第二节植物病原细菌致病相关基因及其克隆
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突变体的遗传稳定性分析
Fig.Structural organization of the pgi (A) and hrpX (B) loci of X. campestris pv. citri and of plasmids derived therefrom. (A) Restriction map of the genomic region containing pgi showing the orientation of the gene (horizontal arrow) and the site of transposon insertion in the mutant XT906. (B) Restriction map of the genomic region containing hrpX showing the orientation of the gene (horizontal arrow) and the structure of the plasmid pUW10PGUS, which contains an hrpX::gus fusion gene.
细菌常见毒素
（1）丁香毒素（syringmycin)丁香假单胞产生。 （2）冠毒素（doronatin),大豆丁香假单胞，在质粒上成簇
排列。
（3）菜豆毒素（phaseolotoxin）,菜豆假单胞产生，成簇 排列。
（4）烟毒素(tabtoxin)，包括由两基因组成的基因簇及其调 控基因
2.4.3 胞外多糖基因
1.2 突变诱变方法
• （1） 物理诱变
•
紫外线（UV）、X射线和γ射线诱变；离子束诱
变，离子束是元素的离子经高能加速器加速后获得的放 射线；中子
• （2）化学诱变
•
化学诱变剂：碱基类似物、亚硝酸如亚硝基
(NTG）、丫定橙染料、烷化剂如甲基磺酸乙脂（EMS）
等
物理和化学诱变获得的突变体
野生型细菌的基因组文库
• 环状超螺旋（cccDNA)-线性-开环ocDNA。
• 在植物病原细菌中与致病功能相关的基因多是成簇排列或 距离很近。
1 细菌致病相关基因克隆的策略和研究方法
• 1.1 基因克隆策略
• 由里及表的研究途径，创建突变体-通过基因标记和互 补法获得基因，再推断其产物，并证明其致病。
• （1）方法导向 • （2）概念导向 • （3）异源基因克隆法
◆ 纤维素酶基因(cellulase) 编码纤维素酶基因已在软腐欧氏杆菌和青枯假单
胞中得到克隆，其主要类型都是内聚葡聚糖酶基因。
◆ 蛋白酶基因 (Protease) 在荧光假单胞（P.flouorescens）胞外酶对马铃薯块组织的 浸离作用研究中发现，蛋白酶有软化薯块组织的浸离作用。王 金生等（1984）研究表明，3中软腐病菌产生的蛋白酶在离体 条件下对马铃薯块组织有较强的浸离力。目前已从软腐欧氏杆 菌中克隆了许多蛋白酶基因并对其产物特征进行了研究，但这 些基因在致病过程中的作用及其调控机理尚不清楚。
1.4 基因克隆
1.4.1转座子 表签法
1.4.2 鸟枪法
在已获得标记基因突变体和基因文库的基础上进行， 用基因库互补突变体筛选使图变体表型恢复的克隆。该克 隆含有目的基因功能片段的序列，并将此克隆转移到 E.coli中得到纯系克隆，在与突变体互补进行验证。
1.4.3 基因功能互补法
常用来克隆控制寄主范围的基因如无毒基因。
Mu噬菌体。 • A. 插入序列构成的复合转座子：分子量较小，没有表
型效应的转座因子。（转座酶和重复序列） • B. Tn3家族 • C. 其它转座子。
接合实验
热激或电激转化转座子质粒
转座子插入突变
转座子诱变
获得相应的突变体
致病性测定，获得致病性发生变化的突变体
以转座子的侧端序列为探针进行Southern杂交， 确定转座子插入的拷贝数，明确突变表型是由于转 座子的插入引起得
Tn5突变体
仅产生小病斑，菌群增长源自文库大
pv.phaseolicola/phaseolotoxin UV突变体
菌群发育正常，但无症状出现
pv.syringae/syringomycin
Tn5突变体 在樱桃上降低毒性或完全丧失毒性
pv.tabaci/tabtoxin
自然突变体 接种3d细菌生长曲线与野生型不同
2.4 决定病原菌致病性或毒性的基因
2.4.1 胞壁降解酶基(CWDE)
◆ 果胶酶基因(pectase )
