米醋中蜡状芽孢杆菌DNA提取及其ERIC_PCR体系建立

米醋中蜡状芽孢杆菌DNA 提取及其ERIC-PCR 体系建立
廖永红
任文雅
孙宝国
*
徐瑾沈晗
（北京工商大学化学与环境工程学院
北京100048）
摘要
以蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ）为试验材料，比较细菌基因组DNA 的提取方法。

将ERIC-PCR 应用于
醋液分离菌的研究，对此反应体系的主要因素进行优化，最终建立了适合于此菌种的ERIC-PCR 体系。

采用改良的传统细菌基因组DNA 提取方法，所提取的DNA 质量较高，能够满足ERIC-PCR 反应的需要。

反应体系：25
μL 反应体积10×扩增缓冲液（含Mg 2+）2.5μL ，20pmol/μL ERIC-PCR 引物E11μL ，20pmol/μL ERIC-PCR 引
物E21μL ，DNA 模板2μL ，2.5mmol/LdNTPs 混合液 2.0μL ，taq 聚合酶 1.1μL ，双蒸水补齐；PCR 反应程序为：94℃变性3min ，1个循环；94℃变性30s ，55℃退火40s ，72℃延伸1min ，30个循环；72℃延伸4min 。

关键词细菌；DNA 提取；ERIC-PCR ；优化
文章编号
1009-7848（2011）04-0007-07
食醋在生产过程中需要添加大曲、麦曲、酶母菌及醋酸菌等。

各种带菌的原料和工具因操作问题会带来细菌的污染。

虽然产品加热灭菌时，一些不耐热的微生物菌体残留在食醋中造成混浊沉淀，一些耐热的芽孢杆菌潜伏在醋中[1]，在适当的温度和营养条件下会缓慢生长，影响着米醋的风味及产品的质量。

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ）是一种在自然界中广泛分布的好气、中温、产芽孢的杆菌，是食品和化妆品中常见的污染菌。

它同昆虫病原菌苏云金杆菌，人畜病原菌炭疽芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌组成芽孢杆菌属蜡状芽孢杆菌组，它们的形态特征、生理生化特征非常相似，并有着极高的DNA 同源性。

因为蜡状芽孢杆菌广泛存在于土壤、空气、水和尘埃中，所以无法避免地会污染到食品中。

ERIC-PCR （Enterobacterial Repetitive Inter -genic Consensus ，肠细菌基因间共有重复序列）技
术是在随机引物PCR （RAPD ）的基础上发展起来
的[2-4]。

ERIC-PCR 的原理[5-6]是：许多革兰阴性杆菌中存在一段长度为126bp ，以多拷贝形式存在的反向重复序列。

这段序列分散分布于基因组中，具有高度的保守性，在不同种间仅有拷贝数和位置变化。

依据此重复序列设计引物，提取细菌基因组的总DNA ，并对其进行PCR 扩增，其保守、独特的位置使这种PCR 能产生多种独特的扩增产物（50~3000bp ）。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离形成DNA 指纹图谱（DNA 迁移带），可根据这些电泳条带来区分细菌的株（型）。

在一定范围内，
DNA 迁移带的大小和多少代表着此重复序列间
的距离和重复次数。

因此，基因组DNA 的差异可清晰显示在指纹图谱上。

这样，对混合微生物群落结构的分析就转化为对其DNA 指纹图谱的分析。

本试验以某企业提供的米醋为原材料，进行菌种分离纯化，获得纯菌株后进行基因组DNA 提取方法研究和ERIC-PCR 反应体系的优化。

1
材料与方法
1.1
试验材料
米醋：企业提供的瓶装米醋，肉眼观察有明显
沉淀。

1.2主要试剂和仪器
T6型新世纪紫外-可见分光光度计，北京普
收稿日期：2010-07-26
基金项目：国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAC11B06）
资助
作者简介：廖永红，女，1965年出生，教授通讯作者：孙宝国
Vol．11No．4Jul ．2011
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中国食品学报
第11卷
第4期
2011年7月
中国食品学报2011年第4期
析通用仪器有限责任公司；DK-S22型数显恒温水浴锅，江苏太仓实验设备厂；130s超净工作台，北京赛伯乐实验仪器有限公司；LRH-250型生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Anymicro Dss 显微镜，奥林巴斯；安莱Alphalmager Hp紫外凝胶成像系统，安莱；Dyc-33A型电泳槽，北京六一厂；TC-XP-G型PCR热循环仪，杭州博日。

