复合酶@ZIF-8的制备及其黑米花青素提取性能

化
工进展
Chemical Industry and Engineering Progress
2024 年第 43 卷第 3 期
复合酶@ZIF-8的制备及其黑米花青素提取性能
王璧琮1，潘大伟1，2，谢锐1，2，巨晓洁1，2，刘壮1，2，汪伟1，2，褚良银1，2
（1 四川大学化学工程学院，四川 成都 610065；2 四川大学高分子材料工程国家重点实验室，四川 成都 610065）摘要：利用体相原位生长法制备了具有优良催化活性和稳定性的α-淀粉酶&纤维素酶@ZIF-8（A&C@ZIF-8）纳米颗粒，结合溶剂萃取过程，可实现黑米中花青素的有效提取。

该纳米颗粒中的α-淀粉酶和纤维素酶能分别通过水解多糖链上的α-1,4糖苷键和β-1,4糖苷键来解离植物细胞壁。

同时，由于ZIF-8框架良好的空间限域保护作用，这两种酶展现出良好的高温环境耐受性和有机溶剂耐受性。

该纳米颗粒的平均粒径为405nm ，呈现多角球形颗粒状，其对两种酶的总负载量为18%（质量分数）。

A&C@ZIF-8纳米颗粒中的酶可耐受72℃的高温环境，此时α-淀粉酶和纤维素酶的活性分别比其游离酶高出33.2%和247.3%。

此外，当利用A&C@ZIF-8纳米颗粒结合溶剂萃取过程进行花青素协同提取时，其每100g 提取量达到了200.39mg/g ，比仅利用溶剂萃取时的提取效果提升了26.3%。

该工作为创新设计和构建用于植物细胞中活性物质提取的固定化酶复合功能材料提供了新策略。

关键词：酶固定化；金属有机框架；花青素；生物催化
中图分类号：TQ072；Q55 文献标志码：A 文章编号：1000-6613（2024）03-1403-09
Fabrication of multi-enzyme@ZIF-8 for extraction of anthocyanins
from black rice
WANG Bicong 1，PAN Dawei 1，2，XIE Rui 1，2，JU Xiaojie 1，2，LIU Zhuang 1，2，WANG Wei 1，2，
CHU Liangyin 1，2
(1 School of Chemical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan, China; 2 State Key Laboratory of Polymer
Materials Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan, China)
Abstract: The α-amylase & cellulase@ZIF-8 (A&C@ZIF-8) nanoparticles with good catalytic activity and thermal stability are fabricated by in situ growth method in bulk solution to couple with solvent extraction process for effective extraction of anthocyanins from black rice. In these nanoparticles, the encapsulated α-amylase and cellulase allow dissociation of plant cell wall via hydrolysis of the α-1,4 glycosidic bond and β-1,4 glycosidic bond. Meanwhile, due to the spatial confinement of ZIF-8 matrix, both enzymes can exhibit good thermal stability and solvent tolerance. The A&C@ZIF-8 nanoparticles show polygonal-spherical shape with average sizes of 405nm, and loading content of 18% for both enzymes. The immobilized α-amylase and cellulase in the A&C@ZIF-8 nanoparticles show good tolerance in environment with temperature higher than 72℃, with their activities respectively 33.2% and 247.3% higher than that of their free enzyme counterparts. By coupling the A&C@ZIF-8 nanoparticles with ethanol-water system for co -extraction of anthocyanins from black rice, the extracted amount of
研究开发
DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2023-0370
收稿日期：2023-03-10；修改稿日期：2023-05-07。

