都局限于大脑。只有肌肉生长抑制素Ⅰ的基因表达是在生长发育过程中是动态调节的，而肌肉生长抑制素Ⅱ基因的表达在生长发育的大多数情况下是不变的。

肌肉生长抑制素的功能是对骨骼肌生长进行负调节。通过同源基因靶向的方法培育的小鼠骨骼肌明显比野生型（WT）小鼠的要大，由于细胞数量（增生性增长）和细胞大小（肥厚性增长）的增长，肌肉生长速率比野生型小鼠大2到3倍以上的。在哺乳动物中，RNA干扰（RNAi）技术通常用来获得肌肉生长抑制素基因抑制的动物。在鱼类中，有一些研究肌肉生长抑制素消除的斑马鱼的报告。Amali等人通过对发育早期的胚胎显微注射反义寡核苷酸发现体节的数量和大小在这一发育期有所增加。他们还发现，与肌肉生长相关的肌肉转录

调节因子（MyoD）和肌细胞生成素（myogenin）基因转录的上调。Xu等人发现能过度表达对肌肉生长抑制素具有显性失活作用的前导肽的转基因斑马鱼中，肌肉细胞数量仅略有增加，而且仅在雌鱼中。Acosta 等人通过显微注射罗非鱼肌肉生长抑制素的双链（ds）RNA到斑马鱼的卵中，培育出了“巨型斑马鱼”。虽然难以确定何种肌肉生长抑制素基因转录产物的构型或肌肉生长抑制素的横向同源物在上述研究中起作用，但这些研究表明，鱼类肌肉生长抑制素的生物功能可能不仅限于骨骼肌生长和发育的负调控。

由于目前在鱼类中还没有能进行基因敲除的技术，而且在鱼类中也没有种系稳定的基因抑制模式动物，因此我们使用一种基于载体的RNA干扰方法来获得遗传稳定的肌肉生长抑制素基因敲除的模型鱼来研究肌肉生长抑制素在斑马鱼中的功能。这是第一个遗传稳定的肌肉生长抑制素抑制的斑马鱼种，能够用来研究肌肉生长抑制素基因的表达和功能。

材料和方法

鱼的饲养

斑马鱼（斑马鱼类）是从本地水族用品店购买的。在28 ℃的温度、20 -L的光照强度以及14h:10h的日/夜周期下养殖。用于显微注射的受精卵是在光期开始后的单细胞阶段收集的。

反义肌肉生长抑制素绿色荧光蛋白（GFP）质粒的构建

肌肉生长抑制素Ⅱ基因（也就是肌肉生长抑制素ⅡA Y687474）是从受精后24小时的斑马鱼cDNA文库（Stratagene公司）中获得的。为了便于跟踪转基因的表达，我们将包含了810个碱基对的斑马鱼肌肉生长抑制素Ⅱ编码区的DNA片段，反义克隆到pEGFP - C1载体（Clontech公司，一个能编码产生绿色荧光蛋白的载体）的EcoRⅠ酶切位点上。

斑马鱼胚胎的显微注射和转基因斑马鱼种的获得

每个单细胞期的胚胎用玻璃微吸管注入约200微微升的质粒DNA（150微克/毫升）溶液。使用荧光显微镜（Leica, MZFLⅢ）对转基因胚胎的绿色荧光进行观察和记录。纯合的转基因斑马鱼是在这些GFP观测呈阳性的鱼种，通过加快它们性成熟并使之与非转基因鱼杂交从而筛选获得的。

实时逆转录聚合酶链反应（RT - PCR技术）

斑马鱼孵化期胚胎全RNA提取是采用TRIZOL试剂盒（Invitrogen公司）。对于RNA 样品的进一步分析，是用高容量cDNA反转录试剂盒（Applied Biosystems公司），采用随机引物进行反转录。实时PCR反应程序：95 ℃10min；95 ℃15s、60℃1min，40个循环，使用的是2 ×SYBR Green PCR Master Mix预混液（Applied Biosystems公司）以及500nM浓度的正反引物。每次检测都在Applied Biosystems7300型实时PCR仪中平行进行三次，而表达量的变化，则是用Ct值比较法得到的。每次测定的肌肉生长抑制素基因转录产物的Ct 值都是以EF1α作为内参。一步逆转录PCR法（Life technologies公司）使用的全RNA（250纳克）是从孵化阶段的胚胎中提取的。内参选择的是EF1α，并在相同的PCR环境下中进行扩增。逆转录PCR反应程序：60 ℃30min、95℃30s；95℃30s、60℃1min、72℃1min，25个循环，72℃7min。所有程序都是在Applied Biosystems 2720型热循环仪中进行，最后的逆转录PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。

引物序列

引物序列设计如下：EF1α的前引物为5' - GGT GAG TTT GAG GCT GGT A TC TCC AAG AAC -3'，后引物为5' - GAA GCC AAC GTT GTC ACC AGG AGT GGC CTC - 3'；肌肉生长抑制素Ⅰ的前引物为5' - GCA TGT GGT CCA GTG GGT TA T - 3 '，后引物为5' - GTT TGA GTC ACT CAC A TG TGG AAC A - 3'；肌肉生长抑制素Ⅱ的前引物为5' - TCT CCT TTT TTA TCT GAG CTT TTG G - 3',反引物为5' - TCT CCA GGT GTC ACA AA T GCT T - 3'；肌肉