乳清分离蛋白-可溶性淀粉接枝物的制备及其理化性质

乳清分离蛋白-可溶性淀粉接枝物的制备及其理化性质
罗志刚;卢静静;孙炜炜
【摘要】To provide a reference on the study of protein-starch conjugate, the formation and secondary structure of whey protein isolate-soluble starch（SS） conjugate prepared by dry-heating method were investigated. The indexes of significant changes in A294 , browning intensity, free amino groups content and SDS-PAGE showed that WPI-SS conjugate was successfully prepared based on Maillard reaction under dry-heating. The results also showed that more incubation time significantly promoted glycosylation in the WPI-SS mixture. Meanwhile, the secondary structure of whey protein isolate had a considerable loss due to the covalent attachment of high molecular weight starch ; the surface hydrophobicity of whey protein was reduced.%研究了干热法处理条件下乳清分离蛋白-可溶性淀
粉接枝物的制备及其二级结构分析，为蛋白质-淀粉接枝物的研究提供参考。

A294、褐变、游离氨基含量变化、电泳图谱等证实乳清分离蛋白与可溶性淀粉在干热处理下确实发生了以美拉德反应为基础的接枝反应，且反应天数的延长能够显著促进乳清分离蛋白-可溶性淀粉接枝物的生成。

由于大分子淀粉的共价接入，乳清分离蛋
白的二级结构遭到破坏；蛋白质表面疏水性指数降低。

【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2011(037)009
【总页数】5页(P70-73,78)
【关键词】乳清分离蛋白;可溶性淀粉;接枝产物;二级结构;表面疏水性
【作者】罗志刚;卢静静;孙炜炜
【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640;华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510640【正文语种】中文
【中图分类】TS235
蛋白质的氨基基团与糖类化合物的还原性羰基末端经接枝反应可以得到蛋白质-糖共价复合物。

由于其不需要任何化学试剂作为催化剂，仅加热即可进行反应，这种基于Maillard反应机理的化学改性，被认为是一种有效改善蛋白质功能特性的绿色方法［1］，国内外关于蛋白质-糖接枝体系的研究已有很多报道。

蛋白质和糖进行Maillard接枝反应的基础方法主要有2种——干热法和湿热法。

干热法首先由日本的Kato教授提出，多用于多糖和蛋白质的接枝反应。

该方法将蛋白质和糖按一定的比例混合均匀后，置于一定温度(50～60°C)和相对湿度环境下进行接枝反应［2］。

作为一种优质蛋白资源，乳清分离蛋白主要由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白组成［3］。

近年研究发现，接枝改性可以有效改善乳清分离蛋白的功能特性。

Zhu等人采用湿热法成功制备出乳清分离蛋白-葡聚糖共价复合物，乳清分离蛋白的乳化性、热稳定性及其在等电点附近的溶解性等明显得到提高［4］。

关于以可溶性淀粉作为糖源与乳清分离蛋白进行接枝反应的研究，国内鲜有报道。

本研究采用干热法成功制备蛋白质-可溶性淀粉共价复合物，同时对其接枝物进行理化性质分析，以期为蛋白质-淀粉接枝物的研究提供参考。

1.1 材料与仪器
乳清分离蛋白(蛋白质含量＞95%)，由美国Hilmar公司提供;可溶性淀粉(SS)，购自广州商奇公司;邻苯二甲醛(OPA)，购自Sigma公司;所有化学试剂均为分析级;实验用水为去离子水。

Scientz-18N型冷冻干燥机，由日本Hitachi公司生产;UV-2300型分光光度计，由上海天美科学仪器有限公司生产;ECP3000型三恒电泳仪，由北京市六一仪器厂生产;MOS 450圆二色谱仪，由德国Biologic Science Instruments生产;F-4500型荧光光谱仪，由日本Hitachi公司生产。

1.2 方法
1.2.1 乳清分离蛋白-可溶性淀粉接枝物的制备
乳清分离蛋白与可溶性淀粉以质量比为1∶3混合后，用水溶解调至60 g/L后冷冻干燥。

干燥后的粉状物过120目筛后放置于干燥器内(容器底部放置饱和KBr溶液)，保持相对湿度79%、温度60℃，反应数天后即得乳清分离蛋白-可溶性淀粉接枝物［5］。

乳清分离蛋白与可溶性淀粉反应1周、2周后的接枝物分别记为
C1、C2。

乳清分离蛋白原样记为W，未经干热处理的乳清分离蛋白与可溶性淀粉的混合物记为M。

1.2.2 A294和褐变程度的测定
样品以5 mg/mL的浓度溶解于去离子水中，以水作空白样，采用紫外-可见分光光度计分别在294 nm和420 nm处测定吸光度［6］。

1.2.3 游离氨基含量的测定
准确称取40 mg的邻苯二甲醛(OPA)溶解于1 mL的甲醇中，分别加入200 g/L 的SDS 2.5 mL、0.1 mol/L 的硼砂25 mL、100 μL β-巯基乙醇，最后用蒸馏水定容至50 mL，此为OPA试剂。