基金项目：国家自然科学基金（21922809）。

第一作者：王璧琮（1998—），女，硕士研究生，研究方向为功能材料。

E-mail ：****************。

通信作者：汪伟，教授，博士生导师，研究方向为化工新材料、微流控技术。

E-mail ：******************.cn 。

引用本文：王璧琮, 潘大伟, 谢锐, 等. 复合酶@ZIF-8的制备及其黑米花青素提取性能[J]. 化工进展, 2024, 43(3): 1403-1411.
Citation ：WANG Bicong, PAN Dawei, XIE Rui, et al. Fabrication of multi-enzyme@ZIF-8 for extraction of anthocyanins from black rice[J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2024, 43(3): 1403-1411.
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化工进展， 2024， 43（3）anthocyanins can reach 200.39mg/100g, showing an 26.3% increase as compared to the extraction only with ethanol-water system. This work provides a new strategy for the innovative design and fabrication of enzyme-immobilized functional materials for extraction of actives in plant cells.
Keywords: enzyme immobilization; metal organic framework; anthocyanin; biocatalysis
植物细胞中的多酚活性物质比如黄酮、花青素等具有独特的理化特性，在医药、食品等领域具有重要用途[1-3]。

其中，花青素作为一种广泛存在于植物中的类黄酮物质，具有抑菌、抗炎和抗癌等特性[1, 4-5]，受到了医学界的广泛关注。

通常来说，花青素很少以游离形式存在，其主要分布在植物细胞壁中，以糖苷键与植物中的多糖（纤维素、淀粉等）相结合[6]。

传统的花青素提取方法通常为溶剂萃取法，即通过利用有机溶剂（如乙醇-水、丙酮-水等）浸没破坏细胞壁，从而释放出其中的花青素[7]。

然而，由于细胞壁结构成分复杂，基于有机溶剂的萃取往往难以彻底解离细胞壁而有效释放出花青素。

通过将有机溶剂萃取过程与酶催化过程相结合，可利用酶对糖苷键的水解作用来进一步提高花青素的提取效果[7-9]。

然而，酶作为天然催化剂，由于其蛋白质本质特性，酶存在着易失活、难分离等问题，这限制了酶催化与溶剂萃取法的有效耦合应用。

酶固定化是提升酶催化应用性能的有效手段[10-13]。

通过将酶固定在合适的载体上，能够在保护酶活性的同时增强其稳定性，同时有利于其使用过程中的操作和分离。

目前，研究者通过将酶分子固定封装在二氧化硅颗粒、聚合物颗粒等材料中，已实现了酶分子的有效固定化和酶催化反应[14-15]。

在酶固定化载体中，金属有机框架材料（MOF）作为一种具有可调孔隙和高比表面积的晶体材料，能够在封装酶分子的同时，对酶分子的空间构象起到良好的限域保护作用，从而在保护酶活性的同时显著提升其稳定性[16-21]。

目前，研究者通过将脂肪酶、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶等在MOF材料上进行固定化，实现了有效的酶催化反应以及酶在高温、紫外照射等苛刻条件下的良好稳定性[22-26]。

因此，通过将用于水解细胞壁的酶与MOF 材料相结合，有望提升其在使用过程中的酶活性和稳定性，这对于耦合酶和溶剂萃取过程实现植物细胞中活性物质的有效提取，具有重要意义。

本文通过体相原位生长法构建了一种有效封装α-淀粉酶（A）和纤维素酶（C）的ZIF-8纳米颗粒（A&C@ZIF-8纳米颗粒），可用于结合溶剂萃取
过程实现黑米中花青素的有效提取。

该纳米颗粒中的α-淀粉酶和纤维素酶能分别水解多糖链上的α
-1,4糖苷键和β-1,4糖苷键，以实现细胞壁的解离[27-28]，同时ZIF-8纳米颗粒能有效保护这两种酶并提升其在有机溶剂中的稳定性。

