汞离子功能核酸生物传感器的建立与应用

汞离子功能核酸生物传感器的建立与应用
杜再慧;李相阳;田晶晶;田洪涛;许文涛
【摘要】利用汞离子(Hg2+)特异性功能核酸对Hg2+识别检测,其中模板主要包括与Hg2+特异性结合的识别区、形成G四链体的富G区以及由聚六乙二醇(Spacer18)链接的隔断区;靶序列主要包括5'端配对区和3'端富T区.模板与靶序列只有在Hg2+存在的条件下才能结合并引发延伸,进而使富G序列在模板上剥离下来,但由于Spacer18的隔断作用导致富G序列以单链形式存在,在特定环境下形成具有过氧化物模拟酶活性的G-四链体,催化H2 O2与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS)发生肉眼可见的颜色变化,进而对Hg2+进行定量测定.利用构建的Hg2+功能核酸生物传感器,35 min内可完成检测,线性范围为20～500 nmol/L,检出限达到16.5 nmol/L(3σ).实际水样中的加标回收率为98.5％～103.5％.本方法操作简单、成本低、耗时短,在应急处理、实时环境检测等方面具有良好的应用价值.%Excessive mercury ions have negative effects on individual health. So, it is of great significance to develop a method for rapid, sensitive and specific detection of Hg2+. In this study, the method for detection of Hg2+ was developed based on specific T-Hg-T mismatche and G-quadruplex. The template sequence mainly included the recognition region which could combine with Hg2+ specifically, the rich G region which could form G-quadruplex, and the speacer 18 partition zone. The target sequence mainly included 5' ends combining area and 3' end T-rich region. Templates and targets could be combined and the elongation was triggered only in the presence of Hg2+. Furthermore, the G-rich sequences were stripped off the templates and could form a single-stranded structure,
because Spacer 18 had partition function. The G-quadruplex was formed with the K+and hemin, and catalyzed H2 O2-2,2-azinobis (3-ethylbenzothiozoline)-6-sulfonic acid(ABTS) reaction with color variations. The detection could be done within 35 min, and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation with absorbance at 414 nm within range of 20-500 nmol/ L, with a detection limit of 16. 5 nmol/ L (3σ). The recoveries of Hg2+ spiked in tap water were 98. 5％ - 103. 5％ . The method exhibited the advantages such as simple operation, low cost and short time, and operation value in emergency treatment and real-time environmental detection.
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2018(046)006
【总页数】5页(P947-951)
【关键词】汞离子;G四链体;间隔臂;功能核酸;生物传感器
【作者】杜再慧;李相阳;田晶晶;田洪涛;许文涛
【作者单位】河北农业大学,食品科技学院,保定 071000;北京农学院, 食品科学与工程学院, 北京 102206;中国农业大学,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京 100083;河北农业大学,食品科技学院,保定 071000;中国农业大学,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京 100083
【正文语种】中文
1 引言
汞 (Hg)是一种分布广泛的重金属，进入环境后很难降解，可通过生物富集作用在
动物或人体内积累，对人体健康具有极大的危害[1～3]。

生活饮用水卫生标准GB 5749-2006中规定Hg2+限量值为 1 mg/L[4]。

建立一种廉价、快速、灵敏、特
异性的Hg2+的检测方法是非常必要的。

传统的Hg2+检测方法主要包括原子吸收光谱法(AAS)[5]、原子荧光光谱法(AFS)[6]等，方法灵敏、检出限低，但一般需要大型仪器和专业的操作人员，检测周期长，费用高。

近年来，研究者不断开发出特异性金属离子功能核酸，具有易于修饰、成本低、结构稳定、特异性强等优点[7，8]，使得Hg2+功能核酸生物传感器发展迅速[9]。

Hg2+能与富有胸腺嘧啶(T)的脱氧核苷酸链特异性结合形成稳定的双螺旋结构[10]，其结合强度超过正常的腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)配对。

因此T-Hg2+-T错配可以作
为一种良好的Hg2+识别元件。

基于T-Hg2+-T错配可引起寡核苷酸链结构的变化、替换以及重组的原理建立的分析方法被广泛用于Hg2+的检测。

近年来，在
Hg2+与胸腺嘧啶相互作用的基础上，研究者采用电化学[11～13]、荧光[14,15]
或者比色[16～18]作为信号输出方式, 建立了许多Hg2+检测方法。

其中，比色传感器具有无需分析仪器、肉眼可读、快速、容易操作等优点[19]，是Hg2+定点诊断、原位快速筛选的理想方法。

最常见的比色传感器是通过氯高铁血红素(Hemin)和富G序列形成的具有过氧化物模拟酶(HRP)活性的G四链体，可以在H2O2存
在的条件下催化2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS2-)发生颜
色变化。

