穿山甲药材DNA快速提取方法研究

2020年第11期广东化工
第47卷总第421期 · 35 · 穿山甲药材DNA快速提取方法研究
杨志业1*，刘文斌2，谭颖仪1，刘昂1，方竑1，林锦锋1
(1．广东省药品检验所中药室，广东广州510663；2．广州市药品检验所一分所，广东广州510130)
[摘要]目的建立穿山甲药材DNA快速提取方法。

方法采用二硫苏糖醇(DTT)结合商用动物组织DNA提取试剂盒提取穿山甲药材中的基因组。

考察取样量、DTT用量、裂解时间等对穿山甲药材中DNA提取质量的影响。

结果最低取样量为5 mg，DTT用量为100 µL，裂解时间为30 min，细胞裂解完全，所有样品的DNA均可满足PCR要求。

结论建立的DNA提取方法提取时间为40 min，快速便捷，取样量少，DNA 提取完全，可为穿山甲药材DNA鉴别方法开发提供研究基础。

[关键词]穿山甲；DNA快速提取；二硫苏糖醇(DTT)
[中图分类号]TQ [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2020)11-0035-02
Study on Rapid Extraction of DNA from Manis squama Commodities
Yang Zhiye1*, Liu Wenbin2, Tan Yingyi1, Liu Ang1, Fang Hong1, Lin Jinfeng1
(1. Guangdong Institute for Durg Control, Guangzhou 510663；
2. No.1 Substation of Guangzhou Institute for Drug Control, Guangzhou 510130, China)
Abstract: Objective To establish the rapid method of DNA extraction for Manis squama. Methods Dithiothreitol (DTT) was applied with commercial animal tissue genomic DNA extraction kits to extract total DNA from Manis squama. The effects of sampling amount, DTT dosage, and lysis time on the quality of DNA were also investigated. Results The lowest sampling amount was 5 mg, DTT dosage was 100 µL, the least lysis time was 30 min, scale cells can be lysised completely, and the quality of DNA of all samples can meet the requirements of PCR. Conclusion The extraction method could be finished in 40 min, and could support study basis for DNA identification of Manis squama because of fast, less sample requiring and complete DNA extraction.
Keywords: Manis squama；DNA rapid extraction；Dithiothreitol (DTT)
穿山甲为鲮鲤科动物穿山甲Manis pentadactyla Linnaeus的鳞甲，始载于《名医别录》[1]，名“鲮鲤甲”，在《本草图经》中称为“穿山甲”，具有通经下乳、消肿排脓、搜风通络的功效，用于经闭癥瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛、中风瘫痪、麻木拘挛等症，是传统名贵中药之一。

近年来，由于乱捕滥猎和栖息地的破坏，穿山甲野生资源急剧减少，又因穿山甲生活习性特殊，迄今未能成功人工繁育，因此中药穿山甲资源稀缺，市场上出现了其他穿山甲属物种的甲片替代入药以及多种其他掺假行为[2-4]。

目前对中药穿山甲的鉴别仍以传统性状鉴别为主，但穿山甲鳞甲大小、颜色、纹理等特征随基原动物年龄、生活环境、鳞片所在部位等不同有所差异，鉴别难度极大。

因此以DNA分子技术建立穿山甲真伪鉴别方法的研究为现今研究的热点之一[5-8]。

然而在现今所做的研究中，穿山甲药材DNA提取存在提取率低、耗时长、质量差等问题，满足不了PCR反应的要求，严重阻碍了穿山甲DNA分子鉴定方法的应用和推广。

为更好地利用DNA分子技术解决穿山甲药材真伪鉴别的难题，最大程度提取穿山甲药材中的DNA，本研究取穿山甲鳞甲，根据角蛋白的化学特征，采用二硫苏糖醇(DTT)结合动物组织DNA提取方法提取鳞甲中的DNA，对影响提取结果的关键因素如取样量、DTT的用量、裂解时间、试剂盒品牌等进行了考察，建立了适用于穿山甲药材DNA 快速提取的方法。

1 仪器与试药
1.1 仪器
PCR仪BIORAD T100(BIORAD)；离心机eppendorf centrifuge5481(EPPENDORF)；水平电泳系统Sub Cell GT(BIORAD)；全自动凝胶成像系统Molecular Imager Gel Doc TM XR+ Imaging System (BIORAD)；Nanodrop2000超微量核酸定量分析仪(Thermo Fisher Scientific)；电热恒温水槽DK-8D型(上海一恒科技有限公司)。

