真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达

真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及
在羊驼毛囊干细胞中的表达
白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海
【摘要】旨在构建含有 MC1R基因的pcDNA3．1（＋）真核重组表达载体，为进一步研究 MC1R的生物学功能奠定基础。

应用RT‐PCR技术从羊驼皮肤cDNA 文库中扩增 MC1R基因全长cDNA ，然后通过双酶切将 MC1R基因全长cDNA 克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后，通过G418筛选培养，建立稳定的转染体系，直接荧光观察pcDNA3．1／MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位，并通过Western Blot方法检测 MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。

结果表明，成功构建了pcDNA3．1／MC1R重组表达载体，并且发现试验组的毛囊干细胞中表达 MC1R蛋白显著高于空白组（P＜0．05）。

成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3．1／MC1R ，且 MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。

%It is the base of further study on MC1R biological functions to construct the pcD‐NA3 .1 eukaryotic expression vector of MC1R gene in alpaca .MC1R gene was amplified by RT‐PCR with the cDNA from alpaca skin library .PCR products and pcDNA3 .1 plasmid were digested and recycled by BamHI and EcoRI endonuclease .The positive clones were selected , from which plasmid DNA was abstracted and identified by restriction endonuclease ,sequence identification and sequencing . The
pcDNA3 .1/MC1R recombinant expression plasmid was transfected into alpaca hair follicle stem cells by Lipofectamine TM 2000 .After screening culture by G418 ,a stably‐transfected cell system was
established .Fluorescent microscopy was em‐ployed to reveal the localization o f MC1R in alpaca hair follicle stem cells ,and the transcrip‐tion and expression of the MC1R were identified by Western Blot .The results show that eu‐karyotic expression vector pcDNA3 .1/MC1R was successfully constructed .When pcDNA3 . 1/MC1R recombinant expression plasmids were transfected into alpaca hair follicle stem cells , the expression of
MC1R was up‐regulated (P<0 .05) .This study successfully constructed eu‐karyotic expression vector containing green fluorescent protein gene pcDNA 3 .1/MC1R .It c ould up‐regulate the expression of MC1R in alpaca hair follicle stem cells .
【期刊名称】《河北农业大学学报》
【年(卷),期】2015(000)003
【总页数】5页(P86-90)
【关键词】羊驼;黑素皮质激素受体1;毛囊干细胞;真核表达载体;转染
【作者】白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海
【作者单位】山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801; 山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
22种天然毛色是羊驼的非常重要的经济性状之一［1］。

在哺乳动物中，毛色主
要与毛囊中的黑色素细胞的数量以及动物体内的合成以及分泌等方面有着非常重要的关系［2－3］，而色素合成的数量及分布主要受控于黑色素皮质素受体 1
（MC1R）［4］。

MC1R在黑素细胞、神经细胞等多种细胞上发挥作用。

MC1R
与其配体α－MSH和ACTH结合后，一方面通过黑色素细胞内cAMP第二信使
参与上调酪氨酸酶的表达量，TYR可以对于黑色素细胞之中的酪氨酸起到催化作用，使其生成多巴，而在黑素体内聚集一定数量的多巴之后，会进行黑色素的释放，同时还具有促进黑色素细胞增殖的作用，所以MC1R是cAMP信号通路中调节真黑色素形成的关键受体［5］，而且MC1R属于agouti基因在伪黑色素合成时的必须物质，而这个时候Agouti属于旁分泌的一种信号因子，是由真皮乳头细胞分泌的，而Agouti还能够与ACTH和α－MSH竞争性的结合，从而使黑色素合成
途径被切断，激活并合成一定的伪黑色素［6］。

