靶向微泡超声造影剂的研究进展

靶向微泡超声造影剂的研究进展
张阳;米成嵘;王文
【期刊名称】《宁夏医科大学学报》
【年(卷),期】2016(038)004
【总页数】5页(P475-479)
【关键词】超声造影剂;靶向微泡;超声靶向投递系统
【作者】张阳;米成嵘;王文
【作者单位】宁夏医科大学,银川750004;西安交通大学第二附属医院超声科,西安710000;宁夏医科大学总医院超声科,银川750004;宁夏医科大学总医院超声科,银川750004
【正文语种】中文
【中图分类】R445.1
近年来随着超声技术的不断发展，超声造影在临床诊断和治疗方面都展现出了巨大的潜力，尤其在肿瘤诊疗方面，以超声靶向微泡造影剂为基础的超声靶向转运系统显露出显著的优势。

常规的给药途径使化疗药物杀死肿瘤细胞的同时，也会对正常组织产生严重的损伤作用。

理想的给药方法可以使化疗药物在体循环中呈低渗透率状态而在进入肿瘤组织后又能控释放药物，从而限制正常组织与药物的接触。

以超声靶向微泡作载体的给药途径能很好地实现这一目的，通过用超声波驱动微泡运载药物在靶组织快速释放并促进药物进入邻近的肿瘤细胞[1]。

本文主要对可携带药物靶向微泡超声造影剂的制备方法及研究进展进行综述。

超声微泡造影剂是在超声成像中用来增强图像对比度的物质，注入血管后，可以改变组织的超声特性(如背向散射系数、衰减系数、声速及非线性效应)产生造影效果。

超声微泡造影剂的发展经历了四个阶段，第一代自由空气微泡；第二代包膜空气微泡，由于稳定性差已经基本退出历史舞台；第三代超声造影剂是包裹低溶解度、低弥散度气体 ( 如氟碳或氟硫气体 ) 的包膜造影剂，在体内的存活时间长、稳定性好，显影效果好，目前已进入临床应用阶段的有Sonovue、Definity、Optison等；
第四代造影剂即靶向微泡超声造影剂，是携带靶向配体、可以靶向成像并可携带药物或基因、具有治疗作用的造影剂。

利用靶向超声造影剂与靶细胞表面标记物的特异性结合，可在疾病发生的早期在分子或细胞水平对靶组织进行特异性显像[2]。

超声微泡造影剂的制备方法较多，常用的有乳化法、超声空化法、喷墨印迹法、冷冻干燥法、薄膜水化法、机械振荡法、电雾化流动聚焦法等。

微泡膜的成分多为蛋白质、脂类及高分子聚合物[3]，后两类是目前研究的热点。

白蛋白壳膜超声微泡
热稳定性差，易受温度的影响，易引起过敏反应从而限制了其应用范围。

以高分子聚合物 (如聚乙二醇、聚乳酸、乳酸/羟基乙酸共聚物、聚己内酯等) 为壳膜材料的微泡，由于壳膜上高分子聚合物链的缠绕和共价键的直接结合减缓了气体内核的振动，影响微泡声学响应性，但抗压性和稳定性良好，微泡粒径小且均匀，体循环的持续时间长[4]。

脂类作为微泡的壳膜，虽不如高分子多聚物稳定，但其声学响应
性好，形成的微泡易产生回波；脂类的碳氢或碳氟化合链通常与亲水基团通过丙三醇共价连接，这类磷脂的饱和脂肪链长，与普通的卵磷脂相比具有更高的稳定性，药物的包封率高、渗漏率低[5]。

Borden等[6]研究发现磷脂组分是影响微泡稳定
性的重要因素，如长链酰基磷脂组分的增加可以使微泡更趋稳定，烃链上亚甲基的增多可增加单层外膜分子间的相互吸引力，从而增加了单层分子的内聚性，使微泡在制备过程中以及体内循环中更加稳定[7]。

