秦艽根中柱裂分结构的发生及龙胆苦苷的积累研究

秦艽根中柱裂分结构的发生及龙胆苦苷的积累研究
郭伟娜;魏朔南
【摘要】The formation of stele schizogenous structures,the accumulation parts of effective constituents,and the relationship between structure and accumulation of effective constituents in the root of Gentiana macrophylla Pall, were researched systematically by means of plant
anatomy,histochemistry,analytical chemistry and modern instrumental analysis technique. The results showed that: (1) The occurrence of stele schizogenesis in the root was caused by the abnormal activities of the vascular cadmium and xylem parenchyma cells, which caused the original vascular cylinder to divide into several relatively independent cylinders. Each of these vascular cylinders was then surrounded by suberized cells and,as a result,the axial root split into several rootlets. (2) The effective constituents were mainly present in the xylem and blast parenchyma cells of the vascular tissue. (3) The content of gentiopicrin in the split part of the root was 60% of that in the unsplit part.%采用植物解剖学、组织化学、分析化学和现代仪器分析技术相结合的方法,系统研究了秦艽根的中柱裂分发生、有效成分积累部位及其结构与有效成分的积累关系.结果表明:(1)秦艽根的中柱裂分发生是由于维管形成层和薄壁细胞的异常活动,使原维管柱裂分为几个相对独立的维管柱,这些独立的维管柱被木栓化细胞包围,主根裂分为支根；(2)秦艽根中的有效成分主要存在于维管组织的韧皮薄壁细胞和木薄壁细胞中；(3)秦艽根中裂分部位的龙胆苦苷含量为未裂分部位的60％.
【期刊名称】《植物科学学报》
【年(卷),期】2011(029)004
【总页数】7页(P512-518)
【关键词】秦艽;根;中柱裂分;龙胆苦苷
【作者】郭伟娜;魏朔南
【作者单位】西北大学西部资源生物与生物技术教育部重点实验室,西安710069;
西北大学西部资源生物与生物技术教育部重点实验室,西安710069
【正文语种】中文
【中图分类】Q946.83
秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)秦
艽组(Sect.Cruciata Gaudin)多年生草本植物，其根作为药用已有两千多年的历史，是我国常用大宗中药材之一，在祖国医学中是治疗风湿痹痛和关节病必不可少的药物。

随着现代药理学、药代动力学和药效学的不断深入，国内外学者已从秦艽的根中提取出龙胆苦苷、秦艽苷A、β-谷甾醇、龙胆二糖、红白金花内酯和挥发油类等多种成分［1］，在临床上广泛用于病毒性、神经性、呼吸道、心脑血管等疾病的治疗［2］。

目前有关秦艽的研究多集中在种质资源、形态解剖、化学及药理学等方面，其中在解剖学方面根的中柱裂分发育尚存在争议。

李小洪等［3］认为秦艽的根发生中柱裂分后主根不裂分为支根，而楼之岑等［4］认为主根裂分为支根。

此外，秦艽的根作为龙胆苦苷的主要积累部位，其内部结构的变化可能影响有效成分的含量变化，进而影响药材品质，而目前有关秦艽根的结构与有效成分积累关系的研究尚属空白。

因此，本研究采用植物解剖学、组织化学和现代仪器分析技术相结合的方法，系统研究了秦艽根的中柱裂分发育、有效成分积累部位以及结构与有效成分的积累关系，并对中柱裂分这一异常结构的功能进行了探讨，为选取秦艽药材优质种质资源，提高栽培效率及药材真伪优劣鉴定提供理论和实践依据。

作者于2008年4月在陕西省太白县采集到一年生和二年生栽培秦艽植株及上年秋季的种子，经西北大学岳明教授鉴定，分别为中药秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)及其种子。

采集后植株移栽于西北大学植物园内，种子在实验室常温条件下
置于培养皿中自然萌发。

1.2.1 石蜡切片法
将一年生和二年生秦艽根的不同发育部位用70%酒精配置的FAA固定液固定，经酒精系列脱水(浓度依次为:80%、90%、95%、100%)，石蜡包埋，Leica
RM2135石蜡切片机切片，厚度 8～12 μm，番红-固绿染色，中性树胶封片，Leica-DMLB显微镜观察并照相，凯氏带部位用荧光显微镜的紫外光为激发光源观察并照相。

