第七章发酵工程制药_生物技术制药

罐体表面各种装置：
➢ 中大型发酵罐装有供维修、清洗的入孔 ➢ 罐顶装有窥镜和孔灯，在其内面装有压缩空气
或蒸汽吹管 ➢ 罐顶接管：进料管、补料管、排气管、接种管、
压力表接管 ➢ 罐身接管：冷却水进出管、空气进管、温度计
管和测控仪器接口
（二）发酵辅助设备
➢ 无菌空气系统：过滤除 菌（使用活性炭，石棉 滤板，多孔合成树脂等）
直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。 往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一 步的人工改造才能真正用于工业生产
菌种选育
突变、体内重组 体外重组（基因工程）
（3）诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的 筛选，称为诱变育种 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂
物理：紫外线，快中子
发酵车间的空气过滤器
二、培养基和灭菌
➢ （一）培养基 ✓ C源： ✓ N源： ✓ 无机盐： ✓ 前体，促进剂，抑制剂
2.培养基的类型
➢ 孢子培养基：一般用固体培养基，N源不能丰富 如：小米或麸皮培养基
诱变剂 { 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍, 5-Br-U
➢ 物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线，快中子； 目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许 多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验 室、中小型工厂都适用，也很安全。
➢ 化学诱变剂：碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂 等。使用最多、最有效的是烷化剂。大多数情况 下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效
➢ 药用酶 ➢ 酶抑制剂
四、发酵工程制药特点及发展趋势
➢ （1）菌种是根本 ➢ （2）理论产量存在“生物学变量” ➢ （3）常温常压下反应，安全，条件简单 ➢ （4）纯种培养，防污染 ➢ （5）可制备复杂高分子化合物 ➢ （6）分子水平，定向发酵，组合生物合成等 ➢ （7）发酵工业成本低
发酵工程基本流程
发酵的基本过程: 菌种
预处理
提取精制
种子制备
发酵
典型发酵过程
第二节、发酵工程中的微生物
一、常见的药用微生物 ➢ 发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，
酵母菌和霉菌
细菌
放线菌
（一）细菌
➢ 主要生产氨基酸，核苷酸，维生素等
（二）放线菌
➢ 产抗生素最多的一类微生物 ➢ 另外生产B12,酶，甾体转化
(1)传统生物技术
➢ 发酵食品 ➢ 有机酸 ➢ 氨基酸 ➢ 核酸类物质 ➢ 酶制剂 ➢ 医药工业（抗生素…） ➢ 饲料工业（单细胞蛋白 ➢ 环境工程（废物处理） ➢ 其它 （冶金工业…）
抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、 有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、 生物农药、生物肥料等
(2)现代生物技术 基因工程菌发酵
➢ 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的 代谢，目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素；四 环素；红霉素等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
链霉菌
植物或动物来源
（三）真菌
➢ 抗生素 ➢ 维生素 ➢ 酶制剂 ➢ 有机酸等 ➢ 药用真菌（大型真菌）
➢ 1.藻状菌纲：根霉；犁头霉 ➢ 2.子囊菌纲：酵母 ➢ 3.担子菌纲：牛肝菌，灵芝 ➢ 4.半知菌纲：曲霉；青霉；头孢酶
➢ 高空取气管是远离地面几十米 的管子。
➢ 地面附近空气中所含的微生物 和灰尘等均比高空空气中含的 多，每升高10米，空气中杂菌 可降低一个数量级
➢ 因此从高空取气要比从低空取 气有利得多。
油水分离器
➢ 其内部同时采用直接拦截， 惯性碰撞，布朗扩散及凝聚 等机理，能有效地去除空气 中的水、油雾、尘埃，内部 不锈钢丝网可清洗，使用寿 命长。
2、微生物的酶
➢ 目前的酶多数来源于微生物发酵 ➢ 医用酶制剂的生产 ➢ 医药工业用酶 ➢ 酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高
产量。 ➢ 生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑
制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制 以及发酵条件等方面需给予注意。
3、微生物代谢产物发酵
➢ 包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代 谢产物。
➢ 对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必 需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。
➢ 各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或 停止生长时期即稳定期所 产生的，来自于中间代谢 产物和初级代谢产物。
1, 3-丙二醇两步发酵法
糖
酵母
wk.baidu.com甘油
伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等
1,3-丙二醇
4、微生物的生物转化
➢ 定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定 部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似 但具有更多经济价值的化合物。
➢ 最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某 一特定部位进行化学反应而形成的。
三、微生物发酵生产药物的分类
（一）抗生素类 ➢ 9000种 ➢ 微生物发酵占70％。有价值的抗生素，几乎全部
由微生物生产 ➢ 抗细菌，病毒，真菌，肿瘤，原虫，寄生虫等
（二）氨基酸类
➢ 单个氨基酸制剂： ➢ 复方氨基酸制剂： ➢ 微生物发酵法： ➢ 酶转化法
菌种选育
自然界选种、诱变育种、 基因工程、细胞工程
分离纯化
菌体：过滤、沉淀；代谢产物： 蒸馏、萃取、离子交换
培养基配制
根据培养基的配制原则制备， 实践中需多次试验配方
灭菌
杀灭杂菌（胞体、孢子 及芽孢）
发酵过程（中心阶段）
检测进程，满足营养需要； 严格控制温度、pH、溶氧、 转速等
扩大培养和接种
发酵的基本过程
该菌生长
三、菌种保藏
➢ 在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期 待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏， 对于一成功的工业发酵过程极为重要。 ✓ 斜面低温法：短期保存 ✓ 石蜡油封存法：中期保存 ✓ 沙土管：产孢子和芽孢的 ✓ 麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用 ✓ 甘油悬液法：基因工程菌
