实验三_酵母RNA的提取及含量测定

酵母RNA的提取及含量测定
一、实验目的与要求
1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法；
2、了解测量核酸浓度不同方法的原理；
3、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法；
4、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二、实验原理
1、RNA提取原理：
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。

一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。

其中苯酚法又是实验是最常用的。

组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。

向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。

上述方法提取的RNA具有生物活性。

工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。

浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA 达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

2、测定RNA含量的方法：
（1）紫外吸收法原理：核酸具有吸收紫外线的性质，在波长260纳米处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与浓度成正比（0—50微克/毫升），符合朗伯-比尔定律。

优点样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。

（2）地衣酚显色法：核酸与浓盐酸共热，放生降解，生成糠醛，后者与地衣酚反应，在三价铁离子或二价铜离子作用下，生成鲜绿色的复合物，670纳米处有最大吸收，且光吸收值与浓度成正比，符合朗伯-比尔定律。

缺点反应特异性差，易受干扰。

（3）定磷法：在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中无机磷酸生成磷钼酸，当有还原剂存在时，磷钼酸立即被还原生成蓝色的还原产物--钼蓝，其最大吸收在660纳米处，当无机磷含量在每毫升1-25微克范围内，光吸收与含磷量成正比。

测量样品核酸的总磷量，需先将它用硫酸或高氯酸消化成无机磷再行测定。

总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可计算出核酸含量。

优点测量准确，缺点操作繁琐。

3、紫外吸收法测定RNA含量：
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。

核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。

遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。

所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。

核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。

RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。

因此，测定未知浓度的
DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。

该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可测出。

对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。

蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。

通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。

三、主要仪器和试剂
干酵母粉、pH试纸、电子天平、分析天平、100ml烧杯、量筒、吸管、离心机（4000r/min）、95%乙醇、无水乙醇、酸性乙醇、0.2%NaOH溶液、紫外分光光度计、200ug/ml的标准核酸
四、实验步骤
1、称4g干酵母粉放入200ml三角瓶中加入40ml 0.2%NaOH溶液混匀；
2、三角瓶沸水浴30min后流水冷却，转入离心管，4000r/min离心15min，结束后保留上清液，加入40ml酸性乙醇，边加边搅拌；
3、加毕，静置5min，待RNA沉淀完全后，4000r/min离心5min。

弃去上清液，保留沉淀，用20ml95％乙醇洗涤分两次沉淀，每次洗完后3000r/min离心
5min。

4、再用20ml无水乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗完后3000r/min离心5min，收集沉淀到滤纸上备用。

5、准确称取0.2—0.25克样品核酸，加2毫升0.2%氢氧化钠溶液和1毫升水溶解，调成糊状，再加入50毫升左右水溶解，边溶解边转移到100毫升烧杯中，用0.2%氢氧化钠调至中性，定容至100毫升，再取3毫升定容至100毫升备
用（由于要做平行实验，因此是从最先定容的100ml中分别取3次3ml，再分别定容至100ml）。

（开始溶液呈乳白色，完全溶解后变为澄清透明溶液）
注：本次实验一共称取了0.1765g样品。

6、制作标准曲线（标准核酸稀释至100ug/ml），测定样品。

五、实验结果
1、实验数据：
2、绘图：
通过所绘的标准曲线可知三组平行实验所对应的标准RNA的浓度分别为
32.4ug/ml、32.0 ug/ml、32.8 ug/ml，平均为32.4ug/ml，则
样品中RNA质量为32.4*10000/3=1.08*10^5 ug=0.1080g
样品中RNA含量为0.1080/0.1756=0.615=61.5%。

六、实验结果分析
本次实验测得样品中RNA的含量为61.5%，总体来说还算可以，但仍有些许误差，造成误差的原因可能有以下几种：
1、因为是做了三次平行试验，所以在样品三次定容时可能有些许误差。