测定时，取OPA试剂4 mL于试管中，分别注入200 μL样品液，混匀后于35°C反应2 min，340 nm下测其吸光值，以在
OPA试剂中加入200 μL水为为空白样，二者之差ΔA为自由氨基的净吸光值。

以赖氨酸作出标准曲线，根据ΔA计算样品中自由氨基的含量［7］。

以未经处理的
乳清分离蛋白为标准，计算各样品中游离氨基含量的相对百分比。

1.2.4 SDS-PAGE电泳
按照Laemmli［8］的方法在不连续的缓冲体系中进行，使用12%分离胶和4%浓缩胶。

样品以相同比例溶于还原性的缓冲液(10%SDS，2.5% β-巯基乙醇)中，然
后在沸水中加热5 min，于6 000×g离心3 min，以一定比例上样。

电泳过程恒流，浓缩胶电流40 mA，分离胶电流调至80 mA，溴酚蓝前沿至封口胶时关闭电源。

电泳结束后将凝胶进行考马斯亮蓝染色40 min，使用脱色液(甲醇、冰乙酸、水体积比为1∶1∶8)脱色至透明，于凝胶成像系统进行成像处理。

1.2.5 圆二色谱分析
按照Aoki的方法［9］，进行圆二色性光谱扫描实验。

将待测样品溶于0.01
mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.0)中，样品浓度为0.1 mg/mL，室温下用圆二色谱
仪(MOS 450，biologic science instruments，法国)进行远紫外光谱分析，扫描范围190～250 nm，数据间隔为0.5 nm/s，各扫描3次。

采用CDPro软件包中SELCON3算法进行二级结构含量计算。

1.2.6 表面疏水性指数的测定
采用ANS荧光探针法进行表面疏水性指数的测定［10］。

用10 mmol/L的磷酸
盐缓冲液(pH值7.0)配制不同浓度的蛋白溶液(0.02～0.3mg/mL)和8 mmol/L的
1-苯胺基-8-苯磺酸(1-anilino-8-naphthalene-sulfonate，ANS)溶液。

取20 μL ANS溶液和4 mL蛋白溶液混合均匀，反应1 min后迅速测定混合液的荧光强度，激发波长和发射波长分别为390 nm和488 nm(狭缝5 nm)，同时以未加入ANS 溶液的蛋白溶液荧光强度为空白。

以相对荧光强度对蛋白质浓度作图，采用最小二乘法进行曲线拟合，直线斜率即为表面疏水性指数。

1.2.7 统计分析
以上试验均重复3次，采用Microsoft Excel 2003计算标准偏差并做图，使用SPSS 10.0软件分析数据之间的差异显著性。

2.1 A294和褐变程度
据文献报道，A294特征吸收值常被用来检测美拉德反应体系中间产物的形成;蛋白质与多糖的接枝反应常伴随有褐色物质的生成，且褐变与美拉德反应进行的程度成正相关［11］。

图1显示，乳清分离蛋白与可溶性淀粉干热反应后，中间产物的
特征吸收(A294)和溶液的褐变程度(A420)均有明显的上升趋势。

随着反应天数的
增加，A294和A420升高最为显著。

例如，当反应两周时，A294由0.065升至0.59，A420由0.051降至0.838。

与原蛋白相比，在未经干热反应的乳清分离蛋白-可溶性淀粉混合样品中(M)，未发现A294和A420的显著变化。

结果表明，
混合体系发生了以褐变为特征的美拉德反应。

反应体系褐变程度的增加可作如下解释，在干热处理条件下，乳清分离蛋白和可溶性淀粉经美拉德反应生成中间产物;
同时，生成的部分中间产物发生聚合，生成色素类物质，使反应体系褐变程度增加［12］。