1.2 试药
试剂盒1：血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN BIOTECH)；试剂盒2：DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN)；试剂盒3：Wizard SV Genomic DNA Purification System(Promega)；蛋白酶K(Promega 公司)；SpeedSTAR HS Taq DNA聚合酶(Takara 公司)；二硫苏糖醇(DTT，北京索莱宝生物科技有限公司)；DNA 分子标记(100-1000bp，Takara公司)；Agarose G-10琼脂糖(Biowest)；GelRed染色剂(Biotium公司)；电泳缓冲液配制试剂EDTA、Tris为分子生物学级试剂，冰醋酸为分析纯。

共收集穿山甲药材生品10批，均经广东省药品检验所林锦锋主任中药师鉴定，为鲮鲤科动物穿山甲Manis pentadactyla Linnaeus的鳞甲。

CO I 通用引物LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA由Invitrogen 公司合成)。

2 方法
2.1 样品处理
将样品用75 %乙醇清洗3次，再用纯化水冲洗至无醇味，晾干。

用已灭菌的刀片刨成细丝。

2.2 穿山甲鳞甲DNA提取
2.2.1 取样量的考察
称取同一批(样品1)穿山甲细丝样品5、10、15、20、25 mg，分别加入DTT溶液[取二硫苏糖醇3.09 g，用0.01 mol/L乙酸钠溶液(pH=5.2)20 mL使溶解，过滤除菌，即得]100 µL，蛋白酶K 20 µL 及试剂盒1裂解缓冲液GA200 µL，56 ℃水浴裂解3 h后，按试剂盒1提取步骤提取DNA。

2.2.2 DTT加入量的考察
称取同一批(样品1)穿山甲细丝5份，每份约10 mg，分别加入DTT溶液20、30、50、80、100 µL，加入蛋白酶K 20 µL及试剂盒1裂解缓冲液GA200 µL，56 ℃水浴裂解3 h后，按试剂盒1提取步骤提取DNA。

2.2.3 裂解时间考察
称取同一批穿山甲细丝样品6份，每份10 mg，加入DTT溶液100 µL，蛋白酶K 20 µL及试剂盒1裂解缓冲液GA200 µL，56 ℃水浴裂解0.5、1、2、3、5、12 h后，按试剂盒1提取步骤提取DNA。

2.2.4 试剂盒品牌考察
称取同一批(样品1)穿山甲细丝样品6份，每份10 mg，分别加入DTT溶液100 µL，蛋白酶K 20 µL后分为3组，每组2份平行样。

其中第一组加入试剂盒1裂解缓冲液GA200 µL；第二组加入试剂盒2裂解缓冲液ATL 180 µL；第三组加入试剂盒3裂解缓冲液275 µL；3组样品分别在56 ℃水浴裂解0.5 h后，分别按相应试剂盒提取步骤提取DNA。

2.2.5 不同DNA提取方法比较
取同一批(样品1)穿山甲细丝样品4份，每份20 mg，分为2组，每组2份样品。

其中第一组不加DTT，直接按试剂盒1提取步骤进行操作，其中裂解过夜，时长约为12 h，提取DNA进行
[收稿日期] 2020-05-06
[基金项目] 广东省中医药局科研项目(项目编号：20171040)；广东省食品药品监督管理局科技创新立项资助项目(项目编号：2018TDZ02)；国家药品监督管理局药品快速检验技术重点实验室资助(国药监科外函[2019]82号-24)
[作者简介] 杨志业(1981-)，女，广东潮阳人，副主任中药师，主要研究方向为中药鉴定及质量评价研究。

*为通讯作者。

广东化工2020年第11期· 36 · 第47卷总第421期
比较；第二组采用碱裂解法[9]进行提取。

2.3 DNA浓度与纯度测定
采用Nanodrop2000超微量核酸定量分析仪测定DNA的浓度及纯度，主要以A260/A280的比值考察提取DNA的质量，A260/A280的比值在1.8~1.9之间说明DNA纯度极高，大于1.8说明DNA 中含有RNA，一定程度上不会影响后滤PCR反应，小于1.8说明DNA中含有蛋白质或苯酚污染，会抑制后续PCR反应。

