朱玉贤《分子生物学》课件Part 1 Replication 复制

DNA 通过半保留方式进行复制
课后作业： 请阅读教材P39~40和补充资料的 有关内容，然后以图解说明的方式解释DNA的 半保留复制机理。
（注：半保留复制机理的证实实验被誉为最美丽的实验之一。本 作业目的是促进同学们自主阅读、学习回忆和进一步深入掌握复 制的基本特征，有利于培养同学们良好的思维习惯。该作业占最 后评分的5%。 ）
复制起点（Origin） ：复制起始的固定位点。一般具
有特定的序列，并可以通过之与相关的调控因子结合而 形成复制引发体。
13 bp repeats
GATCTNTTNTTTT
9 bp reverse repeats
TTATCCACA
Distribution of repeats in oriC of E.coli DNA
引物前体转录起点
RNaseH: 降解RNA使之3’-OH暴露。
RNA引物前体500nt
反义RNA
复制起点 反义RNA转录起点
反义RNA的合成以及它与引物前体的结合阻止了RNaseH 的作用；
反义RNA的浓度决定了胞内有效引物的浓度，从而影响复 制的起始。
正调控: 由G1期积累的执照因子参与
复制的终止和子代分子的分离
终止：Tus蛋白+终 止陷阱
子代分离：拓扑异 构酶IV；XerCD蛋 白（位点特异的重 组酶）
1-3、复制的模型
Replication Models
θ复制 （ θ model） 滚环复制（Rolling-circle replication） D-环复制（Displacement-loop model）
150
2200
复制的过程
起始：引发体的形成 延伸：复制体形成以及单脱氧核糖核苷酸的添
加导致新链的延长 终止：子代双链分子的分离
复制的过程 起始：引发体的形成
引发体：在复制起点由多种不同的相关蛋白组合成引 发前体后结合引发酶而形成的复合物。
引发前体 Preprimosome
复制体的形成和新链的延伸
负调控：G2期积累增殖 蛋白，它能够阻止Mcm 因子装配到新合成的 DNA上而防止同一细胞 周期内的重复复制起始。
本章小结：
重点掌握内容：
证实复制的半保留、半不连续复制机理的实验（自主学习并 掌握）
复制起点和复制的引发；大肠杆菌复制的终止 复制的方式 复制的调控
难点：
复制的引发 复制的调控 端粒和染色体末端的防缩短机制
负责DNA复制的聚合酶--DNA pol Ⅲ的功能特征：
多亚基酶，其聚合和外切活性有不同的亚基承担
5’ →3’的聚合功能：α亚基
3’ →5’的外切功能：ε 亚基
核心酶 Pol Ⅲ’
Г 亚基
滑 动 钳
钳载复合物
图4-17 DNA解链酶的作用模型
图4-18 E. coli-SSB与单链DNA结合的协同效应
甲基化对复制的控制：
Dam甲基化酶—对GATC位点的甲基化 DnaA蛋白--识别全甲基化的复制起点
CH3
GATC CTAG
CH3
全甲基化OriC
第一次复制
GATC CTAG
CH3
半甲基化OriC
起始第二次复制
Dam甲基化酶
CH3
GATC CTAG
CH3
全甲基化OriC
质粒ColEⅠ：反义RNA对复制的调控
Part 1 DNA Replication
DNA复制
本章主要内容
1. 复制的基本特征—以原核生物的复制为例 2. 真核生物复制的特征 3. 复制的调控
1、复制的基本特征
--以原核生物的复制为例
半保留、半不连续复制；5’ →3’的新链延伸方向 复制的体系 复制的详细机制 复制的模型
θ复制/凯恩斯模型 （ θ model/Cairns model）
H+
H+ H+
A
H+
C
A
H+ B
B
Cairns, J.P.: Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 28:44, 1963.