基于上述特性，该A&C@ZIF-8纳米颗粒可结合溶剂萃取过程实现对黑米中花青素的协同提取。

1 材料和方法
1.1 试剂与仪器
六水合硝酸锌[Zn(NO3)2·6H2O，纯度99%]、2-甲基咪唑（2-MI，纯度98%）、30%（体积分数）乙醇水溶液（分析纯）、稀盐酸（0.1mol/L）、一水柠檬酸（C6H8O7·H2O）、二水柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）、氯化钾（KCl）、乙酸钠（NaAc）、纤维素酶（C，10U/mg，分析纯）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na），阿拉丁试剂公司；α-淀粉酶（A，35U/mg，分析纯），麦克林公司；无水葡萄糖（Glu）、可溶性淀粉，成都科隆公司；3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，Solarbio公司；去离子水（电阻率>18.2MΩ），Millopore Elix-10纯水系统（Millipore公司）；黑米，沃尔玛超市。

以上试剂均直接使用。

电子天平（ME204型）、电子分析天平（XPE26型），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；磁力搅拌器（85-1型），上海梅颖浦仪仪器仪表制造有限公司；超声波破碎仪（VCX750），美国sonics仪器有限公司；落地式离心机（SORVALL LYNX 4000型），赛默飞世尔科技公司；动态光散射纳米粒度分析仪（DLS）及zeta电位分析仪（ZEN 3690型），英国Malvern仪器有限公司；扫描电子显微镜（SEM，TM3030型），日立高新技术公司；X射线衍射仪（XRD，X Pert Pro MPD型），荷兰Nalytical公司；热重分析仪（TGA，TG209F1型），德国NETZSCH公司；水浴恒温振荡器（SHZ-B型），上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；低温恒温槽（DC-0506型），上海舜宇恒平科学仪器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S），巩义市予华仪器有限责任公司；高速离心机（HC-
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2024年3月王璧琮等：复合酶@ZIF-8的制备及其黑米花青素提取性能
3018型），安徽中科中佳科学仪器有限公司；紫外光谱仪（UV-2700型），日本岛津仪器公司。

1.2 A&C@ZIF-8纳米颗粒的制备
首先，将0.46035g Zn(NO 3)2·6H 2O 、5.125g
2-MI 分别分散在50mL 去离子水中，充分搅拌均匀作为ZIF-8的前体溶液1（0.031mol/L ）和溶液2
（1.25mol/L ）。

然后，将15.625mg α-淀粉酶（A ）分散在25mL 去离子水（pH=5.25，0.1mol/L 稀盐酸调制）中充分搅匀作为原料液A （0.625mg/mL ，21.875U/mL ）；并将109.375mg 纤维素酶（C ）分散在25mL 去离子水（pH=3.90，0.1mol/L 稀盐酸调制）中充分搅匀作为原料液C （4.375mg/mL ，
43.750U/mL ）。

将溶液1、溶液2、原料液A 、原料液C 同时混合（图1），在室温下搅拌反应3h ，经离心（10000r/min ，3次，每次5min ）后用去离子
水洗涤，然后收集所得固体，将其在真空条件下冷冻干燥48h ，得到A&C@ZIF-8纳米颗粒，置于干燥柜中储存待用。

为了探究总酶投料浓度对A&C@ZIF-8形貌结构的影响，在合成过程中，通过改变总酶投料浓度（1mg/mL 、2mg/mL 、5mg/mL ），制备了不同的A&C@ZIF-8纳米颗粒。

为了探究不同条件下合成的A&C@ZIF-8纳米颗粒提取黑米花青素的效果，
在合成过程中，通过分别改变复合酶投料比（定义为α-淀粉酶的酶活占总酶活的比例）以及复合酶原料液pH ，制备了不同的A&C@ZIF-8纳米颗粒。

1.3 A&C@ZIF-8纳米颗粒的形貌结构与组成表征
采用DLS 对不同总酶投料浓度条件下合成的
A&C@ZIF-8纳米颗粒的粒径分布进行表征。

取
1mg A&C@ZIF-8纳米颗粒，通过超声均匀分散于去离子水中，并将溶液浓度稀释到0.1mg/mL ，将稀释后的样品置于比色皿中，利用DLS 检测其粒径分布。