目前研究的微泡造影剂多为气态氟碳或氟硫核心，微泡粒径较大(多为微米级)，一
定程度上限制了其在靶组织内皮间隙的透过及在靶组织的聚集。

液态氟碳核心可液-气相变微球造影剂巧妙地解决了这一问题，在体循环时内核为液态，粒径足够小(纳米级)，但当微球到达靶组织时会在一定量的超声辐照下发生液-气相变，从而产生内核为气态的、真正意义上的超声微泡造影剂，联合载药功能实现血管外靶向释放药物[8]。

微泡靶向性的实现途径主要有三个。

首先，利用微泡壳膜表面本身的化学和电荷特性滞留于靶组织。

其次，通过超声波定向投射载药微泡造影剂到达靶组织。

最后，在微泡表面偶联特异抗体或配体使其与靶细胞表面特异抗原或受体结合，其中微泡表面偶联的特异性分子与靶细胞表面标记性分子的结合效率是微泡靶向性的决定因素。

2.1 靶细胞表面标记性分子
理想的靶细胞表面标记性分子作为靶点应具有特异性、稳定且高密度表达，而偶联在微泡表面的特异性抗体或配体应具有高度靶向性、低免疫原性及毒性。

特异性抗体或配体的选择因在不同病理过程中靶细胞表面标记性分子的差异而各为不同：①在炎症反应中(如动脉粥样硬化、心肌的缺血再灌注损伤、移植排斥反应等)E选择蛋白、P选择蛋白、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)都可以作为特异性靶目标分子[9]；②在血栓形成中，血小板糖蛋白IIb/IIIa 受体因在激活的血小板上高密度表达从而成为理想的靶标分子；③在肿瘤生长及血管生成过程中，整合素家族(如αv β3，αv β6)[10]、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)[11]等为目前研究较多的靶标分子。

这些靶标分子的单克隆抗体、含特定序列的多肽等具有与其对应靶点结合高度靶向性，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)与赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(KGD)这两种氨基酸序列能高度特异地与血小板糖蛋白IIb/IIIa 受体结合[12-13]，故可作为特异性配体与微泡偶联从而使微泡具有靶向性。

这些特异性抗体或配体与靶细胞标记分子特异性结合，为靶向微泡的制
备提供了基础。

2.2 特异性抗体或配体与微泡膜的偶联
特异性抗体或配体结合微泡壳膜的方法主要有四种[14]。

①直接法：通过微泡壳膜自身离子键、静电吸附等方法将特异性抗体或配体偶联在微泡壳膜上，但由于易受体内环境的影响，配体或抗体与微泡结合不稳定而影响了靶向效果；②偶联剂连接法：偶联剂是一类具有两端带有不同性质基团的物质，其不同基团可以与不同的有机分子反应形成牢固结合。

通过偶联剂连接微泡壳膜分子与特异性配体或抗体，可以使二者间接偶联；③桥联剂连接法：桥连剂本身属于微泡壳膜的组成成分，首先需要引入必要的化学基团对桥连剂进行结构修饰形成功能基团，在微泡形成后激活功能基团，然后与配体结合；④生物素-亲和素法：生物素广泛存在于动物体内且易于人工合成，活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与几乎所有已知的生物大分子偶联，包括蛋白质，核酸，多糖，脂类等。

由于每1个亲和素能结合4个分子的生物素，而且生物素与亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，亲和力比抗原与抗体间的亲和力至少高1万倍，利用这一特点可以构建一个多层次信号放大连接系统[15]。

通过这种方法可以使微泡生物素化的壳膜组分和生物素化的特异抗体或配体通过亲和素紧密的结合。

2.3 提高微泡靶向性的方法
改变配体构型可以提高靶向微泡的靶向吸附能力，如聚合型靶向配体可促进持续的吸附；含有丰富脂质的微泡壳膜可产生脂质皱壁使壳膜表面凹凸不平，改善微泡的吸附逗留能力；用蛋白质掩饰的配体，到达靶目标后再释放掩藏的配体结构，可以減少非特定的黏合和免疫反应[16]。

