桃树病毒病RNA-seq检测分析

安徽农学通报2023年23-24期
资源·环境·植保
基金项目河南省重大科技专项（201300110500）。

作者简介
郝明悦（1995—），女，河南林州人，硕士，从事桃种质资源与遗传育种工作。

*通信作者收稿日期
2023-09-13
桃树病毒病RNA-seq 检测分析
郝明悦1马晓锋2
堵
墨3*
（1中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009；
2
无锡市惠山区农业农村局，江苏无锡214174；3
无锡市惠山区农业技术推广服务站，江苏无锡214174）
摘要选择一桃园内的17份样品，利用转录组测序进行病毒及类病毒鉴定，并用qRT-PCR 验证特定病毒
的检测情况。

结果表明，在17份样品中，共检出10种病毒，其中柑橘裂皮类病毒（CEVd ）和桃病毒T （PeVT ）感染率分别为58.82%和47.06%；其他8种病毒的感染率为5.88%~17.56%。

17份样品中，仅1份种质没有病毒检出；有8份种质感染1种病毒；其余8份种质感染2~5种病毒。

研究了解了桃产业的病毒病感染情况，对提出相应的防治措施提供参考。

关键词桃；柑橘裂皮类病毒；转录组测序；荧光定量PCR 中图分类号
S662.1
文献标识码A
文章编号1007-7731（2023）23-24-0123-05
The virus detection and analysis based on RNA-seq technology of peach crop
HAO Mingyue 1MA Xiaofeng 2DU Mo 3*
（1Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,China;
2
Agriculture and Rural Bureau of Huishan District,Wuxi 214174,China;
3
Agricultural Technology Extension Service Station in Huishan District,Wuxi 214174,China ）
Abstract A total of 17samples from a peach orchard were selected to perform transcriptome sequencing to detect
viruses and viroids.After that,a quantitative RT-PCR was used to verify the detection of specific viruses.The results showed that a total of 10viruses were detected in these samples,among which the infection rates of Citrus exocortis viroid (CEVd)and Peach virus T (PeVT)were 58.82%and 47.06%,respectively.The infection rate of the other 8viruses ranges from 5.88%to 17.56%.Out of 17samples,only 1haven't found any virus,8germplasms were infected with 1virus.The remaining 8samples were infected with 2-5viruses.The research results has gained an understanding of the virus infection situation in the peach industry,laying a theoretical foundation for proposing corresponding prevention and control measures.
Keywords peach ；Citrus exocortis viroid ；RNA-seq ；fluorescence quantitative PCR
病毒是非常微小的生命体，与人类生活息息相关。

果树受植物病毒感染时，会出现寿命缩短、生长衰退、抗逆性减弱、产量降低和品质变劣，其生产效益明显下降等。

树体一旦被侵染，将长期带毒，持续危害，采用化学药剂很难进行有效控制。

目前果树病毒性病原检测方法主要包括指示植物法、电子显
微镜观察法、免疫学方法以及以分子生物学为基础的检测方法等。

其中指示植物法检测速度慢，电子显微镜观察法对仪器条件要求高，免疫学检测法目标病毒少，分子生物学检测法在近年来较为常用。

基于分子生物学为基础的检测方法，可细分为定量PCR （qRT-PCR ）、普通转录组（RNA-seq ）和small RNA 测序等[1]，在生产中均有应用。

桃在生长发育过程中易受多种病毒的侵染，目
前已鉴定的桃病毒及类病毒36种[2]。

其中李痘病毒（Plum pox virus ，PPV ），主要通过嫁接或蚜虫传播，
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资源·环境·植保
会引起寄生植物叶片扭曲褪绿、叶脉黄化、果实畸形和变小、叶面出现萎黄斑等症状，严重的还会导致果实成熟前大量脱落；桃潜隐花叶类病毒（Peach la⁃tent mosaic viroid ，PLMVd ）主要通过嫁接传播，会引起桃叶片、枝干和果实白化，花叶黄化和褪绿等症状[3]。