1.3培养基
土豆、麦芽汁、细菌、营养琼脂培养基、LB液体培养基[7-8]。

1.4细菌的分离与纯化
无菌条件下，将米醋瓶盖打开，混合均匀后，定量采取试验醋样，离心收集沉淀。

用生理盐水将沉淀打散，选取适宜的稀释度后，以涂布平板法分别涂于土豆、麦芽汁、细菌和营养琼脂培养基平板上，37℃培养48h，检查菌落出现情况。

取单菌落，用接种针挖掘一小块菌体移植于另一平板培养基上，37℃培养，再从长有单菌落的平板中选取典型的细菌菌落，取菌体制成悬液，涂布培养、用革兰氏染色法对细菌染色，在显微镜下观察其形态、颜色，并照相，重复培养2~3次以分离纯化菌种。

将纯化了的细菌转接到营养琼脂斜面上培养，待生长完好后置于4℃冰箱中保存。

1.5细菌基因组DNA的提取
1.5.13种提取基因组DNA的方法比较
方法1：取单菌落接种于5mL相应的培养基中，在合适的温度下培养。

根据细菌的生长率不同培养时间可由几小时到几天不等。

1）取1.0mL菌液于1.5mL离心管中，13000 r/min离心2min，弃上清。

沉淀重悬于1.0ml0.85% NaCl中，用枪头吸打菌体使之混匀，散开。

室温13000r/min离心2min，弃上清。

沉淀重悬于550μL1×TE中。

2）加8μL蛋白酶K（20mg/mL），颠倒混匀，37℃温育30min。

加40μL10%SDS，颠倒混匀，37℃温育30min，应为澄清的。

加100μL5mol/L NaCl充分混匀。

加80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min。

3）加等体积（0.7~0.8mL）氯仿/异戊醇（24∶1），轻轻振荡混匀。

室温，14000r/min离心12min（可看到分3层）。

将上清液转移到一新1.5mL离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）轻轻振荡混匀。

14000r/min离心10min。

4）将上清液转移到一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24∶1）轻轻振荡混匀。

14000 r/min离心10min。

将上清液转移到一新1.5mL离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，颠倒混匀后，-20℃静置30min。

室温14000r/min离心8～10min。

弃上清，加500μL70%乙醇，轻轻颠倒数次（洗盐）。

5）室温14000r/min离心3min。

弃上清，倒置离心管，干燥DNA沉淀10~15min。

DNA沉淀溶于60μL ddH2O中，-20℃保存备用。

方法2：在方法一的基础上改进而成，即在步骤（2）和步骤（3）之间增加下述步骤，加入8μL 10mg/mL的Rnase，于37℃温浴1h。

其余步骤与方法一相同。

方法3：
1）取1.0mL菌液于1.5mL离心管中，13000 r/min离心2min，弃上清。

沉淀重悬于1.0mL0.85% NaCl中，用枪头吸打菌体使之混匀，散开。

室温13000r/min离心2min，弃上清。

沉淀重悬于550μL1×TE中。

2）加20μL溶菌酶（100mg/mL），颠倒混匀，37℃温育30min。

3）加40μL10%SDS和8μL10mg/mL的Rnase，颠倒混匀，37℃温浴1h。

4）细胞匀浆再用8μL蛋白酶K（20mg/mL）消化，37℃温育30min。

其余步骤与方法一相同。

1.5.2DNA质量检测
1）琼脂糖凝胶电泳检测：将所得DNA样品进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，采用100V电压，电泳1h，EB染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。