2.4 样品DNA提取
将所收集的样品按上述优选的DNA提取方法：取样量约10 mg，加入DTT溶液100 µL，蛋白酶K 20 µL，按试剂盒1进行提取，裂解时长为0.5 h。

提取的DNA浓度及纯度结果见表1。

2.5 PCR扩增
将2.4提取得到的DNA模板用于PCR扩增，以检测DNA质量。

扩增通用引物见“1.2试药”，25 µL PCR反应体系包含10×FBI 缓冲液2.5 µL、10 mmol/L dNTPs 2 µL，2.5 µmol/L引物各1.5 µL，SpeedSTAR HS Taq酶1 U，DNA模板约20 ng，灭菌超纯水补足至25 µL。

PCR扩增程序为94℃ 5 min，再进行35个循环反应，条件为94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；72 ℃ 5 min。

以无菌双蒸水作为空白对照，同法扩增得到空白对照PCR扩增产物。

PCR 扩增结果见图1。

3 结果
3.1 取样量考察
按“2.2.1”试验，结果见表1。

所提取的DNA浓度范围为20.3~49.0 ng/µL，A260/A280的比值1.68~1.92之间；取样量为5 mg 时，可提取出浓度和纯度比较理想的基因组。

结果表明，取样量增大时，所提取的DNA纯度有下降的趋势，故建议取样量为10 mg。

表1 取样量考察
Tab.1 The study on sampling amount
取样量/mg DNA浓度/(ng/µL) A260/A280
5.3 20.3 1.92
10.4 35.4 1.82
14.5 41.2 1.75
21.7 35.2 1.73
24.7 49.0 1.68
3.2 DTT加入量考察
按“2.2.2”试验，试验过程中观察发现，DTT的加入量与样品裂解程度呈正相关，加大DTT加入量可缩短裂解时间且达到较好的裂解效果。

为保证样品裂解完全，减少裂解时间，建议DTT 加入量为100 µL。

3.3 裂解时间考察
按“2.2.3”试验，结果见表2。

结果表明裂解时间在0.5 h时所提取的DNA浓度和纯度均能满足试验需要，说明DTT结合试剂盒法提取穿山甲药材DNA可将裂解时间缩短至半小时，达到了加速提取的目的。

表2 裂解时间考察
Tab.2 The study on lysis time
取样量/mg 裂解时间/h DNA浓度/(ng/µL) A260/A280
10.0 0.5 33.5 1.81
10.4 1 35.4 1.92
10.9 2 38.9 1.86
9.8 3 33.5 1.81
10.2 5 32.1 1.92
10.4 12 34.6 1.74
3.4 不同试剂盒考察
表3 不同试剂盒考察
Tab.3 The study on different commercial DNA extraction kit 试剂盒取样量/mg DNA浓度/(ng/µL) A260/A280
试剂盒1 10.0 33.5 1.81
试剂盒1 10.3 35.4 1.84
试剂盒2 10.5 39.1 1.84
试剂盒2 10.2 35.6 1.92
试剂盒3 10.3 39.7 1.94
试剂盒3 10.6 36.8 1.90
按“2.2.4”试验，结果见表3。

结果表明DTT与目前主要的商用品牌试剂盒结合使用，均能从穿山甲药材中提取到较好的DNA结果。

3.5 不同提取方法比较
按“2.2.5”试验，结果表明不加DTT直接进行试剂盒提取，2份样品所得穿山甲药材DNA浓度分别为3 ng/µL、5.6 ng/µL，A260/A280的比值分别为0.98、1.26；而碱裂解法虽更为快速，2份样品所得DNA浓度分别为97.5 ng/µL、88.5 ng/µL，A260/A280的比值分别为0.62、0.68，表明杂质均过多，提取效果不理想。

3.6 样品DNA提取
将所收集的10批样品按“2.4”、“2.5”试验，结果见表4。

结果表明DTT与试剂盒结合方法提取穿山甲药材中DNA浓度范围为29.3~66.5 ng/µL，纯度范围为 1.81~1.95，均较为理想。

经PCR扩增后，按照琼脂糖凝胶电泳方法(中国药典2015年版通则0541)，胶浓度为1.5 %，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。