1.2.2 组织化学法
取二年生秦艽根的新鲜材料做徒手切片，放置于载玻片上滴加等量的5%香草醛-
冰醋酸和高氯酸混合试剂，对秦艽的苷类物质进行显色，对照材料经FAA固定液(70%酒精配制，除去苷类物质)处理后，进行同样的组织化学显色，在Leica-DMLB显微镜下观察并照相。

1.2.3 分析化学方法
采用高效液相色谱法进行分析。

仪器:日本岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp检测器，Class-VP工
作站。

DL-180超声波破碎仪(浙江海天电子仪器厂)，MA200电子天平。

试剂:龙胆苦苷标品(购自中国药品生物制品检定所)、甲醇(天津科密欧)均为色谱纯，
水为纯净水。

色谱条件:色谱柱DiamonsilC18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流速0.6 mL/min;检测波长254 nm;柱温30℃;进样量20 μL。

流动相选择甲醇(A)—水(B)(3∶7)。

对
照品和秦艽样品的色谱图见图1和图2。

标准品溶液配制:精密称取龙胆苦苷对照品5 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成250 μg/mL的溶液，摇匀并使其充分溶解，0.45 μm微孔滤膜滤过后即为对照品溶液。

样品溶液配制:取二年生秦艽的根，将根的裂分部位与未裂分部位分别在40℃烘箱中干燥至恒重，经粉碎机粉碎后过40目筛备用。

精密称取裂分部位与未裂分部位粉末各0.10 g，加甲醇20 mL，加热回流30 min，滤过，滤液减压蒸馏至干，残渣用20 mL甲醇溶解，滤过，滤液移至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，再从50 mL容量瓶中精密吸取5 mL滤液于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成浓度为1 mg/mL过0.45 μm微孔滤膜，备用。

线性关系考察:精密吸取龙胆苦苷标品溶液2、4、6、8、10 μL，进样测定，以进
样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归直线方程为 y=234656x－112886，
R=0.997，结果表明龙胆苦苷在0.5～2.5 mg线性关系良好。

标准曲线见图3。

精密度试验:取龙胆苦苷对照品溶液连续进样5次，每次10 μL，计算峰面积积分
值的 RSD为0.78%，表明本实验精密度良好。

重复性试验:取同一秦艽样品5份，按照“样品溶液的制备”项下的方法制成供试
溶液进样，每次10 μL，计算得龙胆苦苷峰面积积分值的 RSD为0.19%。

稳定性试验:取供试品溶液分别在7、10、13、16、19 h 进样20 μL，记录峰面积，计算龙胆苦苷峰面积的RSD=1.33%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

回收率试验:精密称取已知龙胆苦苷量的样品0.25 g，准确加入龙胆苦苷对照品
3.0 mg，制备供试品溶液5份，进样15 μL，测定龙胆苦苷的峰面积，计算平均
回收率为101.7%，RSD=2.68%。

2.1.1 外部形态
秦艽种子萌发早期，胚根发育成直根系，白色略透明，当根长达1～2 cm时，下部偶有侧根生出;一年生秦艽的根表面呈淡黄色，根头部靠近地上部分处维管束开始断裂，但未见支根形成;二年生的根与一年生的根相比颜色加深，呈黄棕色或灰黄色，根头部裂分为支根，支根上部长有地上分枝，下部侧根多条(图版I:1)。

2.1.2 秦艽根的初生结构
对秦艽种子萌发形成的种子根进行观察，其初生结构类似一般双子叶草本植物，由表皮、皮层和中柱三部分组成(图版I:2)。

表皮为1层薄壁细胞;皮层由4～5层薄壁细胞组成，其中外皮层和内皮层明显，皮层细胞排列疏松，近圆形，细胞体积较大，液泡化明显，内皮层细胞体积较小，排列紧密，在径向壁和横向壁因沉积木质化和栓质化物质，形成明显的凯氏带(图版I:3)。