2）DNA纯度、浓度及提取率检测
取少量DNA样品稀释100倍，用紫外分光光度计测定波长260、280nm处的吸光度值。

DNA 纯度的定性检测，通过A260/A280比值可以检测所提DNA是否纯。

通常纯DNA样品A260/A280≈1.8，若A260/A280＞1.9，可能有RNA污染；若A260/A280＜1.6，可能有蛋白质污染。

DNA质量浓度（μg·mL-1）=A260×50×稀释倍
8
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数（注：1OD 值相当于50μg/mL 双螺旋DNA ）。

1.6ERIC-PCR 反应体系的建立和优化
选取菌种的基因组DNA 和ERIC-PCR 的通
用引物后进行PCR 反应体系的建立和优化试验，分别从对TaqDNA 聚合酶、dNTPs （三磷酸脱氧核
糖核苷）、引物、退火温度、循环数几个方面做单因素试验，找出各自适合的条件，而且每个合适的条件确定以后都被作为后续研究的一个条件。

通过各个因子的组合对ERIC-PCR 反应体系的条件进行筛选优化。

各个因素的梯度设置见表1。

Taq 聚合酶/μL 0.30.50.70.9 1.10.5dNTPs/μL
1.6 1.8
2.0 2.2 2.42引物添加量/μL 0.40.60.81 1.21退火温度/℃555658606358循环数
20
23
25
30
\
30
12345因素
每种因素的改变量编号
共用的影响因素
表1影响ERIC-PCR 反应因素的优化梯度设置
Table 1
The optimization design for influencing factors of ERIC-PCR
PCR 结束后点样于1%的琼脂糖凝胶中电泳，
根据条带的有无以及清晰程度和特异性来确定影响因素的最终浓度。

ERIC-PCR 的程序如下：94℃
3min ；94℃30s ，58℃40s ，72℃1min ，30个循
环；72℃4min ；4℃保存。

1.7
16SrDNA 分子鉴定
利用本文1.4节的方法将分离得到的菌种进行16SrDNA 分子生物学鉴定。

1）利用LB 培养基培养3mL 新鲜细菌菌液，提取细菌DNA 。

2）细菌16S rDNA 序列扩增
利用细菌16S
rDNA 扩增通用引物27F 和1492R 引物扩增细菌16S rDNA 序列。

引物信息：27F ：5′-GTGCT -GCAGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′；1492R ：5′-CACGGATCCTACGGGTACCTTGTTACGACTT-3′。

3）细菌16S rDNA 序列测定利用引物27F 和1492R 对细菌16S rDNA 序列进行双向测序。

测序完成后，对其序列进行拼接。

4）细菌16S rDNA 序列比对登陆NCBI 网站，利用Blast 软件对细菌16S rDNA 序列进行序
列进行比对，获得其最相似细菌，确定样品细菌的种属信息。

2
结果与分析
2.1
菌种的分离与纯化
将灭菌后的醋液和未灭菌的醋液分别取
0.1mL 涂布于土豆、麦芽汁，细菌，营养琼脂培养
基上进行好氧和厌氧培养，结果发现菌种在有氧条件下生长状态优于无氧情况，从营养琼脂和土豆培养基上分离到所要细菌，经过反复纯化后的菌种用于基因组DNA 的提取。

2.2菌种的形态特征
蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ），两端钝圆，
一般短链到长链。

有芽孢，呈椭圆形，位于中央或近中央。

周生鞭毛。

蜡状芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，经过染色后呈紫色，生长时需氧和兼性厌氧，生长温度范围5～30℃，10℃以下停止繁殖。

菌种的显微镜照片见图1。

2.3DNA 提取方法的比较结果
基因组DNA 的提取是进行ERIC-PCR 反应
的第一步，是进行ERIC-PCR 反应的基础条件，所提取的基因组DNA 的质量直接关系着ERIC-
PCR 扩增能否产生清晰和重复性较好的条带。

