氨基酸手性色谱分离

218
Univ. Chem. 2023, 38 (10), 218–224
收稿：2023-01-26；录用：2023-02-13；网络发表：2023-02-28
*通讯作者，Email:*******************.cn
基金资助：国家重点研发计划
(2018YFC1602400)
•知识介绍• doi: 10.3866/PKU.DXHX202301022 氨基酸手性色谱分离
杜瑾，石宜灵，唐安娜*，孔德明
南开大学化学学院，分析科学研究中心，天津市生物传感与分子识别重点实验室，化学国家级实验教学示范中心，天津 300071
摘要：光学活性和立体构象不同的氨基酸，具有不同的生理活性和作用，因此，实现氨基酸的有效手性分离具有重要意义。

色谱法是常用的氨基酸手性分离方法，具有分离效率高、速度快、灵敏、成本低和绿色环保等特点，在氨基酸手性分离和检测领域应用广泛。

本文综述了色谱法在氨基酸手性分离方面的最新进展，并对其发展趋势进行了展望。

关键词：氨基酸；手性分离；色谱法
中图分类号：G64；O6
Chiral Separation of Amino Acids by Chromatography
Jin Du, Yiling Shi, Anna Tang *, Deming Kong
Research Center for Analytical Sciences, Tianjin Key Laboratory of Biosensing and Molecular Recognition,
National Demonstration Center for Experimental Chemistry Education, College of Chemistry, Nankai University,
Tianjin 300071, China.
Abstract: Amino acids with different optical activities and stereo-configurations have different physiological activities and effects. Therefore, it is important to achieve the chiral separation of amino acids effectively. Chromatography is a commonly used method for the chiral separation and detection of amino acids, and is characterized by high separation efficiency, high speed, sensitivity, low cost, and environmental friendliness. In this paper, we review the recent progress of chromatographic methods in the chiral separation and analysis of amino acids and provide an outlook on their development trends.
Key Words: Amino acids; Chiral separation; Chromatographic methods
手性(Chirality)起源于希腊语，表达了某种化合物和其镜像化合物不能重叠的关系，正如人的左手和右手不能完全重叠(图1)。

手性是自然界存在的一种普遍特征，在生命产生和演变过程中都有所体现。

自然界存在种类繁多的手性化合物，糖类化合物、氨基酸类化合物、有机酸、萜类化合物、生物碱等均存在手性，而氨基酸是其中重要的一类，组成蛋白质的20种基本氨基酸中只有甘氨酸不含手性碳。

氨基酸是组成蛋白质的基础小分子，光学活性和立体构象不同的氨基酸，在生命体内表现出不同的生理活性和作用。

手性氨基酸在医药、食品和化工等领域有着广泛的应用。

L-谷酰胺及衍生物是治疗胃溃疡的主要药物；L-天冬酰苯丙氨酸甲酯可以提升饮料的口感和味道，是常用的甜味剂。

No. 10doi: 10.3866/PKU.DXHX202301022219
那格列奈(N-(反式-4-异丙基环己基-1-甲酰基)-D-苯丙氨酸)，是一种在治疗2型糖尿病上有良好表现的非磺酰脲类口服降血糖药(图2)，由于其基本结构为氨基酸，决定了该药的毒性很低。

临床以反式D-异构体形式给药，其具有刺激胰岛素分泌的活性，反式D-异构体是其对映异构体活性的100倍。

因此，对于氨基酸手性异构体的分离分析具有重要意义。

图1 手性对称
(a) (b)
图2 那格列奈(a)及其L-异构体(b)
1 氨基酸手性色谱分离技术发展现状
外消旋体拆分是应用较为广泛的手性分离方法，其中色谱法速度快、灵敏度高、操作简单，是理想的手性分离方法，也是手性氨基酸分离最主要的方法[1]。

色谱法分离手性氨基酸主要有以下几种分离模式。

(1) 采用手性衍生化试剂：手性衍生化试剂与对映体反应，将其转变为一对非对映异构体，利用非对映异构体物化性质的不同，在非手性色谱柱上实现分离。

(2) 手性添加剂法：在流动相中加入手性添加剂，其与手性对映体通过静电力、氢键、配位键等方式，形成非对映体，在非手性色谱柱上实现对映体拆分。

(3) 手性固定相法：将具有手性识别能力的化合物负载在固相载体上而得到手性固定相，其与手性对映体之间通过氢键、疏水力、静电力、空间位阻效应及配位键等形成“瞬态”非对映体，基于非对映体稳定性的差异，实现对映体分子拆分。