病毒病感染后通常会影响果实产量和品质，
缩短果园的生产年限，造成经济损失。

在桃上，有不少利用转录组测序进行病毒检测的报道。

如He 等[4]对表现小果、裂果症状的桃树进行小RNA 测序，除了已知的病毒外，还发现了一种新的蚕豆萎蔫病毒属病毒。

周俊[5]通过分析桃不同种的病毒携带情况，发现普通桃检出的病毒种类明显多于光核桃、山桃和甘肃桃，其中光核桃、山桃、甘肃桃和普通桃中均检出的病毒有桃相关黄症病毒属病毒和桃潜隐花叶类病毒，说明这两类病毒可能在桃驯化早期已经存在于其野生近缘种中，并随着桃树的演化途径进行传播。

本研究选择一老桃园，随机采集17棵单株，采用RNA-seq 鉴定其病毒携带情况，并采用qRT-PCR 进行验证，了解该地区果树病毒病发生现状，为果园的安全生产提供建议。

1
材料与方法
1.1
试验材料
采用随机取样法，在一老桃园内，采集17份种
质（树龄15年，栽培管理一致，砧木为新疆毛桃）的幼嫩叶片，部分叶片黄化疑似感染病毒（图1）。

幼叶用液氮冷冻后，
置于超低温冰箱保存备用。

图1
黄化叶片症状
1.2试验方法1.
2.1
RNA 提取
使用RNA 快速提取试剂盒（华
越洋，北京，中国）提取供试样品的RNA ，具体步骤参见试剂盒使用说明书。

提取的总RNA 置于-80℃冰箱备用，测序前检测RNA 的纯度及完整性。

1.2.2
普通转录组测序
提取的RNA 由北京诺
禾致源生物科技有限公司进行建库测序。

主要建库方法如下：在RNA 反转录合成双链cDNA 后，经过末端修复、加polyA 尾并连接测序接头，筛选其中250~300bp 的cDNA ，进行PCR 扩增并纯化，构建的文库用Hiseq Xten 测序。

普通转录组测序完成后，去除接头，去除含N 的reads ，去除低质量的reads ，然后将纯净reads 进行简单组装并比对至GenBank Virus RefSeq Nucleotide ，
统计出其中与病毒序列相似性E 值≤1.0E -10，Identity ≥90%的reads 数，计算各病毒的峰度。

1.2.3
qRT-PCR 验证
针对前期转录组检测结
果，选择其中的PLMVd ，设计引物进行qRT-PCR 验证。

引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，qRT-PCR 扩增使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 试剂盒（Vazyme ，南京，中国）进行，总体
系50µL 。

PCR 反应程序为95℃5min 预变性；95℃10s ，60℃退火10s ，72℃延伸10s ，45个循环；72℃共5min 。

当PCR 的CT 值在15~35，认定该样品被病毒感染；超过35则认为病毒含量过低，认定
为无病毒检出。

具体引物序列如表1所示。

表1
用于qRT-PCR 病毒检测的引物序列
病毒名称
桃潜隐花叶类病毒
PLMVd 桃内参基因
引物（5'-3'）
上游下游上游下游
AACTGCAGTGCTCCGAATAGGGCAC CCCGATAGAAAGGCTAAGCACCTCG GATTCCGGTGCCCAGAAGT CCAGCAGCTTCCATTCCAA
产物
大小/bp 33858
2
结果与分析
2.1
转录组测序
供试的17份样品测序共获得805918176个原
始reads ，其中低质量的reads 占比0.44%，标记为N 即序列缺失的reads 占比0.14%，接头污染的reads 占
比为4.46%。

-
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去除上述3种类型的序列后，纯净reads达到94.96%，总测序量达到114.79Gb，平均测序量为6.75Gb（表2），数据量足够用于分析病毒携带情况。

表2用于RNA测序的样品名称和测序结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
报春
酸桃
早久保
上山大玉露
京蜜
西农18号
红油桃6号
南方甜桃
血桃
脆肉桃
47331984
47002940
49287700
47697738
43149264
47612316
46064786
49002344
47447986
49583626
93.48
96.63
96.65
96.73
94.70
95.36
95.91
94.45
92.46
94.08
6637052700
6812631600
7145198700
6920866800
6129144600
6810669600
6627250800
6942156300
6580643700
6996963600
样品编号
样品名称
原始Reads
数量
纯净Reads
比例/%
Clean Bases
数量/bp
11
12
13
14
15
16
17
早桃
红凤
郑14-12-27
垮喜桃
郑96-9-58
北京晚蜜
单瓣紫桃
48942914
48334136
43899972
46974998
48887154
50233354
44464964
94.35
94.75
95.86
96.84
96.60
91.81
93.70
6926838300
6869456700
6312110100
6823302300
7084069200
6917648400
6249636900
续表2用于RNA测序的样品名称和测序结果
样品
编号
样品名称
原始Reads
数量
纯净Reads
比例/%
Clean Bases
数量/bp
2.2转录组检测病毒
将纯净reads组装后与NCBI的病毒库进行比
对，如图2所示，样品红油桃6号组装后的contigs与
桃病毒T（Peach virus T，PeVT）具有较高的相似性，
即认为该样品感染了PeVT
病毒。