因
此，在进行PCR 之前有必要对菌种DNA 提取方法进行优化。

本试验比较了3种细菌基因组提取方法。

用紫外分光光度计检测，结果见表2。

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中国食品学报
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从DNA 提取结果来看，方法1的A 260/A 280值为1.07，说明有蛋白存在，而方法2是在方法一的基础上进行了改进，即多加了Rnase ，去除了RNA 的干扰，所提取的DNA 的质量较高，其A 260/A 280值为1.85，而且其浓度大小比较适中，能够满足ER -IC-PCR 的DNA 模板的需要。

方法3为溶菌酶方法，溶菌酶可以作用于革兰氏阳性菌的细胞壁，具有降解其肽聚糖的作用。

从结果上可以看出，方法3提取的DNA 浓度较大，而且A 260/A 280值为1.90，也基本上满足要求。

但是此方法所用的时间比较长，而且试验成本也较大，从实际应用的角度上来说并不是最佳的DNA 提取方法。

所以，综合考虑，方法2为少量提取该菌种
DNA 的最佳方法。

采用方法2提取的基因组DNA 经过1.0%的琼脂糖电泳检测，结果如图2。

由图2可以看出，此方法所提取的DNA 质量较好而且没有RNA 杂带，同时也没有蛋白质和糖类的污染。

此基因组DNA 可以用于接下来的
ERIC-PCR 试验。

2.4
ERIC-PCR 反应体系影响因素的优化
ERIC-PCR 技术的扩增结果受到很多因素的影响。

一般能影响PCR 扩增的因素均可影响到ERIC-PCR 扩增的结果。

如Taq 聚合酶、dNTPs 、引物、退火温度以及循环数等。

因此本试验对以上5
个因素进行了单因素优化，建立起适合本实验室的ERIC-PCR 体系。

2.4.1Taq 酶的优化Taq 酶的活性与用量直接
关系到PCR 扩增的成败，是ERIC-PCR 反应体系
的前提因素。

酶量过多易发生非特异反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能会下降。

Taq 酶的浓度如果太低，则合成的产物量减少；如
果浓度过高，可能引起非特异性扩增。

Taq 酶选择
的量为0.3、0.5、0.7、0.9、1.1μL ，其扩增结果电泳如图3（条带1~5）所示，由图可以看出Taq 酶的量为1.1μL 的时候条带比较亮，条带在750~500bp 之间。

2.4.2三磷酸脱氧核苷酸的影响dNTP 浓度的
变化对于ERIC-PCR 条带的数量和强弱影响明显，当dNTP 浓度不足时，扩增产物减少；而当
dNTP 浓度过高时会使扩增错误配对的几率大大增加，过高的dNTP 可与Mg 2+结合，使得反应体系
中Mg 2+总量下降，Taq 活性受到影响。

dNTPs 加入量为1.6、1.8、2.0、2.2、2.4μL ，其扩增电泳如图3（条带6~10）所示，可以看出dNTP 的量为2.0μL 的时候，DNA 条带明亮且没有杂带。

2.4.3引物浓度对ERIC-PCR 的影响引物浓度
主要影响扩增产物的特异性，引物浓度变化实质上是改变引物与模板之间的配比几率，从而影响扩增效率。

引物浓度如果偏低，就会受到竞争的抑
图1
100倍菌种显微镜图
Fig.1Micrographs of bacteria （×100）
项目
方法1
方法2
方法3
DN 质量浓度/μg ·mL -1
125519002100A 260/A 280
1.07
1.85
1.90
表2
3种不同方法提取DNA 的比较Table 2
The comparison of the three methods
for DNA extraction
图2菌种DNA 提取物的凝胶电泳图谱
Fig.2
Agarose gel electrophoretogram of bacterial
DNA extraction
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制，引物和模板结合的几率下降，有可能扩增不出来，或者造成条带过浅、缺失等现象。