本研究以带有富G和隔断的序列为模板对Hg2+进行特异性检测，靶序列与模板
序列同时含有6个连续T碱基的序列，不存在Hg2+时，两条序列不能结合，因
此不发生延伸。

当溶液中含有Hg2+时，靶序列与模板间通过T-Hg-T碱基错配形
成稳定的双链结构，在DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和脱氧核糖核苷酸(dNTPs)存在的条件下发生延伸，但由于隔断序列的存在，富G序列只能从模板上剥离下来，以游离的单链形式存在。

在K+、Hemin存在的条件下，形成具有过氧化物模拟酶活性的G四链体；在H2O2存在的条件下，催化ABTS发生肉眼可见的颜色变化，通过颜色的变化可以对Hg2+进行定量检测。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
VARIOSKAN FLASH多功能全波长酶标仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)； DK-98-1电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)； UNIQUE-R20超纯水仪(北京百亿新创科技公司)。

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、氯高铁血红素、二甲基亚砜和其它金属盐(分析纯，Sigma公司)； H2O2(30%, 北京蓝戈有限公司)； Bst 3.0 DNA Polymerase(NEB公司)；脱氧核糖核苷酸的混合物(dNTPs，宝生物工程(大连)有限公司)； DNA核酸序列由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，HPLC 纯化(表1)。

表1 DNA核酸序列(5'-3')
Table 1 Sequence of DNA(5'-3')
名称 Name序列 Sequences(5'-3')模板TemplateGTGGGTAGGGCGGGTTGGspacer18CCAACCCGCCCTACCCACAAA TTTTTTCACGACGGCCAGAC靶标 TargetGTCTGGCCGTCGTGTTTTTT互补序列Complementary sequenceGTCTGGCCGTCGTGAAAAAA注:下划线部分是G四链体形成序列; 斜体为与靶标互补配对的序列。

Notes: The underlined part is the sequence of G-quadruplex;The oblique body is the complementary sequence with the target.
氯高铁血红素溶液用二甲基亚砜(DMSO)试剂配制4 mg/mL的储存液，工作液浓度为4 μg/mL； DNAzyme酶活性提升缓冲液为10 mmol/L NaH2PO4-
Na2HPO4、100 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、0.003% (V/V) Triton X-100, pH=7.0； ABTS底物溶液为20 mg/mL DMSO溶液； DNAzyme底物缓冲液为51 mmol/L Na2HPO4·12H2O、48 mmol/L柠檬酸, pH=3.6； DNAzyme显色液：1 mL DNAzyme底物缓冲液+ 5 μL ABTS底物溶液+ 1 μL 30% H2O2，避
光混匀。

2.2 实验方法
2.2.1 Hg2+的检测10 μL反应体系中包含10 μmol/L模板序列、10 μmol/L靶序列、0.25 mmol/L dNTPs、0.06 U/μL Bst DNA polymerase、Buffer(1×)，然
后加入等体积不同浓度的Hg2+溶液，在55℃条件下反应3 min，然后在95℃孵育10 min，使DNA polymerase失活。

将上述溶液加到80 μL DNAzyme酶活
性提升缓冲液和10 μL Hemin工作液，37℃孵育27 min，促使G4结构充分形成。

然后加入100 μL 预混均匀的ABTS和H2O2的DNAzyme显色液，37℃反
应5 min。

用多功能全波长酶标仪在414 nm条件下检测体系吸光度。

2.2.2 特异性实验将上述Hg2+检测方法加入的10 μmol/L Hg2+用10倍浓度的的其它离子(包括100 μmol/L的Zn2+、Cd2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Pb2+)代替，其它步骤与2.2.1节相同，考察方法的特异性。

2.2.3 实际水样分析采用本方法对自来水样品进行检测。

同时在自来水样品中分别加入50、200 和300 nmol/L的Hg2+标准溶液，测定加标回收率。

3 结果与讨论
3.1 实验原理
本研究根据Hg2+能与胸腺嘧啶(T)碱基形成稳定的T-Hg-T结构的原理，设计了
可特异性检测Hg2+的功能核酸生物传感器。

模板序列包括三部分：一部分是可与
靶序列部分互补配对的序列，另一部分是可形成G-四链体的富G序列，以及一个疏水间隔臂Spacer18。

Hg2+不存在的情况下，富G序列与模板自身的互补链结合，靶序列不能与模板结合进行延伸；Hg2+存在的条件下，靶序列与模板互补，可在DNA聚合酶催化下进行链的延伸，将G-四链体序列打开，又由于Spacer18的隔断作用，富G序列形成游离的单链。