目前，应用于氨基酸手性分离的色谱法主要有以下几种：高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、气相色谱(Gas Chromatography，GC)、超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography，SFC)、毛细管电泳/电色谱(Capillary Electrophoresis/Capillary Electrochromatography，CE/CEC)和高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)。

1.1 高效液相色谱法(HPLC)
HPLC是一种快速、高效的分离方法，已经广泛应用于氨基酸手性分离。

一种新型奎宁-冠醚组合型手性固定相，通过奎宁的离子交换作用和冠醚的络合作用对氨基酸进行手性拆分，其对12种氨基酸对映体有良好的手性拆分能力[2]。

Li等[3]报道了一种基于三唑连接的双联环糊精手性固定相在30 min内实现了丹酰-DL-亮氨酸和丹酰-DL-苯丙氨酸的完全分离。

共价有机框架(Covalent Organic Framework，COF)是通过共价键将有机单元连接的结晶有机纳米多孔材料。

手性COF是通过将手性基团引入COF结构中制备的，具有比表面积大、结构有序和孔径可调的特点，在分离方面比无定形多孔材料更有前景。

Zhang等[4]通过共价键将一系列生物分子(氨基酸、肽、酶)固定到非手性COF中，
220大学化学Vol. 38
作为HPLC的手性固定相，在正相和反相模式下，高效分离各种外消旋体(图3)。

Qian等[5]采用手性COF-乙烯二甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸酯共聚物整体柱，成功分离了组氨酸、色氨酸、半胱氨酸和丝氨酸对映体。

图3 (a) 溶菌酶共价固定的COF作为HPLC手性固定相分离手性对映体；
(b) DL-苏氨酸；(c) DL-亮氨酸；(d) DL-色氨酸[4]
1.2 气相色谱法(GC)
Frank等[6]首次使用手性固定相研究氨基酸GC分离。

GC用于分析热稳定性好、挥发性好的样品，并且检出限较低。

因为GC使用的流动相是气体，所以不会产生大量的有机废液。

氨基酸结构中存在氨基、羰基、羟基等多个极性基团，不易挥发。

进行气相色谱分离时，氨基酸中极性基团与固定液产生氢键作用力，导致不出峰、峰形拖尾、灵敏度低等问题，因此经常通过酰化、烷基化(包括硅化)和缩合将其衍生化成挥发性好且热稳定的衍生物后进行分离。

Menestrina等[7]采用氯甲酸乙酯/乙醇混合物作为衍生试剂，在(3-O-丁酰基-2,6-二-O-戊基)-γ-环糊精(Lipodex E)手性色谱柱上对牛奶中多种氨基酸衍生物进行了色谱分析。

手性金属有机骨架(Metal Organic Framework，MOF)涂层开管柱可用于手性化合物的高分辨气相色谱分离。

该柱具有优异的选择性，并且对烷烃、醇、氨基酸及其衍生物等具有良好的识别能力[8]。

多孔有机分子笼作为一种新型的多孔材料，近年来因其潜在的应用受到极大的关注。

采用聚硅氧烷(OV-1701)稀释的手性多孔有机笼作为固定相，可用于手性醇、二醇、胺、醇胺、酯、酮、醚、卤代烃、有机酸、氨基酸甲酯和亚砜的分离[9] (图4)。

图4 手性多孔有机笼用于对映体GC分离[9]
No. 10doi: 10.3866/PKU.DXHX202301022221
1.3 超临界流体色谱(SFC)
SFC是一种利用超临界流体作为流动相分离组分的技术，具有分析时间短、效率高、成本低等优点，尤其是使用二氧化碳作为流动相无毒性，使得SFC具有独特优势。

SFC利用气体的高渗透性和液体的高溶解性将物质溶解其中，被认为是GC和LC的“混合物”[10]。

与气相色谱相比，SFC可以分析更宽分子量范围的化合物，并且可以很好地检测不含发色团的化合物，在低温下分离热不稳定化合物，具有低粘度和高扩散性，使得SFC方法比HPLC快3–5倍。