引物浓度过高会引起错误和非特异性产物增加，同时增加引物之间形成二聚体的几率，也可能造成扩增产物的缺失。

本试验通用引物进行扩增，梯度设置如下：
0.6、1、1.4、1.8、2.2μL ，扩增产物电泳结果如图3
（条带11~15）所示，由图3可以看出引物的量为
1.0μL 的时候比较好。

引物量少，条带颜色浅，且
出现杂带。

1
2
3
4
5
M
6
7
8
9
10
M 11
12
13
14
15
M1
700bp
1000bp
注：1~5：Taq 酶量为0.3、0.5、0.7、0.9、1.1μL ；Marker ：D2000；6~10：dNTP ： 1.6、1.8、2、2.2、2.4μL ；
11~15：引物添加量为0.4、0.6、0.8、1、1.2μL ；0：阴性对照；M1：D15000。

图3优化后ERIC-PCR 扩增产物的凝胶电泳图
Fig.3Agarose gel electrophoretogram of ERIC-PCR amplification products after optimization
2.4.4退火温度对ERIC-PCR 的影响退火温度是影响PCR 反应的重要因素之一，决定PCR 产物扩增的特异性，温度高特异性强，但温度过高使引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低会使产量提高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加，合适的退火温度一般在
45~68℃之间。

试验设置的温度梯度为：55、56.2、58.5、60.6、63.1℃，扩增产物电泳结果见图4，由图
可以看出，退火温度升高，会造成条带的缺失，经过反复的试验后得出最佳退火温度为55℃。

2.4.5循环数对ERIC-PCR 的影响循环次数的
设定可根据模板DNA 的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定30~40个循环。

循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。

所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

本试验设计的循环次数为20、25、30个循环，经PCR 试验确定30个循环为最佳循环数。

2.5ERIC-PCR 反应体系的建立
经过对影响ERIC-PCR 反应的各个因素的优
化，建立了适合于本实验室的PCR 反应体系：在
25μL 的反应体积中ERIC-PCR 反应体系成分为：25μL 反应体积10×扩增缓冲液（含Mg 2+）2.5μL ，20pmol/μL ERIC -PCR 引物E11μL ，20
pmol/μL ERIC-PCR 引物E21μL ，DNA 模板2μL ，2.5mmol/L dNTPs 混合液2μL ，taq 聚合酶1.1μL ，双蒸水补齐；ERIC-PCR 反应程序为：94℃变性3min ，1个循环；94℃变性30s ，55℃退火40s ，72℃延伸1min ，30个循环；72℃延伸4min 。

2.6
16SrDNA 分子鉴定结果
登陆NCBI 网站，利用Blast 软件对细菌16S rDNA 序列进行序列比对，获得其最相似细菌，确1
2
3
4
5
M
1000bp
250bp
图4ERIC-PCR 最适退火温度选择
Fig.4Selection of the best annealing temperature
for ERIC-PCR
注：1~5：依次为55、56.2、58.5、60.6、63.1℃；0：阴性对照；
M ：D15000。

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中国食品学报2011年第4期
定样品细菌为蜡状芽孢杆菌。

NCBI登录号为AE017194，相似度为99%。

3讨论
基因组DNA的质量对ERIC-PCR反应有着重要的影响，它决定了PCR的成功与否。

而提取的DNA的方法因试验材料的不同也有所区别，本试验比较了3种提取DNA的方法，基本上是传统方法和溶菌酶方法的比较，溶菌酶的方法提取的DNA的总量很高但是纯度不高。

