利拉鲁肽对脑梗死小鼠保护作用的研究

利拉鲁肽对脑梗死小鼠保护作用的研究
祝春华　刘亚强　郭家辉
【摘要】　目的　探讨利拉鲁肽对实验性脑梗死小鼠的保护作用及分子机制。

方法　C57BL/6小鼠随机分为假手术组、对照组和利拉鲁肽组。

烧灼法建立永久、局灶性右侧皮质梗死模型（dMCAO），假手术组仅分离血管。

利拉鲁肽组于dMCAO 术后连续3d 分别给予腹腔注射利拉鲁肽（200μg·kg -1·d -1），对照组腹腔注射等体积生理盐水。

TTC 染色方法计算脑梗死体积，Rota-rod 方法评价肢体功能。

术后72h 时采用Western blot 测定三个实验组p-AMPK/AMPK 和NF-κB 蛋白水平。

结果　利拉鲁肽明显延长dMCAO 小鼠的Rota-rod 时间（52.22 ±4.588 s），并缩小梗死体积（0.0791 ±0.0025），上调p-AMPK 蛋白水平和p-AMPK/AMPK 比值，抑制NF-κB 表达。

结论　利拉鲁肽减轻dMCAO 小鼠炎症反应和缺血性脑损伤，激活AMPK、抑制NF-κB 是利拉鲁肽保护缺血性脑损伤的分子机制。

【关键词】　脑梗死；利拉鲁肽；腺苷酸活化蛋白激酶；核因子-κB
中图分类号：R734.32 文献标识码：A 文章编号：1006-351X（2020）10-0605-04Study on the protective role of liraglutide in experiment cerebral ischemia
Zhu Chunhua , Liu Yaqiang, Guo Jiahui. Department of Neurology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China
Correspondingauthor:ZhuChunhua;Email:*********************
[Abstract]　Objective To investigate the role of liraglutide in the focal cerebral ischemia of mice and the
potential mechanisms. Methods C57BL/6 mice were randomly divided into sham-operated group, vehicle group and liruglutide group. A standard model of permanent distal middle cerebral artery occlusion (dMCAO) was performed, the isolated carotid artery was separated only in sham-operated group. Liraglutide (200μg·kg -1·d -1) was injected intraperitoneally for liraglutide group mice for 3 consecutive days, and physiological saline was injected intraperitoneally for vehicle group mice. The infarct volume was measured by TTC stain, neurological function was evaluated by Rota-rod test. At 72 h, p-AMPK/AMPK and NF-κB protein were assessed by Western blot. Results Liraglutide treatment obviously increased the time of Rota-rod test, decreased infarct volume, up-regulated p-AMPK level and p-AMPK/AMPK, as well as inhibited NF-κB expression. Conclusion Liraglutide attenuated inflammatory responses and ischemic brain injuries. And the activated AMPK and inhibited NF-κB were involved in its the molecular mechanisms and protective role.
[Key words]　Cerebral ischemia; Liraglutide; Adenosine monophosphate activated protein kinase; Nuclear factor-kappa B
·论　著·
基金项目：河北省青年科学基金(H2016206373)
作者单位：050000　石家庄，河北医科大学第二医院神经内科
糖尿病是脑梗死的独立危险因素，也是脑梗死患者预后不良的重要原因。

利拉鲁肽（liraglutide）是治疗2型糖尿病和肥胖的安全、有效药物。

利拉鲁肽是胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）的类似物，具有97%的生物同源性。

GLP-1是一种主要由肠道L 细胞分泌的肠促胰岛素，能够促进胰腺β细胞以葡萄糖浓度依赖的方式分泌胰岛素，在调节机体血糖代谢中具有至关重要的作用。

GLP-1通过与GLP-1受体结合，促进胰岛素信
号通路相关的信号传递，如蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)等。

胰岛素信号通路在促进神经细胞的生长、突触重塑以及促进学习和记忆等方面有重要作用[1-2]。

研究表明，GLP-1及其相关分子对脑梗死有神经保护作用[3]。

利拉鲁肽与GLP-1类似，能够自由通过血-脑脊液屏障（blood-brain barrier, BBB）进入脑组织，且GLP-1受体广泛分布于中枢神经系统大脑皮质，
因此，利拉鲁肽在神经保护方面很可能具有潜在的价值[2]。

因此，作者通过脑梗死小鼠模型，深入探讨利拉鲁肽调控血糖代谢之外的神经保护作用及其分子机制，具有重要的临床意义。

材料与方法
一、实验材料
1. 实验动物
健康雄性C57BL/6小鼠，8~10w，体质量22~25g （由北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。