另外，微泡在靶区域释放药物时，低强度聚焦超声(LIFU)相对于常规超声具有精确靶向爆破载药微泡、且定点释放药物的能力[17]，能有效提高微泡载体给药靶向性。

为了进一步提高微泡载体靶向性，制备靶向微泡已不再仅局限于单靶点靶向微泡的
研究，Ferrante等[18]制备了p-选择蛋白和VCAM-1的双靶点靶向微泡并发现其结合率是单靶点靶向微泡的两倍，而且双靶点靶向微泡能更好的抵制血流的冲击力，从而更好显示靶区域。

Willmann[19]等在荷瘤卵巢癌的小鼠上用VEGFR-2和整
合素αv β3双靶点靶向超声微泡进行造影显像，证明双靶点靶向超声造影剂靶向
黏附性及显影效果均优于单靶点靶向微泡。

Warram等[20]制备了整合素αv β3、p-选择素和VEGFR-2三靶点靶向微泡，通过流式细胞仪分析小鼠血管肉瘤内皮细胞的靶向结合，研究表明三靶点靶向微泡结合率较双靶点靶向微泡增加了50%；
人乳腺癌MDA-MB-231 细胞小鼠移植瘤模型显影研究显示，三靶点靶向微泡比单、双靶点靶向微泡显示肿瘤影像强度增加了40%。

3.1 靶向微泡增强显影及分子探针
具有靶向性的微泡造影剂可以更好地显示靶组织的微血管灌注情况，以便为超声诊断提供更确切的依据。

随着分子影像学的不断发展，超声微泡造影剂的粒径不断缩小并达到纳米级，造影剂不再局限于血池显像，可以深入组织内部显像。

超声分子成像是利用靶向微泡超声造影剂作为分子探针，可视化和定量获取活体组织或病灶细胞的抗原表位，不仅可以给出病变组织的空间信息，而且能定量和定性分析，并可在较低的临床风险下，实施针对性的治疗和对疗效进行评估[21]。

Streeter等[22]通过在移植瘤动物模型的研究对比，发现超声分子成像和动态对比增强弥散成像较肿瘤体积测量能更有效的反映肿瘤治疗效果。

Anderson等[23]利用偶联环状RGD肽的靶向微泡研究小鼠乳腺癌移植模型证实了超声分子成像对肿瘤抗新生血
管治疗效果检测的可行性。

3.2 利用靶向微泡携载药物或基因
靶向微泡造影剂在携载药物或基因治疗肿瘤方面也有突出的优势和巨大的潜力。

靶向微泡作为载体不但可以在体循环中减少药物副作用，还可以保护基因片段不被核酸酶降解和网状内皮系统的清除，而且其靶向作用很好地提高了药物利用率和基因
的转染率。

通过微泡携带药物的方式：①将药物以非共价键形式直接连接到壳膜的表面；②将药物以共价键的形式间接连接在壳膜外偶联的特异性配体或修饰性多肽上；③先将药物包封于二级载体内如脂质体后，再将二级载体与微泡进一步偶联；
④将药物镶嵌在微泡壳膜分子层中间；⑤将药物直接包裹在微泡壳膜内部；⑥疏水性药物可溶于油脂，包裹在微泡壳膜内层。

Tinkov等[24]通过对比不同微泡载药
效果的研究提出，根据不同微泡膜分子组分的理化特性选择合适的载药方式可以有效的提高药物的包封率。

Juffermans等[25]研究发现靶向微泡携载小干扰
RNA(short interfering RNA,siRNA)转染内皮细胞比质粒DNA转染更有效。

Zhang等[26]利用微泡携载内皮抑素经外周静脉注射，超声波定向集中投照裸鼠
皮下种植的肿瘤组织，微泡破裂、同时释放内皮抑素，在超声介导微泡爆破(UMMD)破坏肿瘤微脉管循环的同时抑制肿瘤血管生成。