果胶酶是软腐欧氏杆菌的重要致病因子，并在 萎蔫性病害（P.solanacearum ）中也起作用，现 已在至少5种病原细菌中克隆到果胶酶基因。
除此之外，在青枯假单胞菌已鉴定出4种胞外 酶基因。
起重要作用。通过对质粒比较表明寄主范围决定因子受TDNA与vir基因之间的编码序列影响。
包括被糖诱导的vir基因可影响寄主范围。 virC、 virE、 virF和virH都会影响和限定寄主范围。
青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum） 依据寄主范围可分为三个生理小种。其中在
此外，负向调控寄主范围的基因也可以表现在不 同致病变种的致病能力上。
植物病原细菌无毒基因的克隆
B.J.Staskawica （1984）首先通过基因互补 法从大豆丁香假单胞6号小种中筛选到一个具有 无毒基因功能的克隆，Napoli（1987）将此基因 命名为avrA。
此后，已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞 杆菌的不同变种和青枯假单胞中克隆到40多个无 毒基因。
无毒基因的概念是相对的，在一种病原物中起无毒 基因作用而在另一种病原物中起致病作用。
无毒基因与hrp基因互作
无毒基因通常在体外、腐生或非致病细菌中并不 表达。因此，一般情况下无毒基因产物不足以在植物 中诱导过敏反应，必须依赖于一个具有完全功能的hrp 基因介导的机制分泌。
近年来的研究表明，作为效应分子，无毒基因产 物是通过hrp基因簇所编码的Ⅲ型通道分泌系统运送至 细菌细胞外与寄主发生相互作用的。
2.2 决定显症的基因
植物病原细菌的症状类型与其致病生化因子有密切关 系。如细胞降解酶与组织浸离症状有关；产生坏死症状的 病菌如丁香假单胞引起的各种叶斑病都涉及到毒素的作用； 毒素和多糖还和植物萎蔫症状有关。有关这些基因的克隆、 结构鉴定和功能分析早已展开并取得很大进展。
۞ 黄单胞菌中一个800bp的opsX基因参与LPS的生物合
研究证明，在青枯病菌、梨火疫病菌、玉米细菌性 枯萎病菌和甘蓝黑腐病菌等植物病原菌中胞外多糖与其 致病性有关。
2.4.4 植物激素基因
致病细菌诱导植物组织过度生长是由于细菌产生植 物激素的作用。这些激素的遗传决定因子在油橄榄癌肿 病假单胞菌和根癌土壤杆菌中已有详细研究。
无毒基因的表达和调控
以P.syringae pv.glycinea中avrB为代表，其不能在富 加培养基上表达，但可以在基本培养基上表达。其表达水 平依赖于碳源。在侵染期间，avrB在感病或抗病寄主上 都能高水平表达，在非寄主植物上也能表达，说明表达不 受特异性植物因子调控。
以X.campestris pv. Vesicatoria avrBs3为代表，能在 富加、基本培养基以及植物上组成性表达。这类基因的表 达不依赖于hrp基因簇，但无毒表型的出现需要有功能的 hrp基因，可能是需要hrp基因编码的无毒蛋白通道。
成和修饰以及诱导水渍状反应；柑桔黄单胞的pthA基因是 引起增生性溃疡症状所必需的。D.W.Gabriel, et al(1995)
2.3 决定寄主范围的基因
2.3.1 正向调控寄主范围的基因
根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 可分为广寄主范围（wide host range, WHR) 和有限寄主范围(limited host range, LHR) 该病菌中的毒性基因（vir)及其诱导在决定寄主范围中
2.4.2 毒素基因
植物病原细菌的毒素一般是低分子量的非寄主专 化性毒素。这一特征有利于对毒素进行遗传分析，又由 于生物测定是可以敏感微生物代替寄主植物进行生物测 试，因此筛选程序简单、快速。目前已对4种丁香假单 胞致病变种的毒素进行了遗传分析。
致病变种／毒素
TOX菌株类型
毒性表现
pv.tomato/coronatine
两亲交配或三亲交配进行功能互补
获得能恢复突变体表型的阳性克隆 克隆片段的亚克隆分析和进一步功能互补验证
基因的克隆、测序和序列分析
• （3） 转座子诱变
• 是指细菌中有些DNA顺序能在无充分同源的情况下，
通过随机重组插入基因组DNA中。 • 转座因子包括插入顺序、转座子（Transposon,Tn)和
1.3 基因文库的构建
将细菌的基因组切成许多片段，分别连到载体上，构建 一个能携带该菌所有基因信息的克隆库。
N=In(1-P)/In(1-f)
【P重组群体中包含目的基因的概率；f限制性片段平均大小与基因组大小的比 率】