在哺乳动物之中，毛色属于质量性状，受到多基因的控制［5］。

根据现有的研究成果，可以设想哺乳动物毛色基因的调控，MC1R基因对于哺乳动物的毛色起到
决定性的作用［7］。

试验选择该目的基因具有重要的生物学意义，本试验运用基因工程技术，对MC1R基因进行克隆、酶切等构建了其真核表达质粒pcDNA3.1（＋）－GFP－MC1R，通过PCR、双酶切和测序来鉴定质粒pcDNA3.1（＋）
－GFP－MC1R构建成功，并转染羊驼毛囊干细胞中，为深入研究MC1R的生物
学功能奠定试验基础，也为以后通过转基因技术来改造动物毛色提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料
羊驼皮肤组织材料等取自山西农业大学羊驼养殖基地；羊驼皮肤cDNA文库、带
有绿色荧光蛋白基因载体pcDNA3.1（＋）－GFP由羊驼生物工程实验室保存，
质粒pcDNA3.1（＋）载体购自上海生物化学研究有限公司，大肠杆菌DH5α由
本实验室保存；限制性内切酶BamHI、EcoRI聚合酶、T4DNA连接酶以及PCR
反应试剂、胶回收试剂盒、DNA Marker DL 5000等购自大连宝生物工程有限公司；脂质体LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司；转染稀释液（Opti－MEM I）购自 Gibco公司；引物由大连宝生物工程有限公司合成；KSFM及DMEM／F12培养基、PBS、胰蛋白酶均购置Gibco公司。

1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成根据GenBank公布的羊驼 MC1R序列（No.EU135880）和pcDNA3.1（＋）质粒上的多克隆酶切位点由Oligo软件设计引物。

在上下游
引物P1、P2中分别设置BamHI、EcoRI酶切位点，设计引物如下：P1：5＇－AGAGGATCCCCTTTCCTGCTCCCTG－3＇，P2：5＇－CTC－GAATTCATTGCCAAG－TAACTGCCC－3＇，引物由大连宝生物工程有限公司合成，加黑下划线分别为BamHI，EcoRI酶切位点序列。

1.2.2 MC1R全长cDNA的获取以实验室保存的羊驼皮肤cDNA文库为模板，采
用PCR方法扩增羊驼MC1R全长cDNA，全长编码区为1 081bp，反应程序为95℃5min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，35个循环；72℃ 延伸10min。

PCR产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，经纯化回收PCR产物并送至大连
宝生物工程技术有限公司测序。

1.2.3 羊驼MC1R重组真核表达载体的构建和鉴定 pcDNA3.1（＋）质粒和
MC1R基因分别用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切，并纯化回收目的片段，用T4DNA连接酶于16℃连接6h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含卡那霉素（100mg／L）的LB培养基筛选，37℃培养12h，挑选阳性克隆进行酶切，并进行PCR鉴定，阳性克隆的质粒DNA由大连宝生物工程有限公司进行序列分析鉴
定。

1.2.4 羊驼毛囊干细胞培养取羊驼背部皮肤标本1.0cm×0.2cm，置入预冷的培养基带回实验室，在生物安全柜中置于75%酒精中漂洗2次，每次1min，然后再
通过D－PBS冲洗3～5次，每次3min，用眼科剪修剪处理好的皮肤，置于0.25%的DispaseⅡ酶中，37℃消化2h，用眼科镊将毛囊拔出置于试管中，添加
0.25mg／mL胰酶＋0.2mg／mL的EDTA（1∶1），37℃消化2h，用新生牛血
清终止消化，离心并收集细胞，用毛囊干细胞培养基（实验室自配）重悬细胞，接种于培养板上，每3d换液1次，观察细胞生长状况。

置37℃，5%CO2培养箱
中培养，待毛囊干细胞铺满80%时，加入0.25%胰酶消化，按1∶2传代。

1.2.5 重组质粒转染羊驼毛囊干细胞取第3代羊驼毛囊干细胞按照1×105个／mL 密度接种到24孔板，细胞生长到汇合率达70%～80%时，用Opti－MEM I分别稀释0.8μg重组质粒 pcDNA3.1／MC1R－EGFP和2μL LipofectamineTM2000，并置于无血清的DMEM培养基中，37℃，5%CO2环境内培养.转染后12h更换
含血清的完全培养基，48h之后使用800μg／mL的G418进筛选，3周后对
G418抗性的细胞克隆进行收集并且进行扩增培养（pcDNA3.1／MC1R－EGFP
转染组），相同的方法将空质粒pcDNA3.1转染入羊驼毛囊干细胞中。