3.3 通过靶向微泡协助干细胞归巢
干细胞移植是心血管疾病治疗的新策略，经静脉输注干细胞是最理想的移植方式，方法安全、简便、可重复。

然而，研究发现简单的静注干细胞往往难以达到预期疗效，其主要原因是血液循环中的干细胞大多被网状内皮系统摄取导致定向归巢至靶区的干细胞数量较少。

此外，在血流剪切应力作用下，流经靶区的干细胞难以与血管壁黏附也是重要因素之一。

因此，探索能减少骨髓间充质干细胞在外周损耗，有效增加其靶向归巢，提高移植效率的方法十分必要。

利用靶向微泡协助干细胞归巢是一种较理想的方法，所形成的靶向微泡-干细胞复合物内核是干细胞，外壳由稳
定性较好的靶向微泡造影剂包被形成，保护干细胞以减少脾脏等网状内皮系统的摄取，同时靶向微泡的主动寻靶功能可增强干细胞在体内的归巢能力。

岳媛媛等[27]采用“生物素-亲和素”桥连法构建携抗细胞间黏附分子-1单克隆抗体的靶向微泡，用带正电荷的多聚赖氨酸对其进行包覆和修饰，使靶向微泡表面带正电荷，然后用静电吸附法偶联大鼠骨髓间充质干细胞，成功制备出靶向微泡-干细胞复合体。

Kokhuis等[28]研究发现超声波的辐射力可以驱使靶区域靶向微泡-干细胞复合物
偏离血管腔中心，黏附于血管壁上，促使心肌梗死后的心肌组织损伤修复。

靶向微泡超声造影剂在疾病诊断和治疗方面都展现了巨大的潜力，同时在具体应用时也存在一些问题。

在制备载药的靶向微泡造影剂时，微泡包封率和载药量不够理想，不同的载药方式都存在着到达靶组织时药物与载体分离后接触靶细胞的问题，如何使药物有效脱离载体，在不影响其生物学效应的基础上更充分地接触靶细胞，这些都有赖于微泡的组分选择及制备工艺的进一步优化。