采用SEM 和XRD 分别对A&C@ZIF-8纳米颗粒的微观形貌结构和晶体结构进行表征。

采用TGA 分析A&C@ZIF-8纳米颗粒中酶的负载情况，测试时称取5~8mg 干燥的A&C@ZIF-8 纳米颗粒置于坩埚中，然后在氮气氛围下，以10℃/min 的升温速率将温度由35℃升高至800℃，测定其质量变化以计算酶负载量。

采用zeta 电位分析仪测试两种游离酶在其最适pH 附近的zeta 电位，使用了0.1mol/L 的稀盐酸进行pH 调节，所用游离酶浓度为5mg/mL 。

1.4 A&C@ZIF-8纳米颗粒的酶活性测定
采用还原糖法[29]测定α-淀粉酶和纤维素酶在不同pH （游离态）和温度（游离态和固定化态）下的活性。

该方法的原理是：α-淀粉酶和纤维素酶可分别催化水解可溶性淀粉和羧甲基纤维素钠为还原糖，通过DNS 试剂定量检测相应的还原糖浓度，则可得到酶活性。

首先通过测定室温下游离酶在不同pH 下的活性，得出游离酶的最适pH ，再于该pH 下测定游离酶和经A&C@ZIF-8纳米颗粒封装的固定化酶在不同温度下的活性。

该测定过程主要包括以下4个方面。

（1）测定标准曲线。

首先，将0.5mg/mL Glu 溶液稀释至系列不同浓度以作为标准溶液。

然后，将上述标准溶液在100℃油浴中预热1min ，再分别加入等量的2mL DNS 试剂，再于100℃油浴中加热反应5min ，之后立即用冰水浴冷却并用去离子水定容到10mL 。

最后，使用紫外分光光度计检测其在540nm 处的吸光度，据此绘制Glu 浓度与吸光度的标准曲线。

（2）测定游离α-淀粉酶和游离纤维素酶的最适pH 。

首先，采用C 6H 8O 7·H 2O 和Na 3C 6H 5O 7·2H 2O 配制系列pH 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L ），作为游离酶的溶剂。

对于α-淀粉酶，取1mL 可溶性淀粉（每100mL 质量浓度1g/mL ，溶剂为相应酶的缓冲液），加入0.2mL α-淀粉酶（1mg/mL ），在36℃水浴中反应30min ，然后迅速在100℃油浴中灭活。

向已灭活的反应液中加入2mL DNS 试剂，在100℃油浴中加热反应5min 后立即用冰水浴冷却。

用去离子水将冷却后的反应液定容到10mL
，并使
图1　A&C@ZIF-8纳米颗类的制备过程示意图
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用紫外分光光度计检测其在540nm处的吸光度，与标准曲线比对得出催化产物的还原糖浓度。

除此之外，采用等量预先已灭活的α-淀粉酶液进行相同操作，作为空白对照管。

绘制pH与还原糖浓度的散点图，得出α-淀粉酶的最适pH。

对于游离纤维素酶最适pH的测定，则将1mL 可溶性淀粉替换为1mL CMC-Na（每100mL质量浓度0.6g/mL，溶剂为相应酶的缓冲液），将0.2mL α-淀粉酶替换为1mL纤维素酶（1mg/mL），进行上述相同操作。

绘制pH与还原糖浓度的散点图，得出纤维素酶的最适pH。

（3）测定A&C@ZIF-8纳米颗粒中α-淀粉酶和游离α-淀粉酶在不同温度下的活性。

对于
A&C@ZIF-8纳米颗粒中α-淀粉酶的活性测定，在其最适pH条件下将0.2mL A&C@ZIF-8纳米颗粒（1mg/mL）与1mL可溶性淀粉（每100mL质量浓度1g/mL）混合，分别在36℃、48℃、60℃、72℃、84℃水浴中反应30min，然后迅速在100℃油浴中灭活。

