转化生长因子β对成骨细胞增殖＼BMP-2及Cbfal基因表达的影响

转化生长因子β对成骨细胞增殖＼BMP-2及Cbfal基因表达的影响目的：通过转化生长因子β（TGF-β）对体外成骨细胞增殖、骨形态蛋白-2
（BMP-2）及核心结合因子1（Cbfal）基因表达的影响，探讨TGF-β对骨代谢影响的可能机制。

方法：不同浓度的TGF（0、0.01、100 ng/ml）刺激体外培养的大鼠成骨细胞，采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖能力，用半定量RT-PCR 法检测成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达。

结果：TGF-β可明显促进成骨细胞增殖（P＜0.05），并促进成骨细胞BMP-2、Cbfal基因的表达（P＜0．01），具有浓度依赖性。

结论：TGF-β可促进成骨细胞的增殖、分化及成熟，可能是通过增强BMP-2、Cbfal基因的表达来实现的。

[Abstract] Objective: To study the effect of TGF-βo n the proliferation, BMP-2 and Cbfal gene expression in rat osteoblast in vitro, discusses the influence of TGF-β on bone metabolism can influence mechanism. Methods: Cultured rat osteoblast were treated with TGF-β in different concentrations (0、0.01、100 ng/ml). Cell proliferation was assessed by MTT, coiorimetric assay, the expression of BMP-2, Cbfal gene in rat osteoblast were examined by semiquantitive RT-PCR．Results: TGF-β could promote osteoblast proliferation (P＜0．05) and increase the expression of BMP-2 and Cbfal gene in a does-dependent manner(P＜0.01). Conclusion: TGF-β induces the proliferation differentiation and maturity of osteoblast probably by increasing the expression of BMP-2 and Cbfal gene．
[Key words] TGF-β; Osteoblast; Proliferation; BMP-2; Cbfal
TGF-β由一种结构相关的异聚体蛋白组成，是骨组织中含量最丰富的细胞生长因子之一，是骨吸收和骨形成之间有力的调节和偶联因子[1]。

TGF-β由成骨细胞产生并以自分泌或旁分泌的形式对成骨细胞的复制和基质的合成起着重要的调节作用。

本研究通过观察TGF-β对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、BMP-2及Cbfal基因表达的影响，探讨TGF-β对骨代谢影响的可能机制。

1 材料与方法
1.1材料
TGF-β（美国Sigma公司），DMEM培养基（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物制剂公司），Ⅰ型胶原酶（美国Sigma公司），胰蛋白酶（美国Sigma 公司），寡核苷酸引物，Trirol RNA提取试剂盒，dNTP．M-MLV逆转录，PCRmarker （fermentas），DNA聚合酶，引物，Beta引物（购于上海生工），分光光度计（U-2001，HITACHI，日本），PCR热循环仪（Gene Amp9600，PE公司，美国），垂直电泳槽（Bio—Rad公司，美国），电泳仪（Bio—RadPower/PAC200，美国）。

1.2 实验方法
1.2.1成骨细胞的培养采用酶消化法分离并纯化大鼠颅盖骨成骨细胞，计数后以适当密度接种于30 ml培养瓶中，在37℃、5％CO2孵箱中培养，2~3 d换液1次，待细胞达80％~90％汇合时，以2.5 g/L胰蛋白酶消化、传代。

1.2.2 成骨细胞的鉴定取第3代细胞爬片，用PBS液清洗，95％乙醇固定，行碱性磷酸酶染色。

取培养至第5代的细胞进行茜素红矿化结节染色。

1.2.3 TGF-β对成骨细胞增殖影响的测定（MTT法）取第3代成骨细胞以1×104/ml的密度接种于96孔板，每孔200 μl，用含10％胎牛血的DMEM培养24 h，后换无血清的DMEM再培养24 h作为清洗期，设立对照组（n=10）。

实验组分别用含不同浓度TGF-β（0.01、100 ng/ml）的无血清DMEM培养，每组10孔，在设定后的24 h培养时间结束前4 h每孔加入MTT 40 μl，继续培养4 h，吸弃孔内培养液加入DMSO 150 μl，振荡10 min，使结晶充分溶解，490 nm波长测定OD值。

1.2.4 TGF-β对成骨细胞BMP-2、Cbfal基因表达的影响不同浓度的TGF-β（0.01、100 ng/ml）作用于成骨细胞24 h后，应用Trizol提取细胞总RNA后，用半定量RT-PCR方法检测BMP-2、Cbfal基因的表达。

总RNA提取和PCR步骤如下：①cDNA第一链合成。

采用[TAKARA RNAPCRKit（AMV）Ver3.0]试剂盒，10 μl反应体系，样本RNA 5 μl，随即引物91 μl，DEPC-6μl离心混匀，70℃，5 min后置于冰上，加入5 X buffer 4 μl，RNA inhibitor 1 μl，dNTP 2 μl离心混匀，25℃，5 min，再加反转录酶1 μl，按下面条件进行，即25℃10 min，42℃60 min，72℃10 min。