1.2.6 Western－blot检测 MC1R的蛋白水平表达
收集转染的羊驼毛囊干细胞，裂解后提取50 μL总蛋白，然后SDS－PAGE电泳
转移到NC膜。

NC膜经过5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2h，并且将转印膜置于杂交袋中，加入兔抗MC1R多克隆抗体（TBST 1∶200稀释），封口，37℃孵育
1h，然后4℃孵育12h，TBST洗膜3次，每次5min，将膜放入自封袋中，加入HRP山羊抗兔IgG（TBST 1∶1 000稀释），室温反应1h，将转印膜取出，TBST漂洗3次，每次5min，室温条件下DAB显色5min，在出现了棕黄色条带后，终止显色（内参抗体为兔抗β－actin多克隆抗体，按1∶200稀释）。

2 结果与分析
2.1 羊驼MC1R全长基因获取
以羊驼皮肤cDNA文库为模板，设计MC1R基因特异引物，进行PCR扩增，10g ／L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，电泳鉴定得到的PCR片段约为1 081bp，与目的基因大小相符（图1）。

图1 MC1R全长基因RT－PCR电泳图Fig.1 Electrophoresis pattern of RT－PCR productM：DL 5000分子量标准；1、2：MC1R基因产物。

图2 质粒pcDNA3.1（＋）－GFP－MC1R经BamHⅠ／EcoRⅠ的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pcDNA3.1（＋）－GFP－
MC1Rby BamHⅠ／EcoRⅠ digestionA：pcDNA3.1／MC1R 双酶切鉴定；B：RT－PCR鉴定重组质粒；M：DL 5000分子量标准；1：pcDNA3.1（＋）空载体；2：重组质粒pcDNA3.1（＋）／MC1R。

2.2 真核表达载体pcDNA
3.1（＋）／MC1R的鉴定
重组质粒经BamHI和EcoRI双酶切后，酶切产物利用试剂盒回收后，1.0%琼脂
糖凝胶电泳检测，可见到1条约为1 000bp大小的片段，1条约为5 400bp大小的空载体片段。

而空质粒pcDNA3.1（＋）只有1条5 400bp的条带（图2A）。

重组质粒由PCR扩增得到目的片段与MC1RcDNA长度相符，而pcDNA3.1（＋）空质粒PCR结果无条带出现（图2B）；将酶切产物送华大基因进行测序，测序结果证明，pcDNA3.1／MC1R重组质粒之中的片段，与MC1RcDNA序列相同，
表明羊驼MC1R基因的真核表达载体构建成功，可以用于后续试验。

2.3 羊驼毛囊干细胞培养
羊驼毛囊干细胞培养24h，换液，观察细胞为多边形、短梭形，有短的2～3个突起，细胞形态均一，细胞培养7～8d，融合达90%，细胞排列呈簇状，首次传代
以后6～7d传代1次（图3）。

图3 体外培养的羊驼毛囊干细胞（标尺：50μm）Fig.3 Cultured alpaca hair follicle stem cells in vitro
2.4 转染后pcDNA
3.1／MC1R在毛囊干细胞中的表达
在荧光显微镜下观察MC1R蛋白在细胞中的定位，其结果证明稳定转染
pcDNA3.1／MC1R细胞的细胞膜以及细胞之上则有一定的绿色荧光物质（图
4A），而转染pcDNA3.1（＋）空质粒的细胞中出现假阳性的绿色荧光信号（图
4B）。

图4 重组质粒pcDNA3.1／MC1R绿色荧光蛋白在羊驼毛囊干细胞中的表达Fig.4 Expression of pcDNA3.1－GFP－MC1Rin transfected cells（A）pcDNA3.1－MC1R在转染细胞中的表达；（B）pcDNA3.1空载体在转染细胞中的表达；（C）空白对照（Bar：50μm）。

2.5 转染羊驼毛囊干细胞检测MC1R蛋白表达
PCR扩增和酶切鉴定为阳性重组菌落，测序分析比对与NCBI上录入的MC1R序
列（EU135880）一致，阳性克隆测序的结果表明，MC1R 基因的ORF区成功插
入表达载体中，表明构建的真核表达载体成功。