向已灭活的反应液中加入2mL DNS试剂，在100℃油浴中加热反应5min后立即用冰水浴冷却，并用去离子水定容到10mL。

最后，使用紫外分光光度计检测其在540nm处的吸光度，并与标准曲线比对得出催化产物的还原糖浓度。

除此之外，采用等量预先已灭活的α-淀粉酶液进行相同操作，作为空白对照管。

而对于游离α-淀粉酶的活性测定，采用的游离α-淀粉酶的量与上述A&C@ZIF-8纳米颗粒中α-淀粉酶的含量相同，再进行上述相同操作。

（4）测定A&C@ZIF-8纳米颗粒中纤维素酶和游离纤维素酶在不同温度下的活性。

对于A&C@ZIF-8纳米颗粒中纤维素酶的活性测定，在其最适pH条件下将1mL A&C@ZIF-8纳米颗粒（1mg/mL）与1mL CMC-Na（每100mL质量浓度0.6g/mL）混合，分别在36℃、48℃、60℃、72℃、84℃水浴中反应30min，然后迅速在100℃油浴中灭
活。

向已灭活的反应液中加入2mL DNS试剂，在100℃油浴中加热反应5min后立即用冰水浴冷却，并用去离子水定容到10mL。

最后，使用紫外分光光度计检测其在540nm处的吸光度，并与标准曲线比对得出催化产物的还原糖浓度；除此之外，采用等量预先已灭活的纤维素酶液进行相同操作，作为空白对照管。

对于游离纤维素酶的活性测定，采用的游离纤维素酶的量与上述A&C@ZIF-8纳米颗粒中纤维素酶的含量相同，再进行上述相同操作。

1.5 A&C@ZIF-8纳米颗粒对黑米花青素的提取性能
A&C@ZIF-8纳米颗粒用于黑米花青素提取的原理如图2所示。

负载复合酶的A&C@ZIF-8纳米颗粒通过与黑米细胞接触后，催化水解其细胞壁内多糖的糖苷键，从而使细胞壁破碎解离，释放出花青素。

根据文献报道[30-32]，由于热稳定性和溶解性的影响，花青素的最适温度在36℃附近，且在该温度下采用30%（体积分数）乙醇水溶液进行有机溶剂萃取的提取效果良好，故本研究中选取该温度作为萃取反应的温度。

首先，将黑米彻底干燥，并在玛瑙研钵中研磨成粉末。

然后，将20mg黑米粉末与2.5mg A&C@ZIF-8纳米颗粒混合，并分散于10mL 30%（体积分数）乙醇水溶液（pH=2.52）中，在恒温水浴（36℃，100r/min）中振荡反应3h。

将反应液离心（7100g，10min）分离得上清液即为花青素粗提液。

采用溶剂萃取法（仅使用乙醇作为溶剂）以及添加A&C的溶剂萃取法（A&C添加量与A&C@ZIF-8纳米颗粒中所含A&C量相等，该含量基于TGA测得的酶包封量进行计算），经上述过程提取花青素，以作为对照组。

花青素提取量采用pH示差法进行定量测定[31]。

pH示差法的原理主要是基于花青素在不同pH下具有不同结构，从而导致其吸光度不同。

用两种预先制备的缓冲液（KCl，0.025mol/L，pH=1.0；NaAc
，
图2　A&C@ZIF-8纳米颗粒用于黑米中花青素提取的原理图
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2024年3月王璧琮等：复合酶@ZIF-8的制备及其黑米花青素提取性能
0.4mol/L ，pH=4.5）分别稀释上清液，避光静置稳
定15min 后，采用紫外分光光度计测定稀释液的吸光度，并根据式(1)~式(3)计算花青素提取量。

A =(
A λ
,1.0
-A 700, 1.0)-(
A λ
,4.5
-A 700, 4.5
)
(1)花青素浓度(mg/L)=
A ×M W ×DF ×1000
ε×1
(2)
花青素提取量(mg/100g 黑米)=
花青素浓度(mg/L)×上清液体积(L)
黑米质量(g)×100
(3)
式中，A 为吸光度，下标代表特定条件，如A λmax
,1.0代表pH=1.0时吸光度最大波长处（500~700nm
之间）的吸光度；M W 为分子量，以矢车菊-3-葡萄
糖苷（C3G ）为标准物，取449.2g/mol ；DF 为稀释倍数；ε为摩尔消光系数，取26900L/(mol·cm)。