目前，靶向微泡造影剂仍停留在动物实验阶段，如何使其更安全有效的在人体内发挥效能仍需要探索优化。

相信随着分子影像学、分子生物学、药理学、材料学等多学科的不断发展，靶向微泡超声造影剂在医学临床应用方面必将发挥更大的作用。

【相关文献】
[1] Ibsen S，Schutt CE，Esener S. Microbubble-mediated ultrasound therapy:a review of
its potential in cancer treatment [J].Drug Design，Development and Therapy，2013，
7:375-388.
[2] 郑海荣，钱明. 超声造影微泡：敏锐成像、定点给药与治疗[J].中国医疗器械信息，2011，
17(7):1-5.
[3] Abou-Saleh RH，Swain M，Evans SD，et al. Poly(ethylene glycol) lipid-shelled microbubbles:abundance，stability，and mechanical properties [J].Langmuir，2014，
30(19):5557-5563.
[4] Néstor MM，NP K，NA G，et al. Preparation and in vitro evaluation of poly(D,L-lactide-co-glycolide) air-filled nanocapsules as a contrast agent for ultrasound imaging.[J].Ultrasonics，2011，51(7):839-845.
[5] 沈圆圆,高钟镐,Natalya Rapoport. 超声微泡作为基因或药物载体的研究进展[J].药学学报,2009，44 (9):961-966.
[6] Borden MA，Kruse DE，Caskey CF，et al. Influence of lipid shell physicochemical properties on ultrasound-induced microbubble destruction[J].IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control，2005，52(11):1992-2002.
[7] Kim DH，Costello MJ，Duncan PB，et al. Mechanical properties and microstructure of polycrystalline phospholipid monolayer shells:Novel solid microparticles[J].Langmuir，
2003,19(20):8455-8466.
[8] Rapoport N. Phase-shift，stimuli-responsive perfluorocarbon nanodroplets for drug delivery to cancer[J].Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol，2012，4(5):492-510.
[9] Wen Q，Wan S，Liu Z，et al. Ultrasound contrast agents and ultrasound molecular imaging[J].J Nanosci Nanotechnol，2014，14(1):190-209.
[10] Liu H，Wu Y，Wang F，et al. Molecular imaging of integrin αvβ6 expression in living subjects[J].Am J Nucl Med Mol Imaging，2014，4(4):333-345.
[11] Lohela M，Bry M，Tammela T，et al. VEGFs and receptors involved in angiogenesis versus lymphangiogenesis[J].Current Opinion in Cell Biology，2009，21(2):154-165. [12] Sivaraman B，RA L. Delineating the roles of the GPIIb/IIIa and GP-Ib-IX-V platelet receptors in mediating platelet adhesion to adsorbed fibrinogen and
albumin[J].Biomaterials，2011，32(23):5365-5370.
[13] Garanger E，Boturyn D，Dumy P. Tumor targeting with RGD peptide ligands-design of new molecular conjugates for imaging and therapy of cancers[J].Anticancer Agents
Med Chem，2007，7(5):552-558.
[14] 杨钰楠，高云华. 靶向超声造影剂制备的方法学研究[J].中华超声影像学杂志，2006，
15(1):65-67.
[15] Lesch HP，Kaikkonen MU，Pikkarainen JT，et al. Avidin-biotin technology in targeted therapy[J].Expert Opinion on Drug Delivery，2010，7(5):551-564.
[16] 钱梦騄,程茜,周红生.超声分子成像进展[J].应用声学，2013，32(3):182-189.
[17] 董桂芳，冉海涛，王志刚，等. 低强度聚焦超声靶向爆破微泡[J].中国介入影像与治疗学，2013，10(3):171-174.
[18] Ferrante EA，JE P，Rychak J，et al. Dual targeting improves microbubble contrast agent adhesion to VCAM-1 and P-selectin under flow[J].Journal of Controlled Release，2009，140(2):100-107.
[19] Willmann JK，Lutz AM，Paulmurugan R，et al. Dual-targeted contrast agent for US assessment of tumor angiogenesis in vivo[J].Radiology，2008，248(3):936-944.
[20] Warram JM，Sorace AG，Saini R，et al. A triple-targeted ultrasound contrast agent provides improved localization to tumor vasculature[J].J Ultrasound Med，2011，
30(7):921-931.
[21] Unnikrishnan S，Klibanov AL. Microbubbles as ultrasound contrast agents for molecular imaging:preparation and application[J].American Journal of Roentgenology ，2012，199(2):292-299.
[22] Streeter JE，Herrera-Loeza SG，Neel NF，et al. A comparative evaluation of ultrasound molecular imaging，perfusion imaging，and volume measurements in evaluating response to therapy in patient-derived xenografts[J].Technol Cancer Res Treat，
2013，12(4):311-312.
[23] Anderson CR，Hu X，Zhang H，et al. Ultrasound molecular imaging of tumor angiogenesis with an integrin targeted microbubble contrast agent[J].Investigative Radiology，2011，46(4):215-224.
[24] Tinkov S，Bekeredjian R，Winter G，et al. Microbubbles as ultrasound triggered
drug carriers[J].Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98(6):1935-1961.
[25] Juffermans LJ，Meijering BD，Henning RH，et al. Ultrasound and microbubble-targeted delivery of small interfering RNA into primary endothelial cells is more effective than delivery of plasmid DNA[J].Ultrasound Med Biol，2014，40(3):532-540.
[26] Zhang X，Yang G，Zhang Y，et al. An experimental research into endostatin microbubble combined with focused ultrasound for anti-tumor angiogenesis in colon cancer[J].Gastroenterology Report ，2014，2(1):44-53.
[27] 岳媛媛，王志刚，张萍. 一种新型靶向微泡-干细胞复合体的制备[J].中国医学影像技术，2014，30(5):680-684.
[28] Kokhuis TJ，Skachkov I，Naaijkens BA，et al. Intravital microscopy of localized stem cell delivery using microbubbles and acoustic radiation force[J].Biotechnol Bioeng，2015，112(1)：220-227.。