Lajkó等[11]应用最近开发的基于金鸡纳生物碱的两性离子手性固定相，对大量Nα-Fmoc蛋白氨基酸对映体进行了立体选择性SFC分离。

观察到在手性柱(chiral pak ZWIX(+))上，所有D-对映体最先洗脱。

Lipka等报道了采用亚/超临界流体色谱，在多糖基手性柱上分离未衍生氨基酸对映体。

其中，基于纤维素(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的色谱柱表现出最优手性识别能力，10种氨基酸实现基线手性分离[12]。

1.4 毛细管电泳/毛细管电色谱法(CE/CEC)
CE是以毛细管为分离通道、高压直流电场驱动的一种高效液相分离技术。

由于CE具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广、仪器简单、污染小、成本低等优点，在分离科学中得到广泛应用。

20世纪80年代，Jorgenson和Lukacs [13]最先论述了使用荧光检测和毛细管电泳法实现丹磺酰化氨基酸分离。

Piehl等[14]利用微芯片CE荧光检测，以高取代磺酸基环糊精作为手性选择剂，实现了9种丹酰化氨基酸对映体的超快速分离。

CEC是HPLC和CE相结合的产物。

CEC与CE最大的不同是毛细管柱引入了色谱固定相，使CEC 同时具有CE与HPLC的分离机理。

大环抗生素是常用的手性选择性试剂，其可以与D-丙氨酸-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)末端基团结合，已成为天然氨基酸和氨基酸衍生物对映体分离的首选，尤其是对β-氨基酸对映体的分离。

Pataj等[15]在含有大环糖肽抗生素替考拉宁(Chirobiotic T或T2)或替考拉宁苷元(Chirobiotic TAG)作为手性选择剂的手性固定相上分离了8种β2-和β3-高氨基酸的对映体，Chirobiotic TAG柱对β2-高氨基酸表现出更好的选择性，而在Chirobiotic T或T2上，β3-高氨基酸对映体的分离效果更好，观察到洗脱顺序为R < S。

将开管毛细管电色谱与无鞘质谱(MS)相结合，可有效分离未衍生化的氨基酸对映体[16]。

用三维多孔层和金纳米颗粒修饰毛细管内表面，并通过Au―S键将手性选择剂巯基-β环糊精(SH-β-CD)引入表面，制备得到手性柱，大大增加了固定相的比表面积，进而提高固定相与分析物之间的相互作用(图5)。

1.5 薄层色谱法(TLC)
薄层色谱法的优势在于允许在最少或没有样品预处理步骤的情况下分析复杂样品，避免时间和材料的损失。

此外，可以在一个TLC板上同时运行多个样品。

TLC广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂类、生物碱等多种物质的分离和鉴定。

Khatri等[17]将聚乙烯醇与戊二醛和环糊精交联形成膜，用作TLC手性固定相。

该膜具有优异的对映体分离性能，成功实现了组氨酸和丝氨酸对映体分离。

图5 毛细管开管柱电色谱分离氨基酸对映体[16]
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1.6 高速逆流色谱(HSCCC)
HSCCC是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体，利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相作为固定相，另一相作为流动相，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现。

由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。

HSCCC具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域。

Xiong等[18]研究了以N-正十二烷基-L-羟基脯氨酸为手性配体，Cu(II)为过渡金属离子，通过手性配体交换HSCCC分离α-氨基酸，成功实现了5种氨基酸对映体分离。