2. 试剂和仪器
利拉鲁肽（C172H265N43O51，3751. 20 Da，丹麦诺和诺德公司）；兔抗p-AMPK/AMPK多克隆抗体（Affinity Biosciences公司）；兔抗NF-κB单克隆抗体（美国Santa Craz）；Rotarod圆筒(Ugo Basile 47600, Biological Research Apparatus，意大利)
二、实验方法
1.实验分组
C57BL/6小鼠，随机进入假手术组、对照组和利拉鲁肽组。

采用远端动脉烧灼法建立持续性右侧大脑中动脉闭塞（dMCAO）模型[4]。

利拉鲁肽组于术后给予利拉鲁肽（200 μg·kg-1·d-1）腹腔注射，持续3d；对照组每天则予等体积生理盐水腹腔注射；假手术组仅分离血管。

2.血糖监测
采用罗氏血糖仪，分别测定对照组和利拉鲁肽组术前、术后24 h、48 h、72 h的血糖数值。

3.Rota-rod评价肢体功能
所有小鼠术前每日训练3次，连续3d，Rotarod 圆筒5min内从4转到40转/分匀速加速。

剔除不能在圆筒上停留1min的小鼠。

术后72 h时，采用单盲法，测试每只小鼠3次，记录其平均时间。

4.脑梗死体积测定
dMCAO模型完成后72 h，断头取小鼠大脑，冠状切成均匀5片，在2%TTC溶液中染色，置于37 ℃温箱30 min，再于4 %多聚甲醛液中浸润固定24 h。

脑梗死体积（%）公式：（矫正右侧梗死体积 / 非缺血左侧半球体积）×100%。

5.p-AMPK/AMPK和NF-κB蛋白水平测定
对照组和利拉鲁肽组动物取右侧脑梗死病灶周围皮质，假手术组取相应部位的大脑皮质脑组织，Western blot方法测定p-AMPK/AMPK和NF-κB蛋白表达水平，β-actin作为内参。

三、统计学方法
应用SPSS 13.0软件进行统计分析，结果均以x-±s表示，三组数据之间比较时，进行方差齐性检验和方差分析（ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果
1.利拉鲁肽对实验小鼠血糖的影响（图1）
图1　两组各个时间点血糖之间差异无统计学意义（P > 0.05）
通过连续测定术前、术后24 h、48 h、72 h的血糖，在每个时间点，对照组和利拉鲁肽组的血糖比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

与术前血糖相比，两组术后每个时间点的血糖稍有下降，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.利拉鲁肽改善肢体神经功能（图2）
图2　与对照组比较，P ＜ 0.05
dMCAO后72 h，与对照组比较，利拉鲁肽组显著延长Rota-rod时间（P ＜ 0.05），表明有明显的肢体神经功能改善。

3.利拉鲁肽有效减小脑梗死体积（图
3）
图3　A: TTC染色显示苍白色脑梗死病灶；B:与对照组相比，P ＜ 0.05
NF-κB β-actin
A：各组NF-κB 蛋白表达
B：各组NF-κB 蛋白表达比较
图5　与假手术组比较，P ＜ 0.05；与对照组相比，P ＜ 0.05
假手术组 对照组 利拉鲁肽组
假手术组 对照组 利拉鲁肽组 A TTC 染色显示苍白色的部分为脑梗死病灶。

假手术组无脑梗死病灶，对照组、利拉鲁肽组可见有大小不等的白色脑梗死病灶。

与对照组（0.1356 ±0.0080）相比，利拉鲁肽治疗组（0.0791 ±0.0025）的脑梗死体积明显减小（P ＜ 0.05）。

4.利拉鲁肽能够上调p-AMPK/AMPK（图4）
A: 各组p-AMPK 和AMPK 蛋白表达
B：各组p-AMPK/AMPK 比值
图4　与假手术组比较，P ＜ 0.05；与对照组相比，P ＜ 0.05
Western blot 结果显示：与假手术组比较，对照组p-AMPK 蛋白水平和p-AMPK/AMPK 比值（0.5575±0.09431）明显下降（P ＜ 0.05）；与对照组比较，利拉鲁肽组p-AMPK 表达和p-AMPK/AMPK 比值（0.8217±0.05390）明显恢复，（P ＜ 0.05）。