2 结果与讨论
2.1 A&C@ZIF-8纳米颗粒的制备与结构组成表征
不同总酶投料浓度条件下制备的A&C@ZIF-8纳米颗粒的粒径分布如图3所示。

从图3中可以看出，当总酶投料浓度分别为1mg/mL 、2mg/mL 和5mg/mL 时，所制备得到的A&C@ZIF-8纳米颗粒的平均粒径分别为690nm 、615nm 和405nm 。

该结果说明，随着总酶投料浓度的上升，合成的A&C@ZIF-8纳米颗粒粒径逐渐变小。

这主要是由于酶的存在能够诱导ZIF-8前体快速成核，而酶投料浓度的提高将使得反应液中的成核数量增多；因此，在ZIF-8前体量一定的情况下，成核数量增多将使得所生长得到的纳米颗粒的尺寸有所降低，从而得到粒径更小的A&C@ZIF-8纳米颗粒。

A&C@ZIF-8纳米颗粒粒径越小，底物分子由外部环境扩散进入颗粒多孔结构内部的路径越短，因
而有利于底物分子与纳米颗粒内部封装的酶分子的接触，从而提升酶催化效率。

此外，较小的粒径将使得纳米颗粒具备更大的比表面积，而较高的酶投料浓度也有利于在最终纳米颗粒中达到更高的酶负载量。

因此，选择5mg/mL 总酶投料浓度条件下制备的A&C@ZIF-8纳米颗粒进行后续研究。

如图4所示为A&C@ZIF-8纳米颗粒微观形貌结构表征的SEM 图。

从图4中可以看出，A&C@ZIF-8纳米颗粒呈现出多角球形颗粒的结构，且具有较均一的尺寸，经DLS 测试其平均粒径为
405nm 。

如图5(a)所示为ZIF-8纳米颗粒和A&C@ZIF-8纳米颗粒的XRD 表征结果。

从图5(a)中可以看出，ZIF-8在衍射角7.3°、10.3°、12.7°、14.7°、16.4°、18.0°处具有明显的晶面特征衍射峰
（011）、（002）、（112）、（022）、（013）、（222），该结果与文献报道一致[33]。

相比之下，A&C@ZIF-8仅保留了部分ZIF-8的特征峰信号，其特征峰强度变弱、杂峰变多，代表着结晶度的显著降低，亦证明了复合酶的掺入对ZIF-8规则晶体框架结构的影响。

为了进一步测定A&C@ZIF-8纳米颗粒中酶的含量，采用TGA 对A&C@ZIF-8纳米颗粒进行了热重分析。

如图5(b)中的TGA 结果所示，依据热重曲线的拐点，可以分析得出A&C@ZIF-8纳米颗粒发生了3次主要的质量下降，100℃之前的质量变化源于纳米颗粒间残存的少量水分和杂质挥发。

在180℃和280℃附近分别发生了两次质量下降，分析原因认为，由于游离A 和游离C 发生质量下降和热分解的温度通常在200℃附近[34-35]
，因而这两次质
图4　A&C@ZIF-8纳米颗粒的SEM
图
图3　A&C@ZIF-8纳米颗粒的粒径分布随总酶投料
浓度的变化
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量下降主要是由于A&C@ZIF-8纳米颗粒中包封的两种酶发生分解所致；同时，从该结果可看出，ZIF-8的固定化不会显著影响A&C 的热分解稳定性。

最后，在温度上升至400℃后发生了最大幅度
的质量下降，并逐渐趋于平缓，直到610℃质量完全稳定，这主要是由于A&C@ZIF-8纳米颗粒的ZIF-8骨架结构开始发生热解所致。

