第二节细胞培养方法及应用实例

配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
封闭式中空纤维反应器循环系统
中空纤维反应器因其剪力小被广泛运 用于动物细胞的培养。
中空纤维反应器主要由中空纤维管组 成，中空纤维管的内径为200μm，壁厚为 50～70μm。管壁是多孔膜，O2 和CO2等小 分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附 在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获 取氧气。
将新鲜细胞固定在由聚丙烯材料编织成的
培养床
无菌平垫（床）上，通过储液罐下方管道滴注
培养液。培养床上的培养液再经过蠕动泵循环
送回储液罐中。 平床细胞培养系统设备较简单，比悬浮细
平床培养系统示意图
胞培养能更有效地合成次级代谢产物。
⑵立柱细胞培养系统
进液管
立柱培养系统同样是由培养床、储液罐和
蠕动泵等部件构成。
动物脾脏有上百万种不同的 B淋巴细胞系，重排 后具有不同基因不同的 B淋巴细胞合成不同的抗体。 当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别 浆细胞 激活各个具有不同基因的 B细胞。被激活的 B细胞分裂增殖形成效应 B细 胞（浆细胞）和记忆 B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分 子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行 培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群——单克隆。
储液罐
立柱式细胞培养系统主要用于植物细胞培 养。
蠕动泵
该培养系统是将植物细胞与琼脂或褐藻酸 钠混合，制成2－3cm3的细胞团块，并将其集中 于无菌立柱中。
培养床
这样，由储液罐滴注的培养液流经大部分 细胞——“滴液区”比例与平床培养系统相比， 将大大提高。
立柱培养系统示意图
问题思考与讨论
8－5 常见的动物、植物组织细胞培养方法有哪几种？ 8－6 什么是细胞的固定化培养？ 8－7 什么是愈伤组织？
动物细胞的固定化易于细胞与产物的分离及产品的纯化。因此，固定 化是实现动物细胞高密度长期培养、从而提高生物反应器生产效率的重要 技术途径。
常见的固定化方法有：吸附法、共价贴附法、交联法和包埋法等。
⑴吸附法 所谓吸附法是指：用固体吸附剂将动物细胞吸附在其表面，从而使细
胞固定化。 吸附法的主要优点是：操作简便、条件温和；其主要缺点是：载体的
负荷能力低，细胞易脱落。
⑵共价贴附法 所谓共价贴附法是指：利用共价键将动物细胞与固体载体结合的细胞
固定化方法。 共价贴附法连接键非常牢固，能有效地减少细胞泄漏；因化学试剂的
引入，对细胞的活性有一定的影响。
⑶交联法 使用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基、羧基
等进行交联，形成共价键来固定细胞，其结合力是共价键。此法制备的细 胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大。
3.固定化细胞培养设备
细胞到生长后期，其生长速度降低，有利于细胞分化及次级代谢产物 积累，则需对其进行固定化培养。
固定化培养有利于细胞组织化，易获得高密度细胞群体，易于控制培
养条件及获得代谢产物。 ⑴平床细胞培养系统
进液管
平床培养又称为平板培养，该系统是由培
蠕动泵
养床、储液罐和蠕动泵等部件构成。
储液罐
流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪 流感、禽流感和人流感三种流感病毒 的基因片段。
人群对甲型H1N1流感病毒普遍易 感，并可以人传染人。
⑵甲型H1N1流感疫苗的生产流程
原始种子 （基因重组病毒株）
病毒接种
增殖培养
生产前准备
生产用病毒种子 病毒接种
病毒纯化液
浓缩纯化
病毒灭活液
病毒灭活 病毒液 病毒培养 病毒培养
四、动物细胞工程应用实例
20世纪60年代为了满足生产疫苗的需要，开始运用动物细胞大规模培 养技术。后来随着动物细胞大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发 展与应用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术生产大分子药用蛋白质 比原核细胞表达系统更有优越性。
1.甲型H1N1流感疫苗的生产
⑴甲型H1N1流感病毒 甲型H1N1流感病毒与其它季节性
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密
度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和
接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包
括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
3.固定化培养
所谓固定化培养是指，将动物细胞与不溶性载体结合起来进行培养的 方法。简单地，说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的 过程。
分离
破壁
植物细胞
原生质体
接种、培养
愈伤组织
分化培养
驯化移栽 试管苗
生根培养
生根
长出茎、叶
3.花粉培养
在无菌条件下取出花药或花粉粒（小孢子），置于培养基上进行人工
培养，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株。
花粉愈伤组织
接种花药 花粉植株
单倍植株
三、细胞培养反应器
细胞培养反应器种类繁多，根据细胞的培养方式不同，可将其分为悬 浮培养反应器、贴壁培养反应器及固定化培养反应设备等。
单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单 克隆抗体是由一种类型的细胞制造出来的抗体。
②单克隆抗体技术的基本原理
要制备单克隆抗体，首先需获得能合成专一性抗体的单克隆 B淋巴细
胞，但这种 B淋巴细胞不能在体外生长。
实验发现骨髓瘤细胞可在体 外生长繁殖，应用细胞杂交技术
B细胞 HGPRT+
⑵主要优点 细胞紧密黏附于固相表面，易更换培养液；易采用灌注培养，从而达
到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统；适用于所有类 型细胞。 ⑶主要缺点