2、在配置标准RNA浓度时可能量取时有误差而导致RNA浓度有些许的误差。

3、样品中可能含有少量蛋白质，DNA，对紫外光也有强吸收作用会产生误差。

4、酵母RNA被溶解后调PH时由于用的是PH试纸而不是PH计这种较为准确精密的仪器，所以可能会影响测定结果，造成一定的误差。

本次实验也有许多可取之处：
1、使用紫外分光光度仪时操作规范，对每个比色杯在实验前都用待测液体进行了润洗，而且在放入仪器中时都将外表擦拭干净。

2、在提取RNA时操作规范，离心过程也比较顺利。

3、使用分析天平时做到规范准确称量。

七、注意事项
1、在使用离心机时要注意要将对角处的物体配平，否则不但不能达到离心的效果，反而会对离心机造成损害；
2、本次实验第二次洗涤沉淀时用乙醚比较好，但由于乙醚是有毒物质，故本次实验用无水乙醇代替；
3、使用紫外分光光度仪时要小心使用石英比色杯，要用手拿糙面不要碰滑面；
4、设计标准曲线梯度时要合理，不能组数太多导致实验过于复杂；
5、注意要设计平行实验，本次实验要注意平行实验是分别取3ml液体分别定容三次，而不是定容一次而取三组测量。

八、课外延伸
1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?
答：由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁，而RNA存在于细胞质中，所以必需将酵母细胞的细胞壁研磨破碎后才能提取出RNA。

加入NaOH之后水浴煮沸30min 的作用是促进细胞壁变性，使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，使蛋白质变性，从而使细胞破裂，RNA则从细胞中分离出来。

另外细胞中含有多种分解RNA的酶类（如RNase等），为了避免RNA在提取过程中被降解，得到较为完整的RNA分子，破碎酵母细胞时应在沸水中进行，这样可以使细胞中降解RNA的蛋白酶类活性受到抑制甚至变性失活，从而起到保护RNA 分子的作用。

2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？RNA的等电点是多少？
答：酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液与菌体分离比较容易，因此酵母是提取RNA的好材料。

工业上将RNA从细胞中释放出来主要有三种方法，包括稀碱法、浓盐法和自溶法。

（1）稀碱法是在一定的碱浓度下，使构成细胞壁的蛋白质、脂肪及糖的化合物得到水解，从而破坏细胞壁，使RNA从细胞中释放出来，该方法属于化学破壁
法。

（2）浓盐法是基于改变酵母细胞的渗透压，是细胞自身破裂而释放出RNA，即利用高浓度的盐（10% NaCl）在90～100°C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使 RNA释放到盐溶液中。

同时，90～100°C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。

该方法属于物理化学破壁法。

（3）自溶法是利用某些酵母菌种在发酵结束后，细胞中的溶酶体膜破裂，使得溶酶体中的水解酶释放到细胞之中，利用菌体自身的酶系将细胞溶解，从而释放出RNA。

通常自溶法的菌浓度为2%，PH值9.5～10，自溶温度以60～65°C 为宜。

RNA的等电点为PH2.5。

根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调pH至2.0～2.5，RNA则以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。

再次离心，固液分离，便可获得RNA粗产品。

3 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？
答：酵母菌的细胞壁呈“三明治”结构——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，中间层为一层蛋白质分子（包括多种酶类），此外细胞壁壁上还含有少量的类脂和几丁质。

稀碱溶液能够对酵母菌细胞壁和细胞膜上的脂类起到抽提作用，脂类发生皂化反应从而被分解，使细胞穿孔。

同时细胞壁的聚糖成分在碱液中会部分水解，蛋白质（包括多种酶类）也会发生变性，从而增加酵母细胞的通透性，酵母细胞原生质膜失去选择透过性，细胞就破裂使RNA流出。

4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?
答：核酸是具有极性的高分子物质，根据相似相溶原理，DNA和RNA都是微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。

它们可溶于2-甲氧乙醇，也可溶于10%左右的氯化钠溶液，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，尤其是在50%左右的乙醇溶液中溶解度很小。

因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。

5．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？
答：用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。

但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。

6．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？
答：当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除。