方法二是在传统方法上进行了改进，在中间的过程中加入了Rnase 降解步骤，基本上解决了RNA污染的问题，是提取蜡状芽孢杆菌的最适合方法。

方法三加入了Rnase和溶菌酶，但是由于成本比较高和时间相对长而受到限制。

ERIC-PCR技术具有DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低、操作技术简单等特点。

但由于其使用的是通用引物，所以合适的PCR条件是决定成功与否的关键性因素。

扩增条件的变化会对ERIC-PCR图谱产生很大的影响，从而影响ERIC-PCR分析的准确性。

而条带的准确性是进行PCR分析的重要前提条件。

在PCR反应中由于反应体系不适宜则会出现2种极端的现象，一种是非特异性扩增严重，产生许多不确定的产物甚至无目的条带，另一种是扩增不到任何产物。

这时需要通过改变Taq酶的用量、dNTP浓度、引物用量、Mg2+浓度、退火温度、循环数等加以优化。

本试验采用了单因素递进筛选法，以上一轮筛选出的值用于下一个因素的筛选，层层递进的方式，经过比较和分析，建立稳定且适合该菌种的ERIC-PCR体系为：25μL反应体积10×扩增缓冲液（含Mg2+）2.5μL，20pmol/μL ERIC-PCR引物E11μL，20pmol/μL ERIC-PCR引物E21μL，DNA 模板2μL，2.5mmol/L dNTPs混合液2μL，taq聚合酶1.1μL，双蒸水补齐；ERIC-PCR反应程序为：94℃变性3min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸4min。

参考文献
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consensus（ERIC）primers is not necessarily directed at ERIC elements[J].Lett Appl Microbiol，1997，25（1）：17-21.
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Extraction of Bacillus cereus DNA in Vinegar and the Establishment of ERIC-PCR System
Liao Yonghong Ren Wenya Sun Baoguo*Xu Jin Shen Han
（College of Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing100048）Abstract Bacillus cereus was used as experimental materials.The method of genomic DNA extraction was studied 12
第11卷第4期
in Bacillus and the conditions of ERIC-PCR.Finally ，ERIC-PCR reaction system suitable for our lab was established.The results showed that high-grade genomic DNA which could meet the requirements of PCR reaction was obtained by the modified methods.The established ERIC-PCR reaction system was as follows ：10×Buffer （Mg 2+）2.5μL ，20pmol/μL primer E11μL ，20pmol/μL primer E21μL ，DNA template 2μL ， 2.5mmol/L dNTPs 2μL ，Taq polymerase 1.1uL ，ddH 2O 15.4μL ，25μL reaction volume.The reaction program of PCR was devised as follows ：3min degeneration at 94℃
（one cycle ），then 30s degeneration at 94℃，40s annealing at 55℃，and l min extension at 72℃（30cycles ），and
then 4min final extension at 72℃.
Key words
bacillus ；DNA extraction ；enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR （ERIC-PCR ）；optimization
盐会像香烟和麻醉品一样让人上瘾
英国《每日邮报》网站7月12日报道题：为什么盐会上瘾：它就像香烟和麻醉品一样刺激脑细胞。

研究人员说，盐会像香烟和麻醉品一样让人上瘾，对盐的渴求会刺激同样的基因、脑细胞和大脑连接神经元。

这一发现将有助于解释，为什么许多人明明知道盐会影响血压和心脏健康，却仍然难以控制盐的摄入量。

在研究中，澳大利亚和美国的科学家给一组实验鼠提供低盐食物，另一组则进行盐水滴注。

他们将这些老鼠的脑部活动与正常饮食的老鼠的脑部活动进行了比较。

他们还让一些老鼠3天不摄入盐，然后再让它们尽情喝盐水，在此过程中观察它们的脑部活动。

当老鼠需要盐时，脑细胞就会产生与海洛因、可卡因和尼古丁等上瘾物质有关的蛋白质。

墨尔本大学教授德里克·登顿说：“在这项研究中，我们发现，对盐的本能需求会产生促使对鸦片和可卡因上瘾的神经结构。

”研究还显示，摄入盐之后，大脑在盐还没有真正进入血液系统并流经大脑之前就已感到满足。

研究人员说，盐对整体健康的重要性意味着，人对盐的需求是深深植根在大脑中的“古老本能”。

这也能解释为什么我们对咸味食物如此偏爱。

试验还显示，阻止老鼠从吃盐中获得快感能在一定程度上减少它对盐的需求。

研究报告发表在《国家科学院院刊》（PNAS ）上。

（消息来源：新华网）
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