DMC手动方法测定蛋白酶的活性

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DMC手动方法测定蛋白酶
的活性
1.适用范围
本方法适用于测定纯蛋白酶或蛋白酶混合样品中蛋白酶的活性。

本方
法还适用于测定洗涤剂中Savinase或Esperase蛋白酶的活性。

2.原理
底物NN-二甲基酪蛋白（DMC）在实验条件下被Savinase蛋白酶水解
生成小分子的多肽。

水解中形成的自由氨基酸基团与2,4,6-三硝基苯
磺酸（TNBS）有显色反应。

在425 nm下测定体系的吸光值，然后根
据标准曲线计算样品的活性。

反应条件：
温度： 50°C±1.0°C
pH：8.3
反应时间： 25分钟
底物： NN-二甲基酪蛋白（DMC）
3.单位定义
酶活的单位相对于所用的标准品，具体请参见附件A-C。

4.专一性和灵敏度
方法的检测限为标准曲线的最低点。

精确度约为5-6%。

5.仪器
水浴，50°C ±0.1°C
pH计
漩涡振荡器
16×150 mm试管
精确计时器
分光光度计
6.试剂和底物
6.1 化学试剂
NN-二甲基酪蛋白（DMC）
二水合磷酸二氢钠，NaH2PO4 2H2O
十水合硼酸钠，Na2B4O7 10H2O
硼酸，H3BO3
氯化钾，KCl
亚硫酸钠，Na2SO3
2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）
6.2 溶液
6.2.1 0.4%DMC底物
例如：配制 1 L
Na2B4O7 10H2O …………………………32.40 g
NaH2PO4 2H2O …………………………16.63 g
去离子水………………………………400 mL
再加热200 mL去离子水至沸腾，加入4.00 g DMC。

搅
拌20分钟使之充分溶解，然后冷却到室温。

将以上两种溶液混合，转移到1000 mL的容量瓶中并混
合均匀。

将配制好的底物过滤（Whatman 54号滤纸）
后，调节pH到8.00±0.05，定容。

贮存：冰箱中7天。

6.2.2 BB9缓冲液
例如：配制 1 L
KCl……………………………………11.184 g
Na2SO3………………………………20.00 g
H3BO3……………………………………3.092 g
去离子水……………………………加至1000 mL
用浓NaOH调节pH到9.00±0.05。

贮存：冰箱中7天。

6.2.3 0.1% TNBS
例如：配制50 mL
5% TNBS …………………………………1 mL
去离子水………………………………加至50 mL
贮存：每日新鲜配制，使用棕色瓶加铝膜避光。

警告：固体TNBS具有腐蚀性和毒性，因此蒸发干的
TNBS试剂不能直接丢弃，而因该用水重新溶解后再处
理。

未使用的TNBS试剂应视作有毒品处理。

7.样品和标准
依蛋白酶来源的不同，详细的标准品和样品的配置过程参见附件A-
C。

8.试验步骤
以下试验步骤适用于各种蛋白酶的分析。

酶标准品溶液和酶样品溶液的分析按照下列顺序进行：
将200 mL的去离子水预制成冰水（0-2°C），此试剂用作反应终止
液。

每个样品需要用两个试管作平行分析。

a. 每个试管加入 1 mL 的样品和 1.5 mL 的BB9缓冲液
（6.2.2）；
b. 将试管置于50°C 的水浴中预热2分钟，试管的排布方式如
下：
先是2个空白，然后是2×23个样品（包括8个标准品），最后再加两个空白。

c. 2分钟后先在一个空白中加入1mL 的DMC ，混合均匀。

15秒
后加入250μL 的0.1% TNBS ，混合均匀后，此时空白显示粉红色；
d. 顺序在2分30秒加第二个空白，2分45秒加入250 μL 的
0.1% TNBS ；
e. 按照相同的时间间隔加完所有的样品（包括最后的2个空
白）；
f. 在反应时间内，试管中的颜色由粉红变成黄色；
g. 27分钟后（加第一个DMC25分钟后）,按照相同的时间间隔
加入 2.5 mL 的冰水终止反应，试管在室温下等待检测吸光值；
h. 样品的吸光值在425 nm 下检测（以水做空白）； i. 样品自终止反应到检测完毕的时间建议控制在20-60分钟之
内，同样，检测的顺序建议与加样的顺序相同。

9.
计算
在不同蛋白酶实验数据的处理中应该使用正确的活性单位，在以下的描述中，我们把这个单位简单描述为 U 。

利用酶标准的吸光值△A 425（A 425样品/标准-A 425空白）做出标准曲线。

横轴为酶溶液的活性U/mL ，纵轴为吸光值△A 425。

样品的活性依其吸光值在标准曲线上读出。

也可以利用最小二次方回归的方法计算出标准曲线的方程式，然后按照下式计算样品的活性：
样品的活性 =
1000
××C B
A
其中：
A = 从标准曲线上读出的活性，U/mL
B = 样品的稀释度
C =样品的重量，g
1 000 = 千单位（KU ）的转化因子
计算举例：
例如测定Savinase 蛋白酶的活性
称取1.6525 g 的Savinase 样品到250 mL 的容量瓶中，用BB9定容。