结果见图1，表明所提取的穿山甲药材DNA均能成功扩增得到约700 bp的条带，满足PCR扩增要求。

表4 10批穿山甲药材样品DNA提取结果Tab.4 DNA extraction results of 10 batches of Manis squama
commodities
编号取样量/mg DNA浓度/(ng/µL) A260/A280
1 10.
2 33.5 1.81
2 10.5 35.4 1.92
3 10.1 38.9 1.86
4 10.1 53.6 1.84
5 10.0 29.3 1.92
6 10.3 40.1 1.88
7 10.5 43.3 1.84
8 10.7 39.7 1.95
9
10.2 41.4 1.91
10 10.3 66.5 1.89
1,13：DNA分子标记(由上至下分别为1000、700、500、400、300、200、100bp)；2~11：10批穿山甲药材样品；12：空白对照
图1 10批穿山甲药材PCR扩增结果
Fig.1 PCR amplification results of 10 batches of Manis squama
commodities
4 讨论
(1)本研究采用二硫苏糖醇结合试剂盒提取穿山甲药材中DNA的方法，是基于穿山甲鳞甲的化学特性及DTT的作用展开研究的。

穿山甲鳞甲主要含硬脂酸、胆固醇等脂溶性成分以及蛋白质类大分子成分，其中蛋白质主要是由α角蛋白和β角蛋白两种结构组成。

角蛋白中含有较多半胱氨酸，其二硫键在蛋白质肽链中起交联作用，使角蛋白不易溶解和消化[10]，因此严重阻碍了DNA提取过程中细胞的裂解及DNA的释放，是影响穿山甲鳞甲中DNA提取完全的关键因素。

DTT是一种阻止蛋白中半胱氨酸之间形成蛋白质分子内或分子间二硫键的强还原剂，采用DTT结合试剂盒提取穿山甲鳞甲中DNA的方法，有效地消除了角蛋白的影响。

(2)本研究所建立的穿山甲药材DNA快速提取方法在取样量为5 mg，裂解时间为半小时，40 min内即可完成单个样品的提取，
(下转第51页)
2020年第11期广东化工
第47卷总第421期 · 51 · 与烯烃反应生成硫醇而造成产品硫含量和氢耗的增加[7-8]。

S Zorb技术借鉴了催化裂化工艺中的流化反应技术，采用流
化床反应器和吸附剂连续再生系统。

原料汽油与少量氢气混合，
经换热器气化后，进入到流化床反应器底部，在气流上行过程中，
吸附剂将油气中的有机硫化合物除去，吸附剂连续从反应器中取
出，传送到再生器部分进行氧化再生。

再生后的吸附剂在返回反
应器前用氢气进一步处理，以确保脱硫率稳定。

S Zorb炼油装置运行一段时间后，吸附剂会与原料油发生一
系列反应，生成硅酸锌和铝酸性，降低吸附剂的活性。

S Zorb工
业装置吸附剂使用过程中，生成的硅酸锌如果得不到有效控制，
会导致硫存储能力不足，精制汽油总硫无法满足质量要求，已成
为制约产品质量升级的主要问题。

在线检测硅酸锌的生成成为调节运行参数、控制生产过程的关键因素。

所以需要不定期对待生剂和再生剂的硅酸锌和铝酸锌非活性物质进行监控，如图2和图3所示。

图2 待生剂和再生剂物相定量结果
Fig.2 Phase quantification results of standby adsorbent and
regenerated adsorbent
由图2可知，装置连续运行几年，待生剂和再生剂的硅酸锌都有效的控制在1 %以下，影响吸附剂活性的物质含量低，装置一直平稳运行。

跟踪待生剂和再生剂物相含量，可有效指导生产运行。

图3是待生剂和再生剂物相含量的跟踪结果，发现有段时间硅酸锌含量较高。

根据分析结果判断装置运行出了些问题，导致硅酸锌含量上升很快，超出8 %，后经生产调整，待生剂和再生剂中硅酸锌含量很快得到控制，迅速下降，保证了装置正常运行，到现在为止硅酸锌的含量一直控制在允许范围内，生产的产品质量得到了保证。

图3 待生剂和再生剂物相定量结果
Fig.3 Phase quantification results of standby adsorbent and
regenerated adsorbent
4 结论
(1)脱硫吸附剂物相含量现场快速成套分析技术主要用于对新生产的S Zorb吸附剂进行质量监控，有助于在生产过程中控制吸附剂中非活性组分铝酸锌的含量，从而稳定产品质量，保证了吸附剂的活性。