2.6 pcDNA
3.1／MC1R毛囊干细胞内表达检测
含重组表达载体pcDNA3.1／MC1R组、转染空载体对照组和空白组均在35kDa
出现明显的阳性反应带（图5A），说明毛囊干细胞表达MC1R蛋白。

通过扫描灰度值，计算相对含量。

经SPSS11.5分析，转染pcDNA3.1／MC1R的组的
MC1R蛋白相对含量较高比其他两组有差异，说明表达产物具有反应原性。

通过Image－pro plus 6.0软件分析羊驼MC1R以及β－actin的免疫印迹结果，并对于目标条带的灰度值以及面积进行测定分析，pcDNA3.1／MC1R蛋白在羊驼毛囊干细胞中的平均蛋白含量为（1.995 4±0.312 9），转染pcDNA3.1（＋）空载体组的 MC1R蛋白表达为（1.187 4±0.153 3），空白组MC1R蛋白的表达含量为
（1.206 2±0.180 1），pcDNA3.1／MC1R转染组与空载体转染组和空白组差异显著（P＜0.05）（图5B）。

图5 MC1R蛋白在羊驼毛囊干细胞中的表达（免疫印迹实验分析）Fig.5 Western blotting analysis of MC1Rin alpaca hair follicle stem cells（A）
MC1Rprotein的免疫印迹图；（B）免疫印迹的定量分析.1：重组质粒
pcDNA3.1（＋）－MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达；2：pcDNA3.1（＋）空
载体在羊驼毛囊干细胞中的表达.3：空白对照；＊＊P＜0.05。

3 讨论与结论
MC1R是调节哺乳动物皮毛颜色的关键蛋白之一，它属于G蛋白耦合蛋白通路受
体家族中最小的受体，在色素沉着上起着重要的作用［8］。

任玉红等研究结果表明，在棕色羊驼皮肤MC1R表达要明显高于白色羊驼皮肤［3］。

尹志红等研究结果表明，采用RNAi技术成功抑制小鼠胚胎成纤维细胞中MC1R基因的表达［9］。

但是这些并没有在MC1R宿主细胞上进行表达研究，而且将目的基因插入真核表
达载体之中，并且将其转入到宿主细胞中，进一步对于观察宿主细胞的变化，对于研究目的基因功能是一种非常有效的方法［10］。

如果增强MC1R在靶细胞中的表达，能为研究毛色形成的机理提供一定的理论依据。

皮肤组织有着非常迅速的更新以及超强的再生能力，皮肤的干细胞越来越得到全世界的重视，而毛囊干细胞的潜能是多向分化，可以诱导分化为神经胶质细胞、角化细胞、黑素细胞等［11－12］。

所以说，在毛囊干细胞中研究目的基因的功能和
相关调控机制，对于实现毛发再生以及修复皮肤损伤之后的功能和结构有着非常重要的科学和生产意义。

本试验以羊驼皮肤cDNA文库为模板，根据GenBank中的该基因设计引物，通
过PCR的方法获得了羊驼MC1R全长序列，并成功将其插入含绿色荧光蛋白的pcDNA3.1（＋）－GFP载体中，经酶切和PCR鉴定后，通过脂质体转染至羊驼
毛囊干细胞中，利用G418筛选获得稳定的转染体系，而此过程中，为了鉴定是否可以进行目的蛋白的表达，将空质粒转染进入宿主细胞作为阴性对照，并通过Western Blot方法在蛋白水平检测MC1R基因的表达，结果表明，转染组中的MC1R蛋白表达量要明显高于对照组（P＜0.05），说明重组的羊驼MC1R 基因在羊驼毛囊干细胞中能有效地转录和翻译。

另外，通过荧光显微镜观察，稳定转染的宿主细胞都有MC1R的阳性表达，其主要是在细胞膜以及细胞质上进行分布，证实MC1R为跨膜受体，表明构建的MC1R重组质粒细胞获得成功，可以用于后续的生物学活性及G蛋白信号转导通路的研究。

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