图2红油桃6号的测序序列与病毒PeVT序列的比对情况
如表3所示，17份样品共检测出10种病毒，总
体带毒率达到94.12%。

其中CEVd感染率高达58.82%；PeVT感染率为47.06%；其次为PLMVd、亚洲李属病毒（Asian prunus virus，APV）和樱桃绿环斑驳病毒（Cherry green ring mottle virus，cgrmv），感染率均为17.65%；再次为啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid，HSVd）、李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）和桃病毒D（Peach virus D，PeVD），感染率均为11.76%；苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）和桃病毒1（Peach virus1，PeV1）的感染率较低，仅在万州酸桃上有检出。

在17份样品中，仅有1份种质（早桃）没有病毒检出；有8份种质仅有1种病毒检出；有8份种质为复合侵染，其中，红油桃6号感染病毒最多，达到5种。

表3供试样品的病毒检测结果
病毒名称CEVd PeVT PLMVd HSVd APV CGRMV PNRSV PeVD ACLSV PeV11
1
1
1
2
1
1
1
1
3
1
1
1
4
1
5
1
1
6
1
1
1
7
1
1
1
1
1
8
1
9
1
10
1
1
1
1
1112
1
13
1
14
1
15
1
16
1
1
1
17
1
注：1表示有感染。

病毒详细注释：柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid，CEVd），桃病毒T（Peach virus T，PeVT），桃潜隐花叶类病毒（Peach latent mosaic viroid，PLMVd），啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid，HSVd），亚洲李属病毒（Asian prunus virus，APV），樱桃绿环斑驳病毒（Cherry green ring mottle virus，CGRMV），李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV），桃病毒D（Peach virus D，PeVD），苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV），桃病毒1（Peach virus1，PeV1）。

2.3验证病毒结果
为验证RNA-seq鉴定病毒的准确性，用qRT-PCR的方法进行上述鉴定结果的验证。

选取了上述样品中的前8份种质，设计针对PLMVd的引物进行扩增，结果显示在供试样品中，除第1、7份种质外，
郝明悦等：桃树病毒病RNA-seq检测分析
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第6份种质同样检出了PLMVd，与转录组分析结果有一定差异，实际应用中，应进行重复检测，确保结果准确性。

3结论与讨论
桃是重要的经济树种，在长期的嫁接繁殖过程中，病毒不断传播积累，可能引起新定植的果园叶片褪绿、斑驳、卷曲，果实畸形、落果和树势下降，病毒病是影响桃产业发展的重要因素之一[6]。

在高通量测序出现之前，对于植物上病毒和类病毒的鉴定常采用qRT-PCR和酶联免疫吸附实验（ELISA）进行[7-8]。

然而，这些方法只能鉴定已知的病毒和类病毒，无法鉴定未知的病毒。

采用二代测序技术（NGS）能克服上述方法的缺点[9]，如Villamor 等[10]采用NGS分析了油桃导致茎痘病症状的可能病毒，Bag[11]和Wu等[12]鉴定了油桃上的黄症病毒。

此外，He等采用NGS首次发现豆科病毒也可能感染桃[4]；Igori等[13]对玉米雷亚朵非纳病毒属新的成员桃病毒D（PeVD）进行了序列分析。

本研究采用转录组测序方法，一次性鉴定出的病毒种类较多，不同种质共10种，单份种质达到5种，在转录组测序成本大幅下降的情况下，效率更高。

本研究中，17份样品共检出了10种病毒，其中PNRSV、CGRMV、HSVd、PLMVd和ACLSV在相关研究报道中比较常见，部分病毒如PeVD[13]和PeV1[14]是近年来报道的，在17份样品中仅检出1~2次，表明其感染情况并不严重。

