土壤微生物的分离纯化 实验：微生物的分离、培养和菌种保藏

思考题
❖ 什么叫无菌操作？分离放线菌和真菌为什么 需要分别加重铬酸钾和链霉素？
❖ 平板培养时为什么要把培养皿倒置？ ❖ 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？
Байду номын сангаас
实验七
结束
下周实验
理化因素对微生物的影响
（实验三十二、实验三十四、实验三十八）
每毫升样品中微生物细胞数=
每皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 1/取样体积数
混匀 凝固
28～30℃ 培养
图7－4 混合法流程图
实验程序 Ⅳ——平板涂抹法（涂布法）
❖ 每人取无菌培养皿1付（每个同学做一只）。在皿底贴上标签，注明 分离菌名、稀释度、组别、班级。
❖ 取已熔化的高氏培养基，分别倒15－20ml入培养皿中，铺平，制成 平板。
养皿里。 ❖ 3.取已熔化的在水浴锅中保温500C左右的马铃薯培养基（PDA培养基），
分别倒约15－20ml入上述培养皿中，轻轻转动培养皿，使菌液、培养基 充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于28～300C恒温培养 5～6d。观察真菌菌落形态以及计数 菌落。并计算出每g土壤中真菌的数 量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即 得。 （见图7－4）
挑取单个菌落接种于斜面培养基 上，如果不纯，再移植纯化，最 后得到纯培养。
实验程序Ⅵ——四大类微生物菌落形态的比较和
识别
❖ 区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态） 和细胞形态（个体形态）两方面的观察。
❖ 菌落形态： 菌落表面湿润：细菌——薄而小，酵母菌——厚而大。 菌落表面干燥：放线菌——密而小，霉菌——松而大。
淀粉琼脂培养基 马铃薯蔗糖培养基
❖ 无菌水：带有玻璃珠装有99mL无菌水三角瓶
装有9mL无菌水的试管。
❖ 其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、记号笔、
接种环、酒精灯、火柴、标签纸。
❖ 试剂：5000U/mL链霉素液
0.5％重铬酸钾液
实验总流程
图7－1 从土壤分离微生物操作过程
实验程序Ⅰ—— 倒平板的方法
每毫升样品中微生物细胞数=
每皿菌落平均数 × 稀释倍数 × 1/取样体积数
凝 固 后
28～ 30℃ 培养
图7－5 涂布法流程图
实验程序Ⅴ ——平板划线法
❖ 每人取无菌培养皿1付，在皿底贴上标签，注明事项。 ❖ 取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。 ❖ 凝固后，用接种环取相应的 菌液一环（10－2或10－3）在平板上划线
（教师作示范）。
1.连续划线法：将挑取有样品的接种 环在平板培养基表面作连续划线（。 完毕后，倒置于28～30℃温室培养。
图7－6 连续划线法图
2.分区划线法：用接种环以无 菌操作挑取土壤稀释液1环， 先在培养基的一边作第一次平 行划线3—4条，再转动培养皿 约600角，并将接种环上剩余 物烧掉，待冷却后通过第一次 划线部分作第二次划线会，同 法依次作第三次和第四次划线。 划线完毕，盖上皿盖，倒置于 28～30℃温室培养。
3.取已稀释成10－2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取 0.5mL土壤悬液加入10－3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次， 使之充分混匀，即成10－3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－4 →10 － 5 → 10－6土壤稀释液。
在土壤稀释过程中，应用一支 吸管由浓到稀，稀释到底，稀 释方法见图7－3。
❖ 凝固后，另取一支吸管吸取相应的土壤稀释液0.2mL放在平板上。 ❖ 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。倒置于28～300C条件
下培养3～4d，观察放线菌菌落形态及计数菌落，并计算出每g土壤中 放线菌的数量（方法同上）。如果样品稀释适当的话，微生物能一一 分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 ❖ 挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化， 至最后得到纯培养为止。
四人成一组，每人选取一个稀 释度的土壤稀释液做以下的三 个步骤。
实验程序Ⅲ ——稀释平板法（混合法）
❖ 涂平板：每人取培养皿1付，即每个同学做一只。 ❖ 1.先在无菌培养皿底部贴上标签，注明（分离菌名）、稀释度、组别、
班级。 ❖ 2.另取一吸管，以无菌操作法吸取相应的土壤稀释液0.1mL，加在无菌培
Exercise seven
土壤微生物的分离纯化
微生物的分离、培养和菌种保藏
❖ 目的要求 ❖ 实验材料 ❖ 试验程序 ❖ 思考题
目的要求
❖ 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化 微生物的基本操作计数。
❖ 练习微生物接种、移植和培养的基本技术， 掌握无菌操作技术。
实验材料
❖ 样品：新鲜土壤。 ❖ 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
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将培养基加热融化，待冷却至 55－60 0C时，倒平板。
实验程序Ⅱ——制备土壤稀释液
❖ 制备土壤稀释液：(无菌操作过程见教师示范） 1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释 10－2的土壤悬液。
2. 另取装有无菌试管5支，用记号笔编上10－3、10－4、10－5、10－6 、 10－7 。在每只试管中用无菌吸管加入4.5ml无菌水。
❖ 细胞形态： 细菌——小而分散 酵母菌——大而分散 放线菌——丝状细 霉菌——丝状粗
表 7-1 细菌、放线菌、霉菌和酵母菌的菌落形态比较
结 果记录
❖ 1.你所做的涂布平板法和划线法是否较好地 得到了单菌落？如果不是，请分析原因。
❖ 2.在三种不同平板上你分离得到哪些类群的 微生物？简述它们的菌落特征。