②PCR步骤。

PCR扩增BMP-2和Cbfal，同时扩增Gapdh作为内参。

引物序列如下，BMP-2上游引物tgaacacagctggtctcagg，下游引物accccacatcactgaagtcc，PCR产物为170 bp。

Cbfal上游引物gagcacaaacatggctgaga，下游引物tggagatgttgctctgttcg，PCR产物238bp。

Gapdh上游引物tgaacgggaagctcactgg，下游引物tccaccaccctgttgctgga，PCR产物为307 bp。

反应体系共25 μl，cDNA 5 μl，dNTP 0.5 μl。

反应条件均为94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，32次循环。

③PCR产物鉴定与分析。

取PCR扩增产物点样于琼脂凝胶上电泳检测，紫外线箱中观察并照像记录。

产物鉴定以PCR maker 为标准，通过凝胶成像分析仪对目的基因和参照基因条带进行像素值测定，并计算出二者比值。

1.3 统计学处理
应用SPSS 13．0统计学软件对实验数据进行分析，数据以x±s表示。

方差齐，组间比较用LSD-t检验；方差不齐，组间比较用Dunnett T3法检验。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1成骨细胞的鉴定
在生化和组织化学上，成骨细胞的鉴定主要根据成骨细胞的特异性分泌蛋
白，如碱性磷酸酶、骨钙素和体外矿化的功能特征[2]。

成骨细胞碱性磷酸酶染色多数的细胞核和细胞质灰黑至深黑色颗粒状或片状沉淀显示强阳性，符合成骨细胞特征（图1），第5代细胞形成明显的矿化结节，茜素红染色呈橘红色（图2）。

2.2 成骨细胞增殖能力
结果表明，随着TGF-β浓度的增加，各组OD值增高，且呈浓度依赖性，实验组（2组，0.01 ng/ml；3组，100 ng/ml）与对照组（1组，0 ng/ml），组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.3 TGF-β对成骨细胞BMP-2、Cbfal基因表达的影响
结果表明，随着TGF-β浓度的增加，成骨细胞BMP-2、Cbfal基因表达增加，光密度比值增加，且呈剂量依赖性。

实验组BMP-2、Cbfal与对照组Gapdh，实验组组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）（图3，表2）。

3 讨论
骨质疏松已被WHO视为继心血管疾病后，第二大致残的健康问题。

随着社会的老龄化和生活水平的提高其患病率逐年增加。

目前在世界常见病、多发病中居第7位，仅我国患者已超过9 000万，即每14人中就有1人患不同程度的骨质疏松[3]。

成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞，是骨形成过程中的重要功能细胞，其主要功能是分泌骨基质。

TGF-β不仅调节骨和软骨细胞的生长，还能够介导多种细胞因子对骨的调节，在骨代谢调节过程中发挥重要作用。

本研究采用不同浓度的TGF-β刺激成骨细胞，结果表明随着TGF-β浓度的增加，成骨细胞增殖明显增加，100 ng/ml促增殖作用最强，即TGF-β对成骨细胞的促增殖作用具有浓度依赖性，还有学者分析发现TGF-β以时间和剂量依赖的方式，直接激活成骨细胞分泌的骨保护素（OPG）启动子的活性，促进OPG表达[4]，TGF-β对成骨细胞增殖作用机制有待进一步研究。

20世纪60年代末Urist提出了骨诱导理论[5]，证实生长因子是骨组织发生的决定因子，BMP是一种二聚物分子，来源于骨及骨源性细胞，是骨代谢的旁分泌产物，是唯一能够诱导异位成骨的因子，无论原位还是异位，BMP都将发挥决定性作用，没有BMP的存在就不能成骨[6]。

杜俊杰等[7]通过实验证明TGF-β可增强BMP-2诱导成骨中Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA 及碱性磷酸酶的表达，认为BMP-2有明显的诱导成骨性，而且TGF-β明显增强BMP-2在体内的诱导成骨作用，由此推测TGF-β促进成骨细胞的增殖、分化可能是通过增强BMP-2基因的表达所致。

核心结合因子（Cbfal）作为第一个被识别的成骨细胞特异性转录因子，表达于成骨细胞系早期，与骨钙素启动子特异性DNA序列结合，现已证明Cbfal是成骨细胞特异性表达的两个关键调控者之一，是最重要的一个成骨特异性基因。

Cbfal在成骨细胞系分化和成熟过程中起重要作用，对成骨细胞的分化和骨形成十分必要[8]。

Harada H等[9]对3种亚型Cbfal 功能进行研究，发现稳定转染Cbfal均可诱导或上调骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原mRNA的表达，与成骨细胞分化相关。

Sailer HF等[10]证实BMP-2能诱发骨形成，体外实验还发现BMP可以直接作用于成熟的破骨细胞来诱导其骨吸收活性。

动物实验表明BMPs成骨效应最广泛和彻底[11]。

Cbfal在成骨细胞系中高表达。

它除了能够结合骨钙素基因2于启动子区的成骨细胞顺时原件2并激活该基因的转录外,还能调节成骨细胞中多个基因[12-13]。

成骨是一个复杂的多因素参与过程，除了BMP等生长因子或激素外，细胞外基质也发挥一定作用，最近有研究证实TGF-β信号的Smad 2蛋白分子在成骨细胞的表达中对Cbfal基因的表达有调控作用。

本研究表明TGF-β能促进体外大鼠成骨细胞Cbfal基因的表达，且呈浓度依赖性。

综上所述，TGF-β可以通过调节多种细胞因子促进成骨细胞的增殖分化，其在骨代谢的调节网络中占有重要地位。

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