(整理)凝胶层析法测定蛋白质分子质量.

凝胶层析法测定蛋白质分子质量
一、实验目的
1.了解凝胶层析（Gel Chromatography）的原理及其应用。

2.通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。

二、实验原理
凝胶层析又称凝胶排阻层析（Gel Exclusion Chromatography），凝胶过滤（Gel Filtration），渗透层析（Gel Permeation Chromatography）或分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）等。

它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。

凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。

测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。

凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。

用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。

即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。

分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。

一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。

这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数K
av
（分离化合物在内水和外水体积中
的比例关系）表示，K
av 值的大小和凝胶柱床的总体积（V
t
）、外水体积（V
）以
及分离物本身的洗脱体积（V
e ）有关：K
av
=（V
e
-V
）/（V
t
-V
）。

在限定的层析条件下，V
t 和V
都是恒定值，而V
e
是随着分离物分子质量的变
化而改变。

分子质量大，V
e 值小，K
av
值也小。

反之，分子量小则V
e
值大，K
av
值
大。

有效分配系数K
av
是判断分离效果的一个重要的参数，同时也是测定蛋白质
分子质量的一个依据。

在相同层析条件下，被分离物质K
av
值差异越大，分离效果越好。

反之，分离效果差或根本不能分开。

在实际的实验中，我们可以实测出
V t 、V
及V
e
的值，从而计算出K
av
的大小。

对于某一特定型号的凝胶，在一定的
分子质量范围内，K
av 和lgM
r
成线性关系：
K
av
= -blg Mr + C 其中b，C 为常数。

同样可以得 V
e
= -b’ lg Mr + C’,其中'b、'C为常数。

可以通过在一凝胶柱中分离多种已知分子质量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其他未知蛋白的分子质量。

三、实验仪器和实验试剂
（一）器材
1.玻璃层析柱。

2.HL-1型恒流泵。

3.BSE-100型自动部分收集器。

4.8823B紫外检测仪。

5.SPECORD-200紫外分光光度计。

6.TYPE3057 Portable Recorder记录仪。

7.100ml试剂瓶。

8.50ml、100ml量筒各一个。

9.50ml、100ml、250ml、500ml烧杯各一个。

10.10ml刻度试管。

11.胶头滴管。

12.玻璃棒。

（二）试剂
1.标准蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mr=67 000（上海生化所）
（2）鸡卵清清蛋白： Mr =45 000（美国SIGMA公司）
（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mr =24 000
（4）溶菌酶： Mr =14 300
2.未知蛋白样品（由实验室制备）
3.洗脱液0.025mol/L KCL-0.1 mol/L HAC
4.蓝色葡聚糖-2000
四、实验操作和具体过程
（一）凝胶的溶胀
称取7g Sephadex G-75 于250 ml烧杯中加入洗脱液100ml，置于室温溶胀2~3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去处凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2~3小时（可去处颗粒内部的空气以及灭菌）。

（二）装柱
1.取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。

2.凝胶柱总体积（V t）的测定：
在距离柱上端5cm处作一个记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积V
t。

也可以最后走完未知蛋白后
再测定V
t。

3.在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，流速一般用5~6ml/10min。

胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。

然后关闭出水口，静置片刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1~2倍柱床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。

（三） V
0和未知蛋白V
e
的测定
按实验要求安装和连接好各种仪器。

把记录仪的记录时间调节到2cm/h，调节恒流泵的速度为5~6ml/10min，紫外检测仪置于0.5A档。

检查无误后再开始下一步操作。

吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，可覆盖一张滤纸或尼龙网）。

打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。

用细滴管吸取0.5ml（5mg/ml）蓝色葡聚糖-2000和未知蛋白（8mg/ml）的混合液，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口（开始收集！），待溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用5~6ml/10min的速度开始洗脱，自
动收集器收集时间为5min每管。

最后作出洗脱曲线。

收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0。

继续收集洗脱液，直至未知蛋白洗出，以洗脱液作空白参比，紫外分光光度计280nm处比色，测出最大吸收峰。

注意：蓝色葡聚糖和未知蛋白洗下来之后，还要用洗脱液（1~2倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。

（四）标准曲线的制作
1.用洗脱液配制标准蛋白溶液供全班使用，溶液中三种蛋白的浓度各为：牛血
清清蛋白（5mg/ml）、鸡卵清清蛋白（8mg/ml）、胰凝乳蛋白酶原（5mg/ml）、溶菌酶蛋白（5mg/ml）。