2.2 游离氨基含量变化
蛋白质与多糖的接枝反应过程中，糖的还原性羰基末端与蛋白质的自由氨基发生共价结合以形成席夫碱［13］。

因此，游离氨基含量的变化常被用来衡量蛋白质-糖接枝反应的程度。

由图2可知，乳清分离蛋白与可溶性淀粉的混合物经干热处理后，体系游离氨基含量明显下降。

当反应天数由1周增至2周时，游离氨基含量
分别下降了26.59%和36.47%。

随着反应时间的增加，蛋白质分子肽链进一步展开，游离氨基暴露程度增加，体系中较多的游离氨基与糖链发生共价结合，使得游离氨基含量下降程度较大。

这与图2中褐变程度变化也是相符的，随着Maillard
反应的不断进行，蛋白质的游离氨基不断参与反应，同时反应也向着高级阶段进行，
不断生成高级阶段产物-类黑素，褐变程度升高。

由于可溶性淀粉分子量较大，且其空间位阻使得其羰基末端与蛋白质的氨基碰撞几率大大减小，因此其接枝反应程度较蛋白质-单糖体系低。

2.3 SDS-PAGE
作为分析蛋白质组成成分的的重要手段，通过电泳图谱可以分析接枝产物中大分子淀粉的接入［14］。

由图3可知，乳清分离蛋白与可溶性淀粉的混合物经干热处理后，WPI特征条带明显减弱，在电泳图谱高分子量区出现了较为浓密的连续谱带。

而在未处理的乳清分离蛋白-可溶性淀粉混合物(M)中，其电泳图谱和原蛋白几乎一致，结果进一步印证，干热条件下，乳清分离蛋白与可溶性淀粉确实发生了以共价键形式结合为基础的接枝反应，生成了分子量较大的物质。

2.4 圆二色谱分析
圆二色谱是研究蛋白质空间结构的有力工具，在远紫外区可以反映蛋白质的二级结构信息。

研究表明，典型的α-螺旋结构在192 nm处有明显正吸收峰，在208 nm及222 nm处有2个明显负吸收峰，β-折叠结构在215 nm处有明显负吸收峰［15］。

根据上述信息计算乳清分离蛋白和接枝产物中各种二级结构所占比例见表1。

图4曲线W显示，乳清分离蛋白符合文献中描述的典型β型蛋白，其二级结构中以β-折叠为主。

由图4可知，接枝反应后，乳清分离蛋白的二级结构遭到破坏，192、208和222 nm的吸收较原蛋白减弱，表明产物中α-螺旋结构减少，但接枝产物(C1和C2)的二级结构仍以β-折叠为主;但乳清分离蛋白-可溶性淀粉混合溶液的图谱和原蛋白相比，几乎没有变化。

对乳清分离蛋白和接枝产物中各种二级结构所占比例进行计算，结果见表1。

与乳清分离蛋白二级结构组成相比，接枝产物的α-螺旋和β-转角含量减少，β-折叠和无规则卷曲含量增加。

这可能是由于蛋白质肽链中引入大分子的可溶性淀粉，由于其空间位阻效应而引起无规则卷曲含量增加;另一方面，游离氨基参与反应，分子间氢键遭到破坏，减弱了蛋白质
分子间的相互作用力，导致蛋白质分子充分伸展。

2.5 表面疏水性指数
图5显示乳清分离蛋白-可溶性淀粉接枝物表面疏水性指数的变化。

由图5可知，乳清分离蛋白经干热法接枝后，其表面疏水性明显降低;接枝物C1的疏水性相对高于C2。

结果说明，可溶性淀粉接入到蛋白质肽链中，对乳清分离蛋白的疏水性产
生一定的屏蔽作用;随着反应天数的增加，接枝物疏水性呈下降趋势，这可能与其
接枝反应程度有关。

在蛋白质的三级结构中，非极性基团即疏水基团转向分子内部形成疏水键，极性基团即亲水基团或者转向分子内部相互作用形成氢键和盐键，或者转向分子表面与极性水分子相互作用。

蛋白质结构的特征是亲水/疏水间的平衡，其结构的稳定在很大程度上有赖于分子内的疏水作用［16］。

当在乳清分离蛋白
上接入可溶性淀粉分子时，一方面打破了蛋白质自身的亲水/疏水平衡，蛋白质肽
链中亲水基团数量增加，使得分子表面的亲水性增强;另一方面接入淀粉后，蛋白
质分子的肽链发生一定程度的伸展，分子内部的极性基团暴露出来，从而使其疏水性降低。

A294、褐变、游离氨基含量变化、SDS-PAGE等证实乳清分离蛋白与可溶性淀粉在干热处理条件下确实发生了接枝反应;反应时间的延长能够显著促进乳清分离蛋
白-可溶性淀粉接枝物的生成。

由于大分子淀粉的接入，乳清分离蛋白的二级结构
遭到破坏;表面疏水性指数呈明显的下降趋势。

关于乳清分离蛋白-可溶性淀粉接枝反应的机理研究及其对蛋白质功能特性的影响，将在日后进一步开展。

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