内皮层之内是中柱，中柱最外一层细胞为中柱鞘，中柱鞘之内是初生木质部和初生韧皮部，在中柱分化过程中，最初位于中柱鞘细胞内侧分化出2个相对的原生木质部小导管，初生木质部为二原型，发生过程为外始式(图版I:2)。

2.1.3 秦艽根的正常次生生长
秦艽的根在初生生长转向次生生长的过程中，表皮和皮层薄壁细胞被挤裂，逐渐脱离，内皮层细胞逐渐成为最外层(图版I:4)。

当初生结构中的后生木质部导管分化成熟时，位于初生木质部和初生韧皮部之间的原形成层细胞开始进行平周分裂，形成弧形片段，即最早的次生分生组织维管形成层弧;以后邻接形成层弧两端的薄壁组织细胞也恢复分裂能力，转变为形成层细胞，新产生的形成层细胞与形成层弧连接起来，使形成层弧向两侧扩展;最后与形成层弧相接的中柱鞘细胞也恢复分裂能力，转变为形成层细胞并与形成层弧连接在一起，在初生木质部和初生韧皮部之间形成完整的维管形成层环(图版I:5)。

维管形成层进行平周分裂，向外产生次生韧
皮部，向内产生次生木质部，使根增粗。

在次生维管组织中，木质部主要由导管组成，伴有少量木薄壁细胞;韧皮部宽阔，主要由韧皮薄壁细胞组成，筛管和伴胞分
散排列在韧皮薄壁细胞中(图版I:6)。

当次生生长进行一段时间之后，位于内皮层内侧的中柱鞘细胞脱分化，形成第一层木栓形成层，随后木栓形成层进行切向分裂，向外产生木栓层细胞，向内产生栓内层细胞，组成第一层周皮(外周皮)。

随后外周皮内侧的次生韧皮部薄壁细胞亦脱分化以同样方式产生第二层周皮(内周皮)(图版I:7;图4:A)，此后，其外侧的韧皮部细胞逐渐破裂，失去作用，成为无功能韧皮部。

至此根的结构由外到内依次为:外周皮、无功能韧皮部、内周皮、次生韧皮部、维管形成层、次生木质部和初生木质部。

2.1.4 秦艽根的异常次生生长
进入异常次生生长后，维管形成层环在一些区域向内侧凹陷并分化出较多的薄壁细胞，凹陷处径向方向上靠近木质部束导管的薄壁细胞径向分裂，逐渐成为异常形成层(图版I:8;图4:B)，接着位于木质部束内侧的薄壁细胞亦脱分化形成异常形成层，这些异常形成层与原维管形成层相连，将木质部束包围，成为相对独立的子中柱，从而使维管形成层附近的木质部被分为几个木质部束，外周皮及颓废韧皮部在裂分过程中逐渐脱落(图版I:9，10;图4:C，D)。

最后维管形成层断裂处两侧和中央位置处的薄壁细胞脱分化形成周皮组织，新产生的周皮与内周皮相连将相对独立的子中柱包围，使主根裂分为支根。

位于原中柱中央的木质部被木栓化细胞隔离，成为颓废木质部(图版I:11;图4:E)。

裂分后的支根在以后的生长过程中还可以同样的方式
继续裂分，其结构由外到内依次为周皮、韧皮部、原维管形成层和异常形成层连接成的形成层环、木质部(图版I:12;图4:F)。

利用5%香草醛-冰醋酸和高氯酸混合试剂与苷类可产生红色反应［5］。

实验结果显示出秦艽根中的有效成分主要位于韧皮部和木质部薄壁细胞(图版I:13)，而位于第二层周皮(内周皮)外侧的无功能韧皮部基本不呈现红色，其中维管形成层和第二
层木栓形成层处的颜色较深(图版I:14)。

对照材料不显红色(图版I:15)，表明FAA
固定液处理后根中有效成分发生变化，故此部位不产生颜色反应。

秦艽根未裂分部位与裂分部位龙胆苦苷含量测定:取移栽于西北大学植物园内的二
年生栽培秦艽，按1.2.3项中“样品溶液配制方法”制备样品溶液，进样测定，每个样品做5次平行实验。