2.在装样前应该测定此时的柱床体积，因为该体积可能和上次不同，如果有变
化则应在之后的计算中进行修正。

3.按（三）的操作方法加入上述标准蛋白溶液0.5ml，以5~6ml/10min的速度洗
脱并收集洗脱液。

注意控制每管的流速为1.5~1.8ml/3min/管。

此时把紫外检测仪置于0.2A档。

4.用紫外分光光度计逐管测定A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后量出。

各种蛋白的洗脱体积V
e
5.以A280为纵坐标，V e为横坐标画出标准蛋白的洗脱曲线。

6.以K av为纵坐标，LogM r为横坐标作标准曲线。

7.以V e为纵坐标，LogM r为横坐标作标准曲线。

8.在标准曲线上查出未知蛋白的LogM r，其反对数便是待测定蛋白质的分子质
量。

9.在实验完毕后，必需将凝胶回收处理，以备下次使用，严禁将凝胶丢弃或倒
入水池中。

五、实验结果和讨论
（一）实验结果的原始数据
（1）恒流泵设定流速：5.4ml/10min (测定蓝色葡聚糖+未知蛋白)
5.8ml/10min (测定标准蛋白)
（2）自动部分收集器设定：3.2ml/5min55s/管 (测定蓝色葡聚糖+未知蛋白) 3.2ml/5min30s/管(测定标准蛋白)
（3）层析柱内凝胶总体积V
t （即柱床体积）：V
t
=99ml (测定蓝色葡聚糖+未知
蛋白)
V
t
=98.4ml (测定标准蛋白) （4）洗脱液A280吸光度测定数据：具体数据请见下表（表1和表2）
表1 蓝色葡聚糖+未知蛋白A280吸光度测定数据
（蓝色消失后测得各管吸光值如下）
表2标准蛋白质A280吸光度测定数据
（5）凝胶层析洗脱体积数据记录：洗脱体积请见下表（表3和表4）
表3 蓝色葡聚糖+未知蛋白洗脱体积数据
表4标准蛋白质洗脱体积数据
1.实验数据的处理
（1）凝胶层析柱柱床体积Vt：
=99ml
测蓝色葡聚糖+未知蛋白时：V
t
=98.4ml
测标准蛋白时： V
t
（2）利用表1中的数据作标准蛋白的洗脱曲线。

以收集管数（由于每管收集的体积为3.2ml，所以管数X3.2ml即为洗脱体积）为横轴，以280nm的吸光度值为纵轴，做出连续的平滑曲线，如下图1所示。

图1 标准蛋白洗脱曲线
从此图中可以看到三个吸收峰分别在第11管、第23管和第32管左右出现，由于三种标准蛋白的分子量依次减小，而分子量大的蛋白会先洗脱出来，所以其中第一个峰为牛血清白蛋白（Mr=67,000）的吸收峰，第二个峰为鸡卵清清蛋白（Mr =45,000）的吸收峰，第三个峰为胰凝乳糖蛋白酶原A （ Mr =24,000)的吸收峰。

未知蛋白的洗脱体积V e 也通过量筒测出。

各蛋白有效分配系数K av 和洗脱体积的计算和标准曲线的绘制
根据有效分配系数的计算公式，()/()av e o t o K V V V V =--， 其中凝胶柱的总体积在两次测量时是可能是不同的，所以在计算未知蛋白的有效分配系数和标准蛋白的有效分配系数时，应分别采用不同的凝胶柱床的总体积V t =99ml 和V t ’=98.4ml ，不过由于在实际实验中我们两次进行凝胶层析的柱床体积相差很小（体积差不到0.6ml ），所以可以认为柱床体积是稳定的。

而外水体积（即蓝色葡聚糖的洗脱体积）V o ＝35.2ml 。

数据计算结果见下表5。

表5原始数据计算汇总表
由于在一定的分子质量范围内，Kav 与lgMw 成线性关系：lg av r K b M c =-+，其中b, c 为常数。

以标准蛋白质的分子量的lg 值即lg(Mr)为横坐标，以有效分配系数为纵坐标，对Kav 和lgMr 做线性拟合，结果见下图3：
图3 有效分配系数Kav 与蛋白质分子量的lgMw 值线性拟合的标准曲线 线性拟合方程为Kav=-2.1418lgMw+10.408，相关性系数的平方R 2=0.9624，线性程度很好。

根据这一标准曲线可以由未知蛋白的有效分配系数K av 计算未知蛋白的分子量。

根据同样的原理洗脱体积V e 也是和lgMw 成线性关系的，以标准蛋白质的分子量的lg 值即lg(Mw)为横坐标，以洗脱体积V e 为纵坐标，对Ve 和lgMw 做线性拟合，结果见下图4：
与蛋白质分子量的lgMw值线性拟合的标准曲线
图4 洗脱体积V
e
=-135.36lgMw+692.99，相关性系数的平方R2=0.9624，线线性拟合方程为V
e
计算未知蛋白的性程度很好。