与悬浮培养法相比：扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能 有效监测细胞的生长。 ⑷细胞贴壁的表面
要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷 密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。
苗，必须对其进行扩增培养，制备病毒种子批。
②生产前准备 无菌生产鸡胚
选胚
原始种子 （基因重组病毒株）
病毒稀释
【选胚】 培养生产用病毒种子需要无菌生产
的 9—11日龄鸡胚。 要求鸡胚的外壳为白色、整洁，透
光性好，在暗室光源的照射下，可以清 晰地看到鸡胚里的血管等，这样可以很 容易剔除弱胚、死胚等。
培养基 接种
超滤浓缩 浓缩液
层析 层析液
洗脱
or
密ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ梯度 蔗糖液 离心法
超滤
裂解剂 超滤液
裂解
蔗糖
除菌过滤
疫苗产品
分包
配比
病毒纯化液 病毒纯化液检定
2.HBsAg单克隆抗体的生产
⑴单克隆抗体 ①单克隆抗体
抗体是由 B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分 泌的。每一个 B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重 排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。
增殖培养 生产用病毒种子
【接种、培养】 将稀释后的病毒种入选择的鸡胚尿囊
腔中，随后将鸡胚放入密闭、无菌、恒温 的孵化箱中繁殖病毒。最后从鸡胚尿囊腔 里中液体中得到疫苗生产用的种子。
③病毒培养 原始种子
生产前准备
生产用病毒种子
将得到的生产用病毒种子接种到无菌鸡胚中进行 培养，得到病毒液。
病毒接种
（鸡胚）
等方法。
1.愈伤组织培养
什么是愈伤组织？
所谓愈伤组织培养是指，将外植体接种到人工培养基上，在激素作用
下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。
切取 植物组织 接种
(消毒)
培养
MS培养基
愈伤组织
试管苗
生根培养
长出茎、叶
资料卡片
愈伤组织（callus）
在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下 来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成 新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。
相当弱。因此，传统用于微生物的搅拌反应器
用作细胞的培养，须对搅拌方式加以改进。
5L 细胞培养罐
⑴供氧方式的改进 一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为动物细胞生长提供所需氧
分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以须供氧方式上进行改进。 笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔
病毒培养
病毒液
清洗
消毒
接种
④病毒灭活 世卫组织提供给疫苗生产厂家
的毒种尽管感染性很低，但由于仍 然是活的病毒，所以还需要对生产 出来的病毒进行灭活处理以去除病 毒的致病力。
通过往病毒收获液中加入灭活 剂（如：甲醛），破坏病毒外壳的 酯类成分，使其丧失感染正常细胞 的能力。
在进入下一工序前，须对病毒灭活液进行 灭活试验，确保疫苗已经灭活——得到病毒灭 活液。
例如：将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（A0或A1亚型）疫苗株
经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（A2亚型）活流感病毒一同培养，产生出
具有前者特点的A2亚型流感病毒，可供制作疫苗。
基因重组病毒株原始种子保留了病毒的抗原性和复制能力，降低了病
毒的致病力（由世卫组织提供）。
因为世卫组织提供的基因重组病毒株量较少，不足以进行批量生产疫
2.悬浮培养
悬浮培养是对非依赖性细胞培养的一种
方法。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择
也可用此方法培养。
悬浮培养投资较小，扩大培养规模简单
（只须增大培养体积）。如：淋巴细胞的培
养可采用悬浮培养法。
在悬浮培养过程中应注意及时进行细胞
继代培养，因为当培养物生长到一定时期将 进入分裂的静止期。
细胞悬浮培养瓶
开，不与细胞直接接触。这样，反应器既能保证混合效果又有尽可能小的 剪切力，以满足细胞生长的要求。
⑵搅拌浆的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的
改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。 例如：采用双螺旋带状搅拌桨，并在顶部法兰盖安
装 3块表面挡板。挡板以相对于径向的夹角为30°垂直 插入液面。
病毒收获机
病毒液
O 灭活剂(HC－H)
病毒灭活
2－8℃ 7～10D
灭活试验及 其它检验
病毒灭活液
⑤浓缩纯化 病毒灭活液中有很多的杂质，必须加以纯化，以保留病毒作为疫苗的
有效成分—抗原，去除病毒灭活液中的其它杂质，避免这些杂质对人体产 生不良反应。病毒灭活液的浓缩纯化有多条路线可走。例如：
病毒灭活液
1.悬浮培养反应器——搅拌式反应器
常见的悬浮培养反应器如：搅拌式反应器、液体循环式反应器和鼓泡
式反应器等类型，其工作原理与相应的微生物反应器（发酵罐）相同。
对于动物细胞，因没有细胞壁的保护，对
搅拌剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容
易对其造成损害。
同样，植物细胞的纤维素细胞壁虽然使细
胞具有很强的抗张强度，却使其抗剪切的能力
愈伤组织在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便 开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。
在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的 愈伤组织，大致要经历三个时期。即：启动期（细胞 准备进行分裂期）、分裂期和形成期。
2.原生质体培养
取植株的幼胚、根、茎或叶等组织细胞，用纤维素酶或果胶酶除去植 物体细胞的细胞壁（原生质体），在培养基上生长分裂，通过愈伤组织诱 导分化长出茎、叶，再长出根形成植株。