龙胆苦苷的含量计算公式根据配制标品和样品溶液浓度、进样量以及标准曲线方程，化简后得:x=4.93373×10－5×(y+48936)，其中:x为
1 g样品中所含的龙胆苦苷含量(单位mg/g)，y为20 μL进样量对应的峰面积。

经实验测定和计算，二年生秦艽根中未裂分部位的龙胆苦苷含量为13.37%，裂分部位为7.97%。

(1)王英报道秦艽根内的“特殊”周皮是指内周皮［6］，并进一步指出这种现象广泛存在于秦艽组植物的根中。

李小洪和吕居娴等先后研究了麻花艽和秦艽根的发育过程［3，7］，并指明内周皮来源于次生韧皮部，本研究结果与文献报道一致，
内周皮的产生使其外侧早期形成的、且功能逐渐退化的韧皮部成为无功能韧皮部，由更内部产生的新韧皮部替代其功能，在一定程度上更新了植物体对营养物质的转运能力;同时在中柱裂分过程中，内周皮向内凹陷并参与包围子中柱形成支根，据
此可认为内周皮是适应中柱裂分的次生保护组织。

(2)植物根的中柱裂分是产生多中柱现象的一种方式，多中柱现象在多年生植物的
根中普遍存在。

Chakraverti(1948)研究发现伞形科积雪草属(Centella)某些植物根基部维管柱裂分为数个分离部分，裂分数目与原生木质部脊数一致，裂分过程中原生木质部束之间的维管形成层下陷分裂成弧状片段，每个片段向内侧扩展，环状包围在初生木质部和少量次生木质部的周围，从而形成三或四个维管柱［8］。

Metcafe和Chalk(1950)报道景天科景天属(Sedum)植物根内裂分维管柱的方式
是由于维管形成层分成若干片段分散到木质部中所致［8］;廖海民、胡正海［9］
研究何首乌(Polygonum multiflorum Thumb.)块根的多中柱形成是由韧皮薄壁
细胞脱分化形成三生形成层，由此向内和向外分别产生三生木质部和三生韧皮部，共同构成异常维管束。

李金亭，胡正海等［5］报道牛膝(Achyranthes bidentata Blume)根的多轮维管束形成是由最外侧邻近中柱鞘部位的次生韧皮部和射线薄壁
细胞脱分化形成第一圈三生形成层，并由此产生第一圈三生维管束，随后其外侧以同样的方式产生多圈外韧型三生维管束。

这些研究表明根内多中柱现象发生方式多样。

龙胆属秦艽组植物中柱裂分为秦艽药材真伪鉴定的重要依据，这种现象在龙胆科其他属中未见报道。

尽管秦艽组植物均存在中柱裂分现象，但其裂分发生方式不尽相同。

我们曾研究了小秦艽(Gentiana dahurica Fisch.)根的中柱裂分过程，其中未
见异常形成层产生，主根裂分为3～5个支根［10］。

李小洪和吕居娴等［3，7］研究了麻花艽和秦艽根的中柱裂分现象，认为其发生是由薄壁细胞脱分化后形成的异常形成层与断裂的原维管形成层连接成环，产生次生维管组织，形成完整中柱，随后麻花艽各裂分中柱外侧被周皮包围，主根裂分为支根，秦艽主根则不裂分为支根。

我们的研究结果显示秦艽根的整个中柱裂分过程与麻花艽相同，二者均有异常形成层的产生和支根的形成，与楼之岑等［4］的观点一致。

(3)植物结构与有效成分积累关系的研究已有较多报道，牛膝根中伴随三生结构的
快速分化，其根内药用成分三萜皂苷的含量迅速升高［5］。

何首乌块根异常维管束内薄壁组织占到4/5，明显高于中央维管束，蒽醌含量是中央维管束的2.7倍左右［9］，芦荟素细胞作为蒽醌类物质的贮藏场所［11］，其含量在同一株内随着叶龄的增大逐渐降低［12］。