根据这一标准曲线可以由未知蛋白的洗脱体积V
e
分子量。

2.未知蛋白分子质量的计算
未知蛋白质的有效分配系数为Kav=0.384012539, 根据标准曲线的线形拟合公式可以计算出未知蛋白的lgMr=4.680169699, 所以未知蛋白的分子量的值为Mr=47,882。

未知蛋白质的有效分配系数为Ve=59.7ml, 根据标准曲线的线形拟合公式可以计算出未知蛋白的lgMr=4.678560875, 所以未知蛋白的分子量的值为Mr=47,704。

以上结果汇总为下表6
表6最终计算结果汇总表
3.实验结果的讨论
(1)对未知蛋白质分子量计算结果的讨论。

根据有效分配系数K
av
计算得到的未知蛋白质分子量为Mr=47,882，根据洗脱
体积V
e
计算得Mr=47,704。

二种方法所得到的数据基本一致，两者相差178，相对差值约为0.4%，在实验过程所允许的范围之内。

但是，理论上讲两种计算方法的结果应该是一致，造成误差的原因可能是第一次层析蓝色葡聚糖和未知蛋白之后，凝胶洗脱不充分，并且第二次层析标准蛋
白这个过程中凝胶柱床V
t 很可能发生变化。

而且由于同样的原因，外水体积V
o
也会发生变化。

因此，两次层析实验过程中凝胶的物理性质即相关物理参数并不
完全一致，导致由分配系数K
av 和由洗脱体积V
e
分别计算的Mr不一致。

不过，由
于总体上凝胶的各种性质并没发生明显的变化，所以最终所测得的未知蛋白分子质量相差很小。

（2）关于加样后加洗脱液引起的实验误差的分析
加样操作过程产生的方法误差：因为加入样品后即开始收集，而我们最后计算洗脱峰位置是根据收集的管数乘以每管计算得到的设定收液体积。

所以在样品渗入胶床后停止收集液体再加入少许洗脱液润洗管壁的时间内我们没有收集液体，但自动收集器仍在记时，所以该管液体量应该少于设定的每管收液体积。

在数据处理过程中，我们对该管仍按设定的每管3.2ml计算。

所以该时间段直接
产生测量误差。

其大小主要取决于操作者的熟练程度。

所以我们在实验中应该尽量缩短该时间。

（3）实验中可能造成结果误差的原因分析。

第一，在实验相关参数测定中的系统误差和偶然误差。

由于在测量柱床体积
V t ，外水体积V
o
，洗脱体积V
e
时使用了量筒等测量工具，所以由于这些工具所带
来的系统误差是很难完全避免的。

同时，由于本次实验中每次层析实验只进行了一次，所以人为测量中的偶然误差也是很可能出现的。

所以，如果能够多次重复实验，并将每次实验的结果取平均值，应该能够在一定程度上使得最终测定的未知蛋白质分子量更加准确。

第二，由于两次进行凝胶层析时所设定的恒流泵流速不同，因此可能导致在两次层析过程中分离效果不同，从而导致最终结果的误差。

第一次层析过程中由于两个洗脱峰的间距较大，所以使用了 2.75ml/5min/管的速度；而第二次前两个洗脱峰的间距很小，为使得两个洗脱峰能够充分分离，所以使用了1.6ml/3min/管的速度。

因此，洗脱速度的不同可能导致两次实验的层析效果有一定的差别。

由于这个差别，将用测定标准蛋白所得的标准曲线应用于未知蛋白时可能会产生误差。

第三，我们所测的洗脱体积和实际洗脱体积一般情况下是不一致。

这是因为我们在用量筒测定体积时是把整管的收集液加入量筒中，所以所得体积一般不是洗脱峰峰值所对应的实际洗脱体积。

不过由于两次层析时每管的体积只有2.75ml和1.6ml，所以最终体积的误差最多不会超过一个收集管的体积。

因此在这个误差范围内，实验中用量筒测得的洗脱体积不会和实际体积有显著的差别。

（4）实验中注意事项
各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。

操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。

装柱要均匀，不过松也不过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。

但也不宜过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。

始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。

也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。

洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果。

洗脱速度保持3-6ml/min，如果在洗脱速度太高，样品与凝胶将具有更少的时间来达到平衡，从而导致较差的分离。

太低的洗脱速度，样品的扩散不能被忽略，并且将需要更多的时间。

操作压过大可使流速变慢，此外还可以导致凝胶胶面下降，柱床容积的改变，相应测出Vt，Vo，Ve等也改变，造成实验结果的误差。

使用部分收集器时，将其转盘调节到最外圈，从第一管开始，否则会造成转换臂的转动与转盘不同心，以致洗脱液流到管外。