通过分析计算质量下降段占比，得出A&C@ZIF-8纳米颗粒中复合酶的包封量为18%（质量分数）。

2.2 A&C@ZIF-8纳米颗粒的酶活性
如图6所示为室温下α-淀粉酶和纤维素酶在不同pH 下的活性，通过拟合曲线可得出α-淀粉酶和纤维素酶的最适pH 分别为5.25和3.90。

接着，在最适pH 条件下，分别测定了游离态以及封装在A&C@ZIF-8纳米颗粒中（固定化态）的两种酶在不同温度下的活性，其结果如图7所示。

图7(a)中，对于游离α-淀粉酶，随着温度从36℃升高到48℃，其还原糖浓度由0.037mg/mL 增大至0.042mg/mL ，当温度进一步升高至60℃时，其还原糖浓度减小至0.041mg/mL ，并随着温度继续升高至84℃而活性继续降低；相应地，固定化α-淀粉酶亦展现出活性随
温度升高而先增大后减小的趋势，随着温度从36℃逐级升高至72℃，其还原糖浓度由0.019mg/mL 逐渐增大至峰值0.052mg/mL 。

图7(b)中，对于游离纤维素酶，随着温度从36℃升高至84℃，其还原糖浓度从0.018mg/mL 降低至0.007mg/mL ，活性持续下降；而对于固定化纤维素酶，其还原糖浓度随温度的提升亦先增大到峰值0.049mg/mL 再减小，但变化并不显著，且始终是游离纤维素酶的2.5倍以上。

上述结果中温度对两种酶表观活性的作用主要由温
图5　A&C@ZIF-8纳米颗粒的XRD
图及热重分析
图7　游离酶和A&C@ZIF-8纳米颗粒在不同温度条件下
的酶活性
图6　游离α-淀粉酶和纤维素酶的活性随pH 的变化
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2024年3月王璧琮等：复合酶@ZIF-8的制备及其黑米花青素提取性能
度对酶分子构象的影响以及对酶催化反应速率的影响综合决定[36-38]。

同时，对比图6和图7可以看出，在36℃的相同反应条件下，图7中游离A&C 催化所得还原糖浓度均低于图6中对应酶催化所得的最高还原糖浓度，这主要是因为图7所用的游离酶是根据A&C@ZIF-8纳米颗粒中所含酶的量来决定的，比图6中所用的游离酶含量少得多，因而所得还原糖浓度更低。

此外，综合上述结果可看出，相较于游离态的酶，A&C@ZIF-8纳米颗粒中的酶展现出更好的高温环境耐受性。

2.3 A&C@ZIF-8纳米颗粒的黑米花青素提取性能
研究中通过改变两种酶的投料比、投料pH 条件等探究了不同条件下制得的A&C@ZIF-8纳米颗粒对黑米中花青素的提取效果。

首先，在固定总酶投料浓度为5mg/mL 的前提下，通过改变复合酶投料比例合成了一系列A&C@ZIF-8纳米颗粒样品，并研究其对黑米中花青素的提取效果（图8）。

从图8中可看出，当α-淀粉酶投料比为0（即只使用纤维素酶）和为1（即只使用α-淀粉酶）时，所制得的A&C@ZIF-8纳米颗粒对黑米中花青素的相对提取量分别为81.08%和72.97%。

当α-淀粉酶投料比为1/2和2/3时，其相对提取量分别为51.35%和56.76%，相比于仅使用纤维素酶或α-淀粉酶时有所降低。

而当α-淀粉酶投料比为1/3时，所制得的A&C@ZIF-8纳米颗粒对黑米中花青素的相对提取量达到了最高值。

因此，在后续实验中均采用了1/3的α-淀粉酶投料比。

如图9所示为α-淀粉酶和纤维素酶分别在其最适pH 附近（图6）的zeta 电位值。

从图9中可看
出，α-淀粉酶在pH=4.40~6.33时的zeta 电位值为
-38.00~-32.97mV ，而纤维素酶在pH=3.20~5.36时
的Zeta 电位值为-7.47~-1.15mV ，且pH 越小，其电位绝对值越小。

