蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验目的
1.掌握
垂直电泳槽的基本操作过程。

2.熟悉
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

实验原理
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据蛋白质分子所带电荷的差异和分子大小的不同产生的不同迁移率，从而将蛋白分离成若干条带。

在催化剂过硫酸铵（APS）和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下，丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）聚合交联形成具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

SDS是一种阴离子表面活性剂，能与蛋白分子结合形成复合物，使蛋白所带的负电荷远远超过其原有的电荷，从而掩盖了各种蛋白分子间原本的电荷差异。

因此，电泳时的迁移率不再受蛋白原有电荷和分子形状的影响。

实验器材
垂直电泳槽、电泳仪、移液器、移液器吸头、烧杯等。

实验试剂
30%（29∶1）Arc-Bis溶液、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）、TEMED、10%APS、5×蛋白电泳缓冲液、10×蛋白上样缓冲液、蛋白标准液、考马斯亮蓝R-250染色液、考马斯亮蓝脱色液等。

实验操作
（1）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶：将制胶的凹型玻璃与平玻璃固定在制胶夹板上，确保不漏水后按以下配方配制12%的分离胶。

30%（29∶1）Arc-Bis溶液3ml
分离胶缓冲液（pH8.8） 1.95ml
H2O 2.55ml
10%APS 75μl
TEMED 30μl
（2）混匀分离胶后，尽快灌至两块玻璃板的间隙中，在距离较短玻璃板2～3cm处停止灌胶，同时加入1～2ml的去离子水覆盖凝胶，室温静置10～20min。

（3）分离胶聚合后倒去水层，用滤纸把剩余水分吸干，按以下配方配制4%的浓缩胶。

30%（29∶1）Arc-Bis溶液650μl
浓缩胶缓冲液（pH6.8） 1.3ml
H2O 3ml
10%APS 50μl
TEMED 18μl
（4）混匀后将浓缩胶灌注至已聚合的分离胶上，当灌注至与较
短玻璃板顶端相齐时，立即插入梳子，同时避免产生气泡。

（5）室温静置待浓缩胶聚合后，小心拔出梳子，将凝胶架子放
置于垂直电泳槽上，加入蛋白电泳缓冲液，准备上样。

（6）将20μl的蛋白样品与5μl的10×蛋白上样缓冲液混匀，点样到凝胶孔中，同时在凝胶孔中点入3～5μl的蛋白标准液。

（7）在120V电压下电泳80～90min，待溴酚蓝指示带位于凝胶的最底部时，电泳完毕，关闭电源。

（8）电泳结束后，去除凝胶的浓缩胶部分，将分离胶浸泡在考
马斯亮蓝脱色液中，在微波炉中加热30～60s，置于侧摆摇床上平缓摇动15～20min进行染色。

（9）将脱色液倒出，用去离子水洗去凝胶上的残余脱色液，然
后将凝胶完全浸泡在脱色液中，在微波炉中加热30～60s，置于侧摆摇床上平缓摇动15～20min进行脱色。

可以更换脱色液2～3次，直
至蓝色背景基本脱去。

（10）将脱色后的凝胶放置在凝胶成像系统拍照记录并分析结果。

注意事项
（1）安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。

（2）用去离子水覆盖分离胶时，速度不宜过快，以免分离胶歪斜。

（3）电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，电泳时应选择合适的电流、电压，过高或过低均会影响电泳效果。

（4）Arc-Bis溶液具有毒性，可经皮肤、呼吸道吸收，操作时应注意做好防护措施。

实验意义
蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳操作简单方便，分辨率高，重复效果好，不仅可以用于测定蛋白质的相对分子质量，还可以用于蛋白质混合组分的分离和亚组分的分析。

经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白，可从凝胶上洗脱或切割下来，进行氨基酸测序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。

思考题
（1）电泳中出现拖尾、染色带背景不清晰等现象，有可能是什么原因导致的？
（2）蛋白凝胶染色都有哪些方法？。