然而，CEVd在桃上报道较少，但在本研究的17份样品中，有10份材料感染。

CEVd多数商品化柑橘呈潜隐症状，其弱毒株系常引起矮化症状，强毒株系则引起裂皮症状。

1991年，马修理等[15]对湖南、湖北和四川地区245个植株进行调查，发现不同地区柑橘的裂皮类病毒带毒率为87%~100%，可见该病毒在柑橘上已经大面积传播。

在其他果树上也有检出该病毒的报道，García-Are⁃nal等从西班牙、Rezaian等从澳大利亚的葡萄上均检出了该病毒[16-17]。

舒静[18]采用qRT-PCR对来自郑州和湖北的40份葡萄样品进行CEVd的检测，首次报道其中2份样品感染该病毒。

吴斌等[19]通过对山东境内149份疑似感染病毒的葡萄进行5种类病毒检测，未检测出CEVd，表明被检测样品仅受到GYSVd1、GYSVd2、AGVd和HSVd的侵染。

本研究结果显示，CEVd在桃树上的感染率较高，虽然在田间并没有观察到明显的裂皮症状，栽培者需高度重视。

病毒感染会影响树体生长和产量[20]，有研究者还分析了病毒感染对寄生基因表达的影响。

Rubio等[21]以健康叶片为对照，对感染PPV病毒的桃GF305的叶片进行RNA-Seq研究。

结果发现，在有症状的样本中，1.04%的测序序列与PPV具有较高的同源性，而该比例在无症状的叶片中仅为0.00002%。

对PPV 病毒相关的差异表达基因进行功能注释，发现对生物胁迫的响应、脂质和碳水化合物代谢以及催化活性的负调控显著富集。

在侵染早期鉴定到的差异基因较多，其功能与病原的诱导和抗性形成有关，如茉莉酸、几丁质酶、细胞分裂素、葡糖基转移酶和Lys-M蛋白。

一旦病毒积累到一定程度，编码Dicer蛋白的基因高表达，可能通过诱导基因沉默来参与植物抵抗病毒的感染。

理解该过程，对于揭示桃与PPV互作的分子机制，研发相应的调控措施具有重要意义。

生物学防治是目前病毒病管理的主要手段，如发现病树应立即铲除销毁，防止传染，也不能在病园内采集接穗进行扩繁。

但许多果树病毒是潜隐性，且和生理性病害有相似的症状，因此果农通常忽略和错失防治时机。

从技术手段上来说，通过热处理或茎尖培养脱除病毒，是防止病毒病发生，实现早果、丰产和优质的重要途径，但目前桃的脱毒技术成熟度有待提高，报道较少[22]，在生产中鲜见应用。

可以实行的方法是切断传播媒介，例如，使用工具注意消毒，增强树势提高树体自身抗病毒能力，抑制果园内病毒的蔓延速度。

此外，选育抗性种质，是病毒病防治较为有效的手段[23]，如Polak等[24]选择桃的种间杂交材料如Barier、Fire、Cadaman、GF-677和李属的其他杂交后代如MRS、NBS540-73和Pumiselect，然后嫁接到人工接种PPV的砧木上，经过6年的评价，发现桃和扁桃的杂种GF-677对PPV高抗，桃和山桃的杂种Cadaman以及桃和扁桃的杂种Fire对PPV抗性稍次，是未来进行抗病育种的优异亲本材料。

在本研究中，虽然早桃没有病毒检出，但其是否是抗性种质，尚需要进行人工接种鉴定进行确认。

随着基因组学的发展，分子标记辅助选择可以有
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效地提高抗病毒优系的选择效率，针对抗病毒性状进行标记开发已有初步研究。

如Cirilli等[25]首先完成了
85份意大利桃种质的抗PPV评价，然后利用1个自主开发的桃9K SNP芯片进行基因分型，通过全基因组关联分析（GWAS），将抗性位点定位在桃第2染色体9Mb（标记为SNP_IGA_214703）和第3染色体的26Mb（标记为SNP_IGA_366639）处，通过对比抗病种质Kamarat和感病种质在定位区间的遗传变异，初步筛选出RTM2-like为抗病候选基因，其第2个外显子上63bp的缺失与抗性连锁，该位点可以开发为有效的标记在抗PPV种质育种中进行后代筛选。

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（责编：李媛）
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