在适宜的缓冲条件和K+诱导下形成G-
四链体，并与Hemin结合形成具有过氧化物模拟酶活性的DNAzyme，在H2O2存在的条件下，催化ABTS发生肉眼可见的颜色变化(图1)。

图1 基于功能核酸Hg2+传感器的原理图Fig.1 Schematic illustration of Hg2+ sensor based on functional nucleic acid
3.2 可行性分析
不同条件下反应体系的吸收光谱如图2所示，当体系中只有模板时，背景信号较弱；当富G序列单独存在时，出现较高吸收峰。

含有错配碱基时的吸收峰较低，但加入Hg2+后，吸收峰有所增高，说明模板在Hg2+存在时形成T-Hg-T错配，进行了延伸，释放G四链体。

图2 不同溶液吸收光谱图。

a:10 μmol/L的G四链体序列； b为10 μmol/L模板+10 μmol/L互补序列； c为10 μm ol/L模板+10 μmol/L错配序列+25 μmol/L Hg2+； d为10 μmol/L的模板； e:为10 μmol/L模板+10 μmol/L错配序列；插图为反应体系照片。

Fig.2 Absorption spectra of different solutions. a: 10
μmol/L G-quadruplex; b: 10 μmol/L template sequence +10 μmol/L complement sequence; c: 10 μmol/L template sequences +10 μmol/L target sequence +25 μmol/L Hg2+; d: 10 μmol/L template sequence; e: 10 μmol/L template sequence +10 μmol/L target sequence; inset shows the optical images.
3.3 传感器性能分析
在实验条件下，测定不同Hg2+浓度下反应体系的吸收光谱(图3A), Hg2+浓度在20～500 nmol/L范围内与反应体系在414 nm处吸光值有良好的线性关系(图
3B)， R2=0.9805，检出限为16.5 nmol/L(3σ)，低于生活饮用水卫生国家标准中对Hg2+的限量要求[4]。

图3 (A) 不同浓度Hg2+存在下传感体系吸收光谱图； (B)检测Hg2+的校正曲线Fig.3 (A) Absorption spectra of sensing system in the presence of different concentrations of Hg2+. Concentration of Hg2+ (form bottom to top) is 10 nmol/L, 20 nmol/L, 40 nmol/L, 50 nmol/L, 100 nmol/L, 500 nmol/L, 1
μmol/L, 5 μmol/L and 10 μmol/L, respectively; (B) Calibration curve for detection of Hg2+
3.4 传感器的特异性
用构建的传感器检测了10 μmol/L Hg2+以及10倍浓度的其它常见干扰离子的响应。

由图4可见，其它离子的响应远小于Hg2+的响应，表明本传感器对Hg2+具有良好的选择性。

Pb2+可高效稳定G四链体，Pb2+形成的G四链体比K+形成的G四链体有更高的稳定性[20]，所以Pb2+通常会干扰基于G四链体的传感器的检测[21]。

本研究构建的传感器对Hg2+展现出高特异性，Pb2+基本不影响检测，这与本传感器的检测原理有关。

G四链体的形成需要富G序列从茎环上释放，由于Pb2+不能形成T-T错配，所以富G序列不会从模板上剥落下来，因此不会形成具有类过氧化物酶活性的G四链体，对Pb2+的响应信号低。

3.5 实际水样分析
采用本传感器对实验室中自来水样品进行检测，未检测到Hg2+。

添加回收实验结果如表2所示，加标回收率为98.5%～103.5%。

与文献报道的Hg2+测定方法[22～26]相比，本方法的检出限略高，但是完全可以满足实际自来水水样中
Hg2+的分析要求，且方法简单，成本低。

表2 自来水中Hg2+加标回收实验结果
Table 2 Recoveries of Hg2+ in tap water
样品编号Sample No.加标量Spiked(nmol/L)测量值Found(nmol/L)回收率recovery(%)15050.9±0.9101.82200199.9±2.999.93300300.0±1.6100.0
图4 传感器的特异性实验Fig.4 Selectivity of developed sensor , 10 μmol/L of Hg2+, 100 μmol/L of Zn2+, Cd2+, Mn2+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Pb2+
4 结论
利用Hg2+和胸腺嘧啶特异性结合形成T-Hg-T碱基错配，进而引发延伸反应，发生链置换，释放出单链富G序列，在K+和Hemin存在下形成具有过氧化物模拟
酶活性的G-四链体，催化H2O2与ABTS发生肉眼可见的颜色变化，进而实现对Hg2+的定量检测，建立了一种Hg2+比色传感器。

此传感器设计简单、操作方便、检测时间短，结果肉眼可见，具有良好的灵敏度和选择性。

检出限达到16.5
nmol/L(3σ)，可以满足自来水样品中Hg2+的检测要求。

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