这些研究结果表明植物结构变化与有效成分积累密
切相关。

本研究中秦艽根的解剖结构显示:同一秦艽根中，中柱裂分部位和未裂分
部位主要差异有两方面，一是外周皮及无功能韧皮部在裂分过程中逐渐脱落，二是大量薄壁细胞脱分化成为木栓细胞，它的出现使中央木质部被隔离出体外，成为无功能木质部。

组织化学研究结果中对照材料不显红色，而试验材料显红色，表明有
效成分的积累部位，这些显色部位主要为维管组织薄壁细胞。

秦艽根中柱裂分后外周皮和无功能韧皮部脱落，中央产生了无功能木质部，这些组织均不是有效成分的积累部位，而引起有效成分积累部位变化的是大量薄壁细胞的脱分化，此过程大大减少了有效成分的积累部位。

植物化学研究结果显示:同一秦艽根中裂分部位龙胆苦苷含量仅为未裂分部位的60%，表明龙胆苦苷积累与根结构关系密切，同时表明未裂分部位长度和薄壁细胞数量可为秦艽栽培以及品质鉴别提供形态学和解剖学依据。

图版Ⅰ:秦艽根中柱裂分。

1:二年生秦艽根的外形;2:一年生主根横切面:示初生结构各部分;3:一年生主根横切面一部分:示凯氏带;4:一年生主根横切面一部分:示早期次生结构;5:一年生主根横切面一部分:示维管形成层环;6:一年生主根横切面一部分:示次生结构;7:一年生主根横切面一部分:示内周皮产生;8:一年生主根横切面一部分:示维管形成层断裂和断裂处细胞径向分裂;9:二年生主根横切面一部分:异常形成层和原维管形成层连接成环;10:二年生主根横切面一部分:示中柱裂分成束;11:二年生主根横切面一部分:示薄壁细胞分化为木栓化细胞以及中央颓废木质部的产生;12:二年生主根横切面一部分:示裂分完成;13:二年生主根横切面一部分:次生韧皮部薄壁细胞呈红色;14:二年生主根横切面一部分:次生韧皮部薄壁细胞呈红色，颓废韧皮部不显色;15:二年生主根横切面一部分:FAA浸泡后不显色。

E.表皮;C.皮层;CS.凯氏带;PX.初生木质部;SP.次生韧皮部;SX.次生木质部;VC.维管形成层;EP.外周皮;IP.内周皮;DP.无功能韧皮部;DX.无功能木质部;AC.异常形成层;CoC.木栓细胞。

PlateⅠ:Stele division in the root of Gentiana macrophylla Pall.1:The external feature of a two-year-old Gentiana macrophylla
Pall.’root;2:C ross-section of a one-year-old tap root:Showing primary
structure;3:Partial cross section of a one-year-old tap root:Showing casparian strip;4:Partial cross section of a one-year-old tap root:Showing early secondary structure;5:Partial cross section of a one-year-old tap root:Showing the ring of vascular cambium;6:Partial cross section of a one-year-old tap root:Showing secondary structure;7:Partial cross section of a one-year-old tap root:Showing the formation of inner periderm;8:Partial cross section of a one-year-old tap root:Showing the rupture of vascular cambium and cell radial division at the crack;9:Partial cross section of a two-year-old tap root:Showing vascular cambium and abnormal cambium connected into cyclization;10:Partial cross section of the two-year-old tap root:Showing stele divided into several parts;11:Partial cross section of a two-year-old tap root:Showing parenchyma cell dedifferentiation and formatin of decadent xylem;12:Partial cross section of a two-year-old tap root:Showing splitting completed;13:Partial cross section of a two-year-old tap root:Showing secondary phloem parenchyma cells appearing
red;14:Partial cross section of a two-year-old tap root:Showing secondary phloem parenchyma cells displaying red，but the decadent phloem showing no color;15:Partial cross section of a two-year-old tap root submerged by FAA:Showing no color.
E.Epidermis;C.Cortex;CS.Casparian strip;PX.Primary xylem;SP.Secondary phloem;SX.Secondary xylem;VC.Vascular cambium;EP.External periderm;IP.Inner periderm;DP.Degenerate periderm;DX.Degenerate xylem;AC.Abnormal cambium;CoC.Cork cell.
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