☞ 构建基因文库常用的载体有质粒（plasmid）、黏粒 （cosmid）和 λ噬菌体(phase λ)。适用于作基因克隆的质 粒载体必须具备3个共同的组成部分，即复制因子、选择标 记和克隆位点。
文库构建常用载体
• 1质粒载体 • 如PBR322
PUC系列
• （2）噬菌体载体
• 包括插入型和替代型两种，一般可容纳15-23Kb的外
源DNA片段
• （3）柯氏质粒载体
• 又称粘性质粒（cosmid),是由λ噬菌体的cos片段和 质粒复制子组成。
•
能自主复制，可容纳大约45Kb的DNA片段。
花生青枯病发病菌株上发现了一正向调控寄主范 围的基因（hsv)，称为寄主专化型毒性基因。
黄单胞菌水稻白叶枯病致病变种
（X. Oxyzae pv. oxyzae）
其中的两类重要毒性基因Hrp基因（决定在寄主植物 上致病和非寄主植物上过敏反应的基因）和dsp基因（仅 决定对寄主植物致病性）均正向调控该菌在寄主不同品种 上的致病作用。
无毒基因的生理功能
研究表明,许多植物病原细菌中存在着无毒基因的 隐性同源序列,但这种同源序列已丧失了诱导过敏性坏死 反应的功能。说明无毒基因除了有诱导过敏性坏死反应 的功能外，还有其自身的生理功能。
无毒基因是病原物遗传因子，除诱导寄主植物（含 抗性基因）产生过敏性坏死反应外，还具有决定病原物 致病性或适应性的功能。
☞ 理想基因文库应具备的条件： （1）以一种稳定的形式含有基因组DNA的序列。 （2）克隆总数不宜过大。 （3）文库的克隆片段大小必须足够包含一个完整的基因。 （4）克隆片段大小适应于载体的容纳能力，便于进行酶切图谱分析。 （5）应从少量的起始材料进行构建并易于筛选理想的片段。 （6）克隆片段之间需要有部分片段重叠以利于chromosome walking。 （7）克隆片段应易于从载体上切下而不带有任何载体序列。 （8）文库应能在克隆不损失的情况下得到扩增，而且能长期保存。
2.3.2 负向调控寄主范围的基因
植物病原细菌的无毒基因是负向调控寄主范围的 基因，无毒基因直接产物或间接产物作为激发子与相 应抗病基因产物识别诱导寄主防卫基因表达，从而表 现小种－品种互作的不亲和。无毒基因失活或缺乏相 应的无毒基因则表现小种－品种互作的亲和反应，所 以无毒基因的作用是病原菌小种对不同品种的寄主范 围的负向调控基因。
1.5 克隆片段的亚克隆分析
2 与病理过程有关的基因
2.1 与病原菌侵染有关的基因
植物病原菌的侵染过程一般包括趋化性、吸附、定 植和侵入。
已鉴定出土壤农杆菌的一条染色体基因chvE与其细 菌的趋化性有关，此外，该细菌染色体上的picA基因还 影响细菌的聚集而与毒性有关。
A.Kelman等用转座子诱变方法获得了青枯假单胞菌 类似多型性表型转换的现象，并在分子水平上进行了研 究，该基因为phcA.
第二节 植物病原细菌的致病相关基因
植物细菌基因组的特点 同于一般原核生物基因组，包括染色体基因组和质
粒基因组两部分。
染色体是一个高度折叠的环状DNA大分子，大小约为 3×106～ 5×106bp，可携带上百至最多五百个基因。游 离于细胞质的一定区域，没有包膜包被。
• 质粒是细菌染色体外基因组，也是环状DNA分子，并能 独立复制。DNA分子量在106 u ～ 108 u，所携带基因比 染色体少。但一般每个细菌菌体内包含1～多个质粒。
Fig.Structural organization of the pgi (A) and hrpX (B) loci of X. campestris pv. citri and of plasmids derived therefrom. (A) Restriction map of the genomic region containing pgi showing the orientation of the gene (horizontal arrow) and the site of transposon insertion in the mutant XT906. (B) Restriction map of the genomic region containing hrpX showing the orientation of the gene (horizontal arrow) and the structure of the plasmid pUW10PGUS, which contains an hrpX::gus fusion gene.