搅拌20分钟后再取1 mL 稀释到250 mL 里，同样用BB9定容。

试验后从标准曲线上读出的活性为 A = 0.266 NPU(S)/mL 稀释因子 B = 250×250 = 62 500
样品的重量为 C = 1.6525 g
样品的活行为 = KNPU(S)/g = 10.1 KNPU(S)/g
附件A Savinase(KNPU(S)/Esperase(KNPU(E)蛋白酶活性的测定酶标准曲线的制A）
A 1.备（溶液
精确称量一定量的Savinase或Esperase的标准品（约1 g），用BB9缓冲液溶解在50 mL的容量瓶中，充分搅拌。

配制好的储备液的活性约为4.8 NPU/mL。

按下表将标准储备液配制成标准曲线：
标准储备液，mL BB9缓冲液标准溶液，NPU/mL
0 加至50 mL 0.0（空白）
1.0 加至50 mL 0.10
1.5 加至50 mL 0.14
2.0 加至50 mL 0.19
2.5 加至50 mL 0.24
3.0 加至50 mL 0.29
4.0 加至50 mL 0.38
5.0 加至50 mL 0.48
A 2. 酶样品液的制备
用BB9缓冲液溶解Xg的样品（至少1 g）到250 mL的容量瓶中，搅拌20分钟。

再次用BB9缓冲液稀释样品，使样品溶液最终的活性落在0.1-0.45 NPU(S)/mL。

A 3. 洗涤剂样品酶标准曲线的制备（溶液B）
本方法经过一定的修改同样适用于洗涤剂中酶样品活性的测定。

酶标准储备液按照A 1制备。

在稀释成标准曲线时需要在BB9中加入与样品中相同浓度的洗涤剂。

A 4. 含洗涤剂的酶样品的制备
因为洗涤剂中含酶的量很少，所以在制备时需要溶解多量的洗涤剂样品——一般将10 g样品溶解在1000 mL的缓冲液中。

稀释的程度取决于洗涤剂的种类的预计的酶的含量。

如同A 3所讲，重要的是在配制标准时要加入相同浓度的洗涤剂。

配制好的酶溶液必须在2小时之内检测。

附件 B Alcalase(AU)蛋白酶活性的测定
B 1. 酶标准曲线的制备（溶液A）
精确称量一定量的Alcalase的标准品（约1 g），用BB9缓冲液溶解在100 mL的容量瓶中，充分搅拌。

配制好的储备液的活性约为 2.2 mAU/mL。

按下表将标准储备液配制成标准曲线：
标准储备液，mL BB9缓冲液标准溶液，mAU/mL
0 加至50 mL 0.0（空白）
1.0 加至50 mL 0.044
1.5 加至50 mL 0.066
2.0 加至50 mL 0.087
2.5 加至50 mL 0.109
3.0 加至50 mL 0.131
4.0 加至50 mL 0.175
5.0 加至50 mL 0.218
B 2. 酶样品液的制备
用BB9缓冲液溶解Xg的样品（至少1 g）到250 mL的容量瓶中，搅拌20分钟。

再次用BB9缓冲液稀释样品，使样品溶液最终的活性落在0.05-0.2mAU/mL。

B 3. 洗涤剂样品酶标准曲线的制备（溶液B）
本方法经过一定的修改同样适用于洗涤剂中酶样品活性的测定。

酶标准储备液按照B 1制备。

在稀释成标准曲线时需要在BB9中加入与样品中相同浓度的洗涤剂。

B 4. 含洗涤剂的酶样品的制备
因为洗涤剂中含酶的量很少，所以在制备时需要溶解多量的洗涤剂样品——一般将10 g样品溶解在1000 mL的缓冲液中。

稀释的程度取决于洗涤剂的种类的预计的酶的含量。

如同B 3所讲，重要的是在配制标准时要加入相同浓度的洗涤剂。

配制好的酶溶液必须在2小时之内检测。

附件 C Everlase(EPU) 蛋白酶活性的测定
C 1. 酶标准曲线的制备（溶液A）
精确称量一定量的Everlase的标准品（约1 g），用BB9缓冲液溶解在50 mL的容量瓶中，充分搅拌。

配制好的储备液的活性约为15 mEPU/mL。

按下表将标准储备液配制成标准曲线：
标准储备液，mL BB9缓冲液标准溶液，mEPU/mL
0 加至50 mL 0（空白）
1.0 加至50 mL 0.3
1.5 加至50 mL 0.45
2.0 加至50 mL 0.6
2.5 加至50 mL 0.75
3.0 加至50 mL 0.9
4.0 加至50 mL 1.2
5.0 加至50 mL 1.5
C 2. 酶样品液的制备
用BB9缓冲液溶解Xg的样品（至少1 g）到250 mL的容量瓶中，搅
拌20分钟。

再次用BB9缓冲液稀释样品，使样品溶液最终的活性落
在0.5-1mEPU/mL。

C 3. 洗涤剂样品酶标准曲线的制备（溶液B）
本方法经过一定的修改同样适用于洗涤剂中酶样品活性的测定。

酶标
准储备液按照C 1制备。

在稀释成标准曲线时需要在BB9中加入与样
品中相同浓度的洗涤剂。

C 4. 含洗涤剂的酶样品的制备
因为洗涤剂中含酶的量很少，所以在制备时需要溶解多量的洗涤剂样
品——一般将10 g样品溶解在1000 mL的缓冲液中。

稀释的程度取
决于洗涤剂的种类的预计的酶的含量。

如同C 3所讲，重要的是在配
制标准时要加入相同浓度的洗涤剂。

配制好的酶溶液必须在2小时之内检测。

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