双水相法萃取分离淀粉酶体系的初步研究要点

第28卷第3期

黑龙江大学自然科学学报

JOURNAL OF NATURAL SCIENCE OF HEILONGJIANG UNIVERSITY

Vol. 28No. 3June ，2011

2011年6月

双水相法萃取分离α-淀粉酶体系的初步研究

董海莉，平文祥，葛菁萍

（黑龙江大学生命科学学院，微生物黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨150080）

要：采用PEG1500/（NH 4）2SO 4双水相体系，对双水相萃取法分离纯化米曲霉α-淀粉酶

pH 值、PEG 浓度、（NH 4）2SO 4浓度、NaCl 浓度对α-进行了研究。探讨了PEG 分子量、淀粉酶的分

配系数K a 及回收率Y t 的影响，并通过正交实验确定了几个因素的最优组合。结果发现在pH =

摘

6. 5，PEG1500浓度17%（重量比），（NH 4）2SO 4浓度12%，加入

10%NaCl 溶液的双水相体系中，α-淀粉酶分配系数K a 为3. 738，酶回收率Y t 为85. 315%。PEG1500/（NH 4）2SO 4双水相体系是一种高效、便捷的体系，为大规模的工业提纯α-淀粉酶提供了理论依据。

关键词：双水相体系；分离；α-淀粉酶；正交实验

中图分类号：Q503

文献标志码：A

文章编号：1001－7011（2011）03－0378－05

0引言

Phase System ，ATPS ）指不同种类聚合物溶液混合或者聚合物水溶液和盐溶双水相萃取技术（Aqueous Two-［1］

液混合后，当聚合物和盐浓度达到一定值时混合液静置后分层产生的两液相或多液相系统，是近年来出现的很有发展前途的新型生化分离技术。工业用酶的大量制备常采用硫酸铵盐析法、离心喷雾干燥法等方法，存在样品回收率低、分离材料或设备昂贵、样品处理量小、单一方法分离纯数较低等问题。与一些传统的分离方法ATPS 有以下特点：体系含水量高，相比，两相界面张力极低，有助于保持生物活性和相际质量传递；上下相密度

［2］

能耗低；不存在有机溶剂残留。目前已经有多差较小；分相时间短；易于连续操作和工程放大；处理容量大，

［3－6］

。米曲霉α-种抗生素、核酸、病毒和蛋白质已成功的通过双水相进行分离淀粉酶在食品行业有着广泛的应

［7－8］

。经盐析方法分离得到的米曲霉α-用，目前工业生产多采用固态发酵进行米曲霉α-淀粉酶的生产淀粉酶

常因含有较多杂质，且不能直接应用于食品工业中而有着局限性。本文旨在研究米曲霉α-淀粉酶在PEG /（NH 4）2SO 4双水相中的分配行为和主要影响因素，为工业提取理论α-淀粉酶提供理论依据。

1

1. 1

材料与方法

材料与试剂

C10，材料：菌株米曲霉（Aspergilleas oryzae ）HDF-分离自齐齐哈尔市拜泉县采集的农家豆酱中，黑龙江大

学生命科学学院微生物重点实验室保存。

PEG1500、PEG4000、（NH 4）2SO 4、NaCl 、试剂：PEG400、可溶性淀粉、牛肉膏、蛋白胨培养基；发酵培养基（g ·L －1）：蛋白胨10、NaCl 固体5，pH =7. 0。牛肉膏3、可溶性淀粉5、

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察氏培养基（g ·L ）：硝酸钠2、磷酸氢二钾1、氯化钾0. 5、硫酸镁0. 5、硫酸亚铁0. 01、蔗糖30、琼脂20、自然pH 。

1. 2

仪器与设备

仪器：岛津紫外可见分光光度计UVmini －1240岛津国际贸易上海有限公司。

收稿日期：2011－01－13

基金项目：黑龙江省科技攻关重大项目（GA07B401－6）；科技创新人才研究专项资金优秀学科带头人资助项目（RC2010XK002028）；黑龙江省教育厅重点项目（11551z011）

作者简介：董海莉（1984－），女，硕士研究生，主要研究方向：微生物分子生物学

E-mail ：gejingping512@yahoo．com．cn 通讯作者：葛菁萍（1972－），女，教授，博士，

第3期1. 31. 3. 1

方法

董海莉等：双水相法萃取分离α－淀粉酶体系的初步研究·379·

α-淀粉酶粗酶液的制备

将在28ħ 察氏培养基培养96h 的菌体用生理盐水洗脱两次，合并洗脱液。将含有洗脱液的三角瓶

8－1

300r ·min －1的摇床中进行孢子打散30min ，在28ħ 、制成单孢子悬液，调整菌液浓度至10个·mL ，

28ħ 、180r 将制备好的单孢子悬液以2. 5%（体积比）的接种量接于含有

50mL 发酵培养基的三角瓶中，

·min －1摇床培养96h 。将摇床培养完毕后的菌液置于离心机中10000r ·min －1离心20min ，弃去菌体，上清液即为粗酶液。1. 3. 2

α-淀粉酶酶活力的测定

［9］

pH 为6. 0的NaH 2PO 4－柠檬酸缓冲液，1mL 0. 5%的可溶性淀粉溶在10mL 的试管中加入2. 5mL 、

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60ħ 水浴预热10min 后，60ħ 水浴保温5min 后，液，加入n 倍稀释的粗酶液5mL ，加入1mL 0. 1mol ·L

的H 2SO 4终止反应。反应终止后，吸取2mL 反应液与0. 5mL 0. 5%稀碘液显色，测定OD 620nm 值。与淀粉梯度标准曲线对照得反应液淀粉浓度后计算酶活力。

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5min 水解可溶性淀粉1mg 所需的酶量为1个酶酶活力单位定义（U ·mL ）：在pH =6. 0、温度60ħ ，

活力单位。酶活力的计算公式：（0. 1%－C 反）·n ·1000，其中0. 1%为底物浓度；C 反为反应液淀粉浓度；n 代表稀释倍数；1000为置换系数。1. 3. 3

PEG /（NH 4）2SO 4双水相体系的制备

实验在室温下进行操作，体系总重10. 0g ，其中粗酶液占体系的50%（重量比），将50%PEG 和（NH 4）2SO 4原溶液按照计算量加入体系中，加入适量的NaCl 溶液，最后加入去离子水使体系达到10. 0g 。将制备好的溶液装入10mL 带刻度的离心管中，首先在震荡器上充分震荡混匀，然后在离心机中4500r ·min －1离心4min 。取出后室温静置2min ，mL ），分相后根据刻度读出上下相的体积（V t 和V b ，用吸管吸取上U ·根据α-淀粉酶酶活力的测定方法进行酶活的测定（U t 和U b ，相和下相液体各2mL 于10mL 试管中，

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