细菌常见毒素
（1）丁香毒素（syringmycin)丁香假单胞产生。 （2）冠毒素（doronatin),大豆丁香假单胞，在质粒上成簇
排列。
（3）菜豆毒素（phaseolotoxin）,菜豆假单胞产生，成簇 排列。
（4）烟毒素(tabtoxin)，包括由两基因组成的基因簇及其调 控基因
2.4.3 胞外多糖基因
1.2 突变诱变方法
• （1） 物理诱变
•
紫外线（UV）、X射线和γ射线诱变；离子束诱
变，离子束是元素的离子经高能加速器加速后获得的放 射线；中子
• （2）化学诱变
•
化学诱变剂：碱基类似物、亚硝酸如亚硝基
(NTG）、丫定橙染料、烷化剂如甲基磺酸乙脂（EMS）
等
物理和化学诱变获得的突变体
野生型细菌的基因组文库
• 环状超螺旋（cccDNA)-线性-开环ocDNA。
• 在植物病原细菌中与致病功能相关的基因多是成簇排列或 距离很近。
1 细菌致病相关基因克隆的策略和研究方法
• 1.1 基因克隆策略
• 由里及表的研究途径，创建突变体-通过基因标记和互 补法获得基因，再推断其产物，并证明其致病。
• （1）方法导向 • （2）概念导向 • （3）异源基因克隆法
◆ 纤维素酶基因(cellulase) 编码纤维素酶基因已在软腐欧氏杆菌和青枯假单
胞中得到克隆，其主要类型都是内聚葡聚糖酶基因。
◆ 蛋白酶基因 (Protease) 在荧光假单胞（P.flouorescens）胞外酶对马铃薯块组织的 浸离作用研究中发现，蛋白酶有软化薯块组织的浸离作用。王 金生等（1984）研究表明，3中软腐病菌产生的蛋白酶在离体 条件下对马铃薯块组织有较强的浸离力。目前已从软腐欧氏杆 菌中克隆了许多蛋白酶基因并对其产物特征进行了研究，但这 些基因在致病过程中的作用及其调控机理尚不清楚。
1.4 基因克隆
1.4.1转座子 表签法
1.4.2 鸟枪法
在已获得标记基因突变体和基因文库的基础上进行， 用基因库互补突变体筛选使图变体表型恢复的克隆。该克 隆含有目的基因功能片段的序列，并将此克隆转移到 E.coli中得到纯系克隆，在与突变体互补进行验证。
1.4.3 基因功能互补法
常用来克隆控制寄主范围的基因如无毒基因。
Mu噬菌体。 • A. 插入序列构成的复合转座子：分子量较小，没有表
型效应的转座因子。（转座酶和重复序列） • B. Tn3家族 • C. 其它转座子。
接合实验
热激或电激转化转座子质粒
转座子插入突变
转座子诱变
获得相应的突变体
致病性测定，获得致病性发生变化的突变体
以转座子的侧端序列为探针进行Southern杂交， 确定转座子插入的拷贝数，明确突变表型是由于转 座子的插入引起得
Tn5突变体
仅产生小病斑，菌群增长源自文库大
pv.phaseolicola/phaseolotoxin UV突变体
菌群发育正常，但无症状出现
pv.syringae/syringomycin
Tn5突变体 在樱桃上降低毒性或完全丧失毒性
pv.tabaci/tabtoxin
自然突变体 接种3d细菌生长曲线与野生型不同
2.4 决定病原菌致病性或毒性的基因
2.4.1 胞壁降解酶基(CWDE)
◆ 果胶酶基因(pectase )
果胶酶是软腐欧氏杆菌的重要致病因子，并在 萎蔫性病害（P.solanacearum ）中也起作用，现 已在至少5种病原细菌中克隆到果胶酶基因。
除此之外，在青枯假单胞菌已鉴定出4种胞外 酶基因。
起重要作用。通过对质粒比较表明寄主范围决定因子受TDNA与vir基因之间的编码序列影响。
包括被糖诱导的vir基因可影响寄主范围。 virC、 virE、 virF和virH都会影响和限定寄主范围。