三组AMPK 蛋白水平差异无统计学意义。

5.利拉鲁肽能够下调NF-κB 蛋白表达水平 （图5）
Western blot 结果显示：与假手术组相比，对照组NF-κB 蛋白水平明显升高（3.908±0.6847，P ＜ 0.05）；与对照组比较，利拉鲁肽组NF-κB 表达明显下调（2.183±0.5069，P ＜ 0.05）。

讨　论
炎症反应是脑梗死/脑缺血后最重要的病理损伤机制之一，NF-κB 是一种至关重要的核转录因子，
在炎症反应中调节多种促炎细胞因子的表达，也使其成为抗炎治疗的靶点[5]。

研究证明，抑制NF-κB 以及相关的炎症反应能够改善脑梗死预后[5-6]。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)被称为能量感受器，是细胞感应外界环境变化并调整能量代谢的关键分子。

当细胞内ATP 耗竭、能量缺乏时，AMPK 发生磷酸化和激活，调控细胞能量代谢以及线粒体稳态等以恢复能量平衡[7]。

研究表明，激活的AMPK 通过抑制NF-κB 介导的炎症反应，保护脑缺血/再灌注损伤[6,8]。

越来越多的研究表明，利拉鲁肽对脑梗死、帕金森病、阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病具有神经保护作用，且分子机制多与调控炎症反应以及相关分子通路有关[9-12]。

在脑梗死模型的研究发现，利拉鲁肽通过上调Bcl-2下调Bax 减轻急性期缺血性脑损伤[11]；在脑梗死模型恢复期，利拉鲁肽能够促进血管新生，改善预后[12]。

本文观察了利拉鲁肽对脑梗死模型的神经保护作用，利拉鲁肽明显改善了脑梗死小鼠的肢体功能，显著减小了脑梗死体积；首次观察利拉鲁肽上调p-AMPK 蛋白水平以及p-AMPK/AMPK 比值并抑制NF-κB 表达，减轻了脑梗死后炎症反应，是利拉鲁肽神经保护的分子机制。

而术后连续3d 的利拉鲁肽治疗，并未对实验小鼠的血糖产生不利影响。

Wiciński 等[9]对利拉鲁肽的神经保护作用进行了系统总结，认为利拉鲁肽通过抗凋亡、抗氧化应激等机制减轻早期缺血性脑损伤，并影响神经血管单位及其重塑，直接关系到脑梗死的预后。

利拉鲁肽还能够减轻NF-κB 介导的炎症反应[6]、抑制动脉粥样硬化斑块的早期形成并维持其稳定[13-14]。

此外，利拉鲁肽通过激活PI3K/MAPK 通路，增加脑脊液中Aβ转运体水平，促进Aβ的转运和清除，对阿尔茨海默病有保护作用[9,16]。

结合作者的结果可以得出结论，利拉鲁肽不仅能够安全有效的调控血糖，而且具有抗炎、抗凋亡和脑保护作用，同时对脑梗死和阿尔茨海默病有治疗价值。

参　考　文　献
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（收稿日期：2020-01-20）
伴或不伴不典型失神发作的Lennox-Gastaut syndrome患儿电生理分析
张　静　靳　梅　陈　玲　杜雅坤　孙素真
【摘要】　目的　分析在儿童Lennox-Gastaut syndrome（LGS）脑电图特点及其与事件相关电位P300的
关系,为临床评估及早期干预治疗提供神经电生理学依据。

方法　选取LGS患儿有不典型失神发作者25例(不
典型失神组)，无不典型失神发作者16例(无不典型失神组)，及与其性别、年龄、文化程度相匹配的健康志
愿儿童13例(对照组),收集其视频脑电图( videoelectroencephalogram, VEEG)资料及P300的潜伏期和波幅并进
行回顾性分析。

结果　①治疗前，不典型失神组、无不典型失神组与对照组在VEEG背景活动和P300潜伏期
上差异有统计学意义(P<0.05)；②治疗后，不典型失神组与无不典型失神组的P300潜伏期和VEEG背景活动
差异有统计学意义(P<0.05)，VEEG发作频率差异无统计学意义(P>0.05)；③与治疗前相比，两组的P300潜伏
期、VEEG背景活动及发作频率差异均有统计学意义(P<0.05)；④患儿治疗前后的VEEG背景活动与P300潜
伏期之间呈负相关关系(r=0.629，P=0.000；r=0.685，P=0.000)。

结论　LGS患儿中有不典型失神发作者比无不
·论　著·
作者单位：050031 石家庄，河北省儿童医院神经内科
通信作者：孙素真，Email:*********************。