2 氨基酸手性色谱分离存在的问题及解决方法
近些年有关氨基酸手性色谱分离的代表性文献列于表1中[2–5,7–9,11,12,14–27]。

为了进一步提高手性分离效率，开发对映体选择性更高的手性选择剂或固定相非常重要。

手性多孔材料(手性COFs、MOFs 材料、手性多孔有机笼、手性膜材料)和新型超分子结构手性固定相是有很大应用前景的选择[28,29]。

针对手性柱制备过程繁琐、耗时等问题，可以通过改进、简化手性色谱柱制备过程来解决。

为了更深入研究手性作用的机理，可以通过计算机模拟技术结合实验结果，对其进行深入探讨。

表1 氨基酸手性色谱分离
色谱分
离类型
手性选择剂手性氨基酸手性分离模式Ref.
HPLC 奎宁-冠醚组合型手性固定相色氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨
酸、异亮氨酸、苏氨酸等12种氨基酸
手性固定相[2]
双联环糊精手性固定相丹酰-DL-亮氨酸、丹酰-DL-苯丙氨酸手性固定相[3] Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺色氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、鸟氨酸、丙氨
酸、丝氨酸、谷氨酸、犬尿氨酸、天冬氨酸
手性衍生化试剂[19] C18柱串联COWNPAK CR-I (+)手性冠醚柱苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸手性固定相法[20]
3-氯-2-羟基丙基甲基丙烯酸酯和乙烯二甲基丙烯酸酯原位聚合制得产物固定β-环糊精谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、色氨酸、酪
氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸
手性固定相法[21]
COF-乙烯二甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸酯共
聚物整体柱
组氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丝氨酸手性固定相法[5]
生物分子共价固定的COF 苏氨酸、亮氨酸、色氨酸手性固定相法[4] 万古霉素手性膜苯甘氨酸手性膜结合手性
固定相法
[22]
GC Chirasil-Val毛细管手性柱20种蛋白原性氨基酸(精氨酸、脯氨酸除外) 手性固定相[23] (3-O-丁酰基-2,6-二-O-戊基)-γ-环糊精丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬氨
酸、谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸
手性固定相[7] 手性金属有机骨架(Cu-MOF) 丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸及其衍
生物
手性固定相[8]
手性金属有机骨架(Ni-MOF) 丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、谷氨酸手性固定相[24] 手性多孔有机笼亮氨酸甲酯、苯丙氨酸甲酯、脯氨酸甲酯、
丝氨酸甲酯
手性固定相[9]
(待续)
No. 10doi: 10.3866/PKU.DXHX202301022223
(续表1)
色谱分
手性选择剂手性氨基酸手性分离模式Ref.
离类型
CE/CEC 1-乙基-3-甲基咪唑L-乳酸盐色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸手性添加剂法
[25]
(手性配体交换)
手性固定相法[16] 硫醇β-环糊精-AuNPs手性柱赖氨酸、组氨酸、精氨酸、丙氨酸、异亮氨
酸、色氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、天
冬氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酸、酪氨
酸、苯丙氨酸
高取代磺酸基环糊精单酰化-色氨酸、单酰化-亮氨酸、单酰化-苯
手性添加剂法[14]
丙氨酸、单酰化-蛋氨酸、单酰化-天冬氨
酸、单酰化-氨基丁酸、单酰化-亮氨酸、单
酰化-正甲缬氨酸、单酰化-谷氨酸
8种β2-和β3-高氨基酸的对映体手性固定相法[15] 大环糖肽抗生素替考拉宁(Chirobiotic T或
T2)或替考拉宁苷元(Chirobiotic TAG)
表面印迹二氧化硅纳米粒子色氨酸手性添加剂法[26] SFC 冠醚(CROWNPAK CR-1 (+)色谱柱) 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙
手性固定相法[27]
氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、
半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、
赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸
金鸡纳生物碱两性离子手性固定相Nα-Fmoc蛋白氨基酸对映体手性固定相法[11]
手性固定相法[12] 多糖基手性柱组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨
酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、
亮氨酸、正亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸
TLC 聚乙烯醇-戊二醛-环糊精膜组氨酸和丝氨酸手性固定相法[17] HSCCC Cu(II)-N-正十二烷基-L-羟基脯氨酸5种α-氨基酸(苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨
手性添加剂法[18]
酸，正亮氨酸，缬氨酸)
3 总结与展望
氨基酸是组成蛋白质的基础单位，氨基酸手性对映体分离具有重要研究意义。

本文介绍了目前应用于氨基酸手性分离的主要色谱分析方法，并讨论了各种分析方法的特点和应用范围。

开发新的高性能分离手段、开发新型多功能手性复合材料、探索多种手性拆分试剂联合使用以提高手性氨基酸拆分效率，并结合计算机模拟技术深入探讨手性作用机理，是未来氨基酸手性分离分析的发展方向。

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