青枯假单胞菌（Pseudomonas solanacearum） 依据寄主范围可分为三个生理小种。其中在
此外，负向调控寄主范围的基因也可以表现在不 同致病变种的致病能力上。
植物病原细菌无毒基因的克隆
B.J.Staskawica （1984）首先通过基因互补 法从大豆丁香假单胞6号小种中筛选到一个具有 无毒基因功能的克隆，Napoli（1987）将此基因 命名为avrA。
此后，已从丁香假单胞菌、甘蓝黑腐黄单胞 杆菌的不同变种和青枯假单胞中克隆到40多个无 毒基因。
无毒基因的概念是相对的，在一种病原物中起无毒 基因作用而在另一种病原物中起致病作用。
无毒基因与hrp基因互作
无毒基因通常在体外、腐生或非致病细菌中并不 表达。因此，一般情况下无毒基因产物不足以在植物 中诱导过敏反应，必须依赖于一个具有完全功能的hrp 基因介导的机制分泌。
近年来的研究表明，作为效应分子，无毒基因产 物是通过hrp基因簇所编码的Ⅲ型通道分泌系统运送至 细菌细胞外与寄主发生相互作用的。
2.2 决定显症的基因
植物病原细菌的症状类型与其致病生化因子有密切关 系。如细胞降解酶与组织浸离症状有关；产生坏死症状的 病菌如丁香假单胞引起的各种叶斑病都涉及到毒素的作用； 毒素和多糖还和植物萎蔫症状有关。有关这些基因的克隆、 结构鉴定和功能分析早已展开并取得很大进展。
۞ 黄单胞菌中一个800bp的opsX基因参与LPS的生物合
研究证明，在青枯病菌、梨火疫病菌、玉米细菌性 枯萎病菌和甘蓝黑腐病菌等植物病原菌中胞外多糖与其 致病性有关。
2.4.4 植物激素基因
致病细菌诱导植物组织过度生长是由于细菌产生植 物激素的作用。这些激素的遗传决定因子在油橄榄癌肿 病假单胞菌和根癌土壤杆菌中已有详细研究。
无毒基因的表达和调控
以P.syringae pv.glycinea中avrB为代表，其不能在富 加培养基上表达，但可以在基本培养基上表达。其表达水 平依赖于碳源。在侵染期间，avrB在感病或抗病寄主上 都能高水平表达，在非寄主植物上也能表达，说明表达不 受特异性植物因子调控。
以X.campestris pv. Vesicatoria avrBs3为代表，能在 富加、基本培养基以及植物上组成性表达。这类基因的表 达不依赖于hrp基因簇，但无毒表型的出现需要有功能的 hrp基因，可能是需要hrp基因编码的无毒蛋白通道。
成和修饰以及诱导水渍状反应；柑桔黄单胞的pthA基因是 引起增生性溃疡症状所必需的。D.W.Gabriel, et al(1995)
2.3 决定寄主范围的基因
2.3.1 正向调控寄主范围的基因
根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 可分为广寄主范围（wide host range, WHR) 和有限寄主范围(limited host range, LHR) 该病菌中的毒性基因（vir)及其诱导在决定寄主范围中
2.4.2 毒素基因
植物病原细菌的毒素一般是低分子量的非寄主专 化性毒素。这一特征有利于对毒素进行遗传分析，又由 于生物测定是可以敏感微生物代替寄主植物进行生物测 试，因此筛选程序简单、快速。目前已对4种丁香假单 胞致病变种的毒素进行了遗传分析。
致病变种／毒素
TOX菌株类型
毒性表现
pv.tomato/coronatine
两亲交配或三亲交配进行功能互补
获得能恢复突变体表型的阳性克隆 克隆片段的亚克隆分析和进一步功能互补验证
基因的克隆、测序和序列分析
• （3） 转座子诱变
• 是指细菌中有些DNA顺序能在无充分同源的情况下，
通过随机重组插入基因组DNA中。 • 转座因子包括插入顺序、转座子（Transposon,Tn)和