C 注：红色线条表示反射性同位素标记的新链， 经过放射自显影后可在感光胶片上显示出来。
复制子（Replicon） ：复制的单位。一个复制子只含
一个复制起点。
物种
大肠杆菌 酵母 果蝇 蟾蜍 蚕豆 小鼠
复制子数目 复制子平均长度 复制子移动的速度
（个）
（kb）
（bp/min）
1
4200
50000
500
40
3600
3500
40
2600
00
300
？
25000
端粒酶（端粒末端转移酶 Telomere terminal transferase）: 真核生物特有的维持端粒完整性 的酶，含有特定的小分子RNA分子。
3’ 3’ 3’ 3’
当端粒酶催化合成足够长的G链后，G链回折形成Hoogsteen结 构，且末端和另一链的末端连接，形成封闭的染色体末端。
CCCAACCCCAACC………..GGGG… GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG…
1-1、复制的体系 Replication System
模板DNA （Template） 单脱氧核糖核酸 RNA 引物（Primer） 酶和蛋白质因子
DNA聚合酶（DNA polymerase） 解链酶（helicase） 单链结合蛋白（single-strand binding protein, SSB） DNA引发酶（primase） DNA 拓扑异构酶（topoisomerase） DNA连接酶（ligase） 端粒酶（端粒末端转移酶 telomere terminal transferase,
DNA聚合酶（DNA polymerase） 解链酶（helicase） 单链结合蛋白（single-strand binding protein, SSB） DNA引发酶（primase） DNA 拓扑异构酶（topoisomerase） DNA连接酶（ligase） 端粒酶（端粒末端转移酶 telomere terminal transferase, TTT）
（真核生物内）
1-2、复制的详细机制
Detailed Mechanism of DNA Replication
复制起点（Origin）和复制子（Replicon） 复制的过程
起始：引发体的形成 延伸：复制体形成以及单脱氧核糖核苷酸的添加导致
新链的延长 终止：子代双链分子的分离
复制起点和复制子
培养 接种M13噬菌体
有 RF型
（以上实验证实M13DNA的复制需要RNA的合成）
E.coli: Rif s (利福平敏感)
接种M13噬菌体 培养 加入：利福平
有 RF型
（该实验证实当复制已经启动后，RNA分子合成与否不会影响复制的进行）
1-1、复制的体系 Replication System
模板DNA （Template） 单脱氧核糖核酸 RNA 引物（Primer） 酶和蛋白质因子
滚环复制 Rolling-circle Model
前导链
滞后链
D-环复制 D-loop Model
原核生物复制的主要特征
单复制子 营养充足时，可在一个复制子内起始多次复制。
第一次复制的复制叉
第二次复制的复制叉
2、真核生物复制的基本特征
多复制起点和多复制子 只有当所有的复制子完成复制后，才能在起始
G=G Hoogsteen结构
G链
3、复制的调控：主要是对复制起始的控制
原核生物：
甲基化对复制的调控： Col E1质粒：反义RNA对复制的负调控
真核生物：
正调控：由G1期积累的执照因子控制 负调控： G2期积累增殖蛋白，它能够阻止Mcm因子装配到新
合成的DNA上而防止同一细胞周期内的重复复制起始
点上起始下一次的复制；而且，真核生物的复 制严格控制在S期，一次分裂复制一次。 端粒酶 ： 避免染色体末端缩短的机制
5’
3’
缺口
3’
突出末端
缺口
避免线性DNA末端缩短的机制
端粒和端粒酶：大多数真核生物
端粒（Telomere）：真核生物中由染色体末端的 短重复序列和相关蛋白质组成的特殊结构，对维 持染色体的稳定性起着重要作用。
图4-22 E. coli引发酶的结构模型
T噬菌体线性DNA：
TTT） （真核生物内）
证实复制引物为RNA分子的实验之一：
+链 M13噬菌体DNA
+链
侵染大肠杆菌E.coli并利
-链
用其中的酶等进行复制
复制型（RF型）DNA
加入：利福平 E.coli: Rif s (利福平敏感)
培养 接种M13噬菌体
无 RF型
加入：利福平 E.coli: Rif r (利福平抗性)