两种酶在上述pH 范围内均带负电，这有利于其与带正电的Zn 离子前体结合以及在ZIF-8微孔结构中的包封。

基于上述结果，通过在最适pH 下配制两种酶的原料液制得了A&C@ZIF-8
纳米颗粒。

如图10所示为基于不同pH 的酶原料液构建的A&C@ZIF-8纳米颗粒对黑米中花青素的提取效果，其中pH （A ）和pH （C ）分别表示α-淀粉酶原料液和纤维素酶原料液的pH 。

从图10中可以看出，相对于两种酶原料液pH 均为7的情况，当将两种酶原料液分别调节至其最适pH 时，所制得的A&C@ZIF-8纳米颗粒展现出了对黑米中花青素更高的相对提取量（高出15.6%）。

这主要是因为在最适pH 条件下有利于酶保持其高活性构象，并可进一步在酶与ZIF-8前体的快速结合成核过程中被有效地包封和固定，因而有利于其展现出更佳的催化活性。

基于上述结果，在α-淀粉酶投料比为1/3、 α-淀粉酶原料液pH=5.25和纤维素酶原料液
pH=
图8　花青素提取量随合成A&C@ZIF-8时α-淀粉酶投料比
的变化
图9　游离α-淀粉酶和游离纤维素酶的zeta 电位随pH
的变化
图10　基于不同pH 的酶原料液构建的A&C@ZIF-8纳米颗
粒对黑米中花青素的提取效果
A —α-淀粉酶；C —纤维素酶
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化工进展， 2024， 43（3）
3.90的条件下制备了A&C@ZIF-8纳米颗粒，并将其结合溶剂萃取过程用于黑米花青素的提取。

同时，采用了不含A&C@ZIF-8纳米颗粒以及结合游离复合酶A&C 的溶剂萃取过程用于黑米花青素的提取，以作为对照实验。

从图11所示的黑米花青素提取效果可看出，当仅用溶剂萃取过程提取黑米中的花青素时，其提取量达到了158.64mg/100g 。

在溶剂萃取的基础上添加了游离复合酶A&C 结合提取时，其提取量达到了188.94mg/100g ，说明游离复合酶A&C 起到了一定水解植物细胞壁、增加花青素提取量的作用。

此外，从图11中可看出，当在溶剂萃取过程中结合A&C@ZIF-8纳米颗粒进行花青素协同提取时，其每100g 提取量达到了200.39mg/g ，比结合游离复合酶A&C 的溶剂萃取过程的效果更好，且相比于溶剂萃取的提取效果提升
了26.3%。

因此，相比于在使用和保存过程中易变性失活、难以分离回收的游离酶来说，通过ZIF-8纳米颗粒微孔结构的空间限域作用束缚酶分子的空间构象变化，不仅实现了对酶分子的有效固定化保护作用，使其稳定性提升，而且可使其保持在有机溶剂中的高催化活性，从而为A&C@ZIF-8纳米颗粒结合溶剂萃取过程进行花青素协同萃取提供了基础。

3 结论
通过体相原位生长法构建了一种可用于结合溶
剂萃取进行黑米中花青素有效提取的A&C@ZIF-8纳米颗粒。

由于ZIF-8框架良好的空间限域保护作用，纳米颗粒中所封装的α-淀粉酶和纤维素酶能展现出良好的高温环境耐受性和有机溶剂耐受性。

当将A&C@ZIF-8纳米颗粒结合乙醇-水体系溶剂
萃取过程进行花青素协同提取时，其对黑米中花青
素的提取量达到了200.39mg/g ，比仅利用溶剂萃取时的提取效果提升了26.3%。

相关工作为开发新型固定化酶复合功能材料用于植物细胞中活性物质的提取提供了新思路。

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图11　溶剂萃取以及分别结合A&C 和A&C@ZIF-8纳米颗粒的协同萃取过程对黑米中花青素的提取效果
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