1.3 基因文库的构建
将细菌的基因组切成许多片段，分别连到载体上，构建 一个能携带该菌所有基因信息的克隆库。
N=In(1-P)/In(1-f)
【P重组群体中包含目的基因的概率；f限制性片段平均大小与基因组大小的比 率】
☞ 构建基因文库常用的载体有质粒（plasmid）、黏粒 （cosmid）和 λ噬菌体(phase λ)。适用于作基因克隆的质 粒载体必须具备3个共同的组成部分，即复制因子、选择标 记和克隆位点。
文库构建常用载体
• 1质粒载体 • 如PBR322
PUC系列
• （2）噬菌体载体
• 包括插入型和替代型两种，一般可容纳15-23Kb的外
源DNA片段
• （3）柯氏质粒载体
• 又称粘性质粒（cosmid),是由λ噬菌体的cos片段和 质粒复制子组成。
•
能自主复制，可容纳大约45Kb的DNA片段。
花生青枯病发病菌株上发现了一正向调控寄主范 围的基因（hsv)，称为寄主专化型毒性基因。
黄单胞菌水稻白叶枯病致病变种
（X. Oxyzae pv. oxyzae）
其中的两类重要毒性基因Hrp基因（决定在寄主植物 上致病和非寄主植物上过敏反应的基因）和dsp基因（仅 决定对寄主植物致病性）均正向调控该菌在寄主不同品种 上的致病作用。
无毒基因的生理功能
研究表明,许多植物病原细菌中存在着无毒基因的 隐性同源序列,但这种同源序列已丧失了诱导过敏性坏死 反应的功能。说明无毒基因除了有诱导过敏性坏死反应 的功能外，还有其自身的生理功能。
无毒基因是病原物遗传因子，除诱导寄主植物（含 抗性基因）产生过敏性坏死反应外，还具有决定病原物 致病性或适应性的功能。
☞ 理想基因文库应具备的条件： （1）以一种稳定的形式含有基因组DNA的序列。 （2）克隆总数不宜过大。 （3）文库的克隆片段大小必须足够包含一个完整的基因。 （4）克隆片段大小适应于载体的容纳能力，便于进行酶切图谱分析。 （5）应从少量的起始材料进行构建并易于筛选理想的片段。 （6）克隆片段之间需要有部分片段重叠以利于chromosome walking。 （7）克隆片段应易于从载体上切下而不带有任何载体序列。 （8）文库应能在克隆不损失的情况下得到扩增，而且能长期保存。
2.3.2 负向调控寄主范围的基因
植物病原细菌的无毒基因是负向调控寄主范围的 基因，无毒基因直接产物或间接产物作为激发子与相 应抗病基因产物识别诱导寄主防卫基因表达，从而表 现小种－品种互作的不亲和。无毒基因失活或缺乏相 应的无毒基因则表现小种－品种互作的亲和反应，所 以无毒基因的作用是病原菌小种对不同品种的寄主范 围的负向调控基因。
1.5 克隆片段的亚克隆分析
2 与病理过程有关的基因
2.1 与病原菌侵染有关的基因
植物病原菌的侵染过程一般包括趋化性、吸附、定 植和侵入。
已鉴定出土壤农杆菌的一条染色体基因chvE与其细 菌的趋化性有关，此外，该细菌染色体上的picA基因还 影响细菌的聚集而与毒性有关。
A.Kelman等用转座子诱变方法获得了青枯假单胞菌 类似多型性表型转换的现象，并在分子水平上进行了研 究，该基因为phcA.
第二节 植物病原细菌的致病相关基因
植物细菌基因组的特点 同于一般原核生物基因组，包括染色体基因组和质
粒基因组两部分。
染色体是一个高度折叠的环状DNA大分子，大小约为 3×106～ 5×106bp，可携带上百至最多五百个基因。游 离于细胞质的一定区域，没有包膜包被。
• 质粒是细菌染色体外基因组，也是环状DNA分子，并能 独立复制。DNA分子量在106 u ～ 108 u，所携带基因比 染色体少。但一般每个细菌菌体内包含1～多个质粒。