(2)该技术还用于S Zorb待生剂和再生剂非活性组分硅酸锌等物相的监控，可以对吸附剂活性状态进行动态跟踪，为排查装置故障提供指导和帮助。

(3)该技术的应用有效降低了废吸附剂的产量，为排查装置故障提供指导和帮助，具有良好的环保效益和经济效益。

参考文献
[1]陈尧焕．汽油吸附脱硫(S Zorb)装置技术问答[M]．北京：中国石化出版社，2015．
[2]侯晓明，庄剑．S Zorb催化汽油媳妇脱硫装置技术手册[M]．北京：中国石化出版社，2015．
[3]田凯．S Zorb吸附剂中硅酸锌的成因研究[J]．广东化工，2017，44(6)：54-55．
[4]刘传勤，由慧玲．齐鲁S Zorb装置吸附剂中硅酸锌含量升高原因分析及对策[J]．齐鲁石油化工，2014，42(3)：199-203．
[5]邹亢，徐广通，盖金祥，等．高温原位XRD和TG-MS法研究S Zorb 工业吸附剂热解行为[J]．石油学报(石油加工)，2015，31(3)：732-739．[6]邹亢，黄南贵，徐广通．S Zorb吸附剂Rietveld物相定量方法研究[J]．石油学报(石油加工)，2012，28(4)：598-604．
[7]耿磊，曹宏武．S Zorb催化汽油吸附脱硫技术探讨．广东化工，2013，40(13)：121-122．
[8]付颖，张欣，邹亢，等．PLS-XRD快速测量S Zorb再生剂中尖晶石含量．石油学报(石油加工)，2013，29(3)：453-458．
(本文文献格式：杨洁．S Zorb吸附剂物相现场快速成套分析技术的应用[J]．广东化工，2020，47(11)：50-51)
(上接第36页)
与采用常规试剂盒法裂解过夜进行DNA提取相比较，不仅大大缩短了提取时间，且提取更彻底，所提取DNA满足PCR要求；而与碱裂解法相比较，虽提取时间略长，但所得到的DNA纯度更好。

将常规试剂盒裂解过夜提取的DNA与碱裂解法提取的DNA进行PCR试验，均无法成功扩增。

另本研究所建立的方法样品处理仅需用刀片刨取样品成细丝即可进行后续试验，无需用钢锉锉粉或研磨器磨粉，大大降低了取样难度，减少了污染的可能。

因此本研究所建立的方法可用于穿山甲药材样品中DNA的快速提取，对中药分子鉴定技术在穿山甲药材真伪鉴别上的应用具有较好的实用意义。

参考文献
[1]代琪，叶俏波，杨茂艺．穿山甲的本草考证[J]．中药材，2018，41(2)：495-497．
[2]闵静，李书谊．穿山甲及炮制品的真伪鉴别[J]．海峡药学，2014，26(9)：35-36．
[3]吴芝园，巢建国，刘逊．四种穿山甲属动物的生药学研究[J]．现代中药研究与实践，2015，29(2)：25-28．[4]刘逊，朱缨，胡芳，等．濒危物种穿山甲的商品调查及其基源鉴定[J]．亚太传统医药，2015，11(15)：35-36．
[5]尹艳，刘逊，王兵，等．中药穿山甲的DNA分子鉴定研究[J]．中国中药杂志，2017，42(11)：2078-2084．
[6]贾静，张红印，陈俊，等．名贵动物药材穿山甲的DNA条形码分子鉴定研究[J]．中国中药杂志，2014，39(12)：2212-2215．
[7]邢亚琳，彭建军，胡慧建，等．穿山甲标本及甲片的DNA提取及PCR 扩增[J]．动物学杂志，2013，48(1)：49-57．
[8]李婵，谢雪娜，蔡炫，等．穿山甲属动物的DNA条形码及在穿山甲商品鉴定中的应用[J]．中国现代中药，2019，21(9)：1221-1228．
[9]蒋超，黄璐琦，袁媛，等．使用碱裂解法快速提取药材DNA方法的研究[J]．药物分析杂志，2013，33(7)：1081-1090．
[10]张小慧，席啸虎，王世伟，等．角类动物药DNA提取方法研究[J]．中草药，2017，48(24)：5242-5246．
(本文文献格式：杨志业，刘文斌，谭颖仪，等．穿山甲药材DNA 快速提取方法研究[J]．广东化工，2020，47(11)：35-36，51)。