平板分离 挑选单菌落 (注意形态的观察) 发酵试验
（2)自发突变与定向育种
➢ 一定情况下，长期处理微生物并移种，累积自发 突变体
➢ 结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间 物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代 替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以 其作为自身的营养物质。
➢ 筛选抗性株，可成为高产株 ➢ 抗性突变株的筛选
✓ 冻干保藏 ：最广泛使用的方法。大部分菌种可以 在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株 无需进行冷冻保藏，便于运输
✓ 液氮法：最为有效，保藏15年以上， ✓ 宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物
第三节、发酵设备及消毒灭菌
➢ 一、发酵设备
发酵罐是发酵工程中最重要的设备之一
一个优良的培养装置应 具有：
罐体：
➢ 培养微生物的巨大容器，密闭式的，在发酵过 程中要保持一定的罐压，通常灭菌的压力约为 2.5×105 Pa
➢ 形状，圆柱形，两端椭圆形, 受力均匀，减少 死角，物料容易排除，
➢ 高度与直径比1.7-4：1，有力空气利用率
➢ 搅拌器 ➢ 档板
克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动 改变为轴向流动，促使液体激烈翻动，增加溶氧 速率 ➢ 消泡器 ✓ 锯齿式、梳状式及孔板式 ✓ 装于搅拌轴上，齿面略高于液面 ✓ 直径罐径的0.8~0.9
➢ 严密的结构 ➢ 良好的液体混合性能 ➢ 高的传质和传热速率 ➢ 灵敏的检测和控制仪
表
1、搅拌釜式反应器：目前使用 最广泛的发酵反应器
机械搅拌发酵罐 ➢ 1）适宜的径高比，罐身较长，氧利用率较高 ➢ 2）能耐受一定的压力 ➢ 3）搅拌通风装置 ➢ 4）足够的冷却面积 ➢ 5）罐内要减少死角 ➢ 6）搅拌器的轴封要严密，以减少泄露
3)克隆并选择正突变体(D)， 并将正突变体的重组基因 片段作新一轮的体外重组。
DNA Shuffling与常规定向进化的比较
项目
进化速度
进化对象
进化 周期 影响对象 突变效率
常规定向 进化
缓慢进化
整个基因组
多年 完整基因组
低
DNA Shuffling
快速进化
特定基因/ 操纵子/病毒
几天
部分基因组
第二章 发酵工程制药
第一节 概述
➢ 一、发酵工程 微生物工程:自催化 过程 完整的工业体系
(一)发酵的定义
1、传统发酵
➢ 最初发酵是用来描述酵母菌 作用于果汁或麦芽汁产生气 泡的现象，或者是指酒的生 产过程。
2、生化和生理学意义的发酵
➢ 指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质 产生能量的一种方式，或者更严格地说，发 酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能 反应。
黄色短杆菌合成赖氨酸的途径
（三）核苷酸类
➢ 肌苷酸，肌苷，AMP，ATP，辅酶等
（四）维生素类
➢ 维生素C的原料药2-酮基-古龙酸，维生素A的前 体B-类胡萝卜素，维生素D2的前体麦角甾醇，维 生素B2，B12等
（四）甾体类激素
➢ 甾体类激素的生产过程中，一些特异反应需借助 微生物的反应。
（五）治疗酶及酶抑制剂
二、发酵类型
1、微生物菌体发酵
➢ 定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为 目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、 担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾 病用的疫苗等。药用微生物制剂等。
➢ 特点：细胞的生长与产物积累成平行关系， 生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶 段，生长稳定期产量最高。
➢ 如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒 精并放出CO2。
3、工业上的发酵
泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程, 包括：
1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。 2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、
氨基酸、酶制剂等。
产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。
(二)发酵工业
定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机 或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌 株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负 突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利， 这种突变成为正突变。
1采样
2.分离菌株
自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备
礼来公司花了 10年的时间从 40万株微生物 中，发现了三 种有潜力的新 抗生素。
基因突变： 自然选育、诱变育种
基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工 程
基因的直接进化： 点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等
错位PCR
基本步骤
(1)用DNase I消化功能 相同的一组基因片段(A)， 从而产生随机小片段(B)。
(2)经提纯后，用无引物(经变 性后可互为引物)的类似PCR 反应重新装配这些小片段成完 整长度的重组基因片段(C)， 在装记过程中被证明有低水平 点突变产生。
高
筛选
➢ 从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢 的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛 选而产生的这些特性，称为遗传标记。
➢ 1.自身耐药突变株 ➢ 2.结构类似物或前体类似物的耐受突变株 ➢ 3.营养缺陷及其回复突变株
固体培养基中渗入溶解性
饱浸含某种指示
差、可被特定菌利用的营
剂的固体培养基
➢ 灭菌系统 ➢ 发酵车间的管道阀门等
➢ 发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂 质，无水，无油，正压等几项指标；
➢ 发酵对无菌空气的无菌程度要求是：只要在发酵 过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。
➢ 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许 有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为 N=10-3
养成分，造成不透明的培
的滤纸片变色圈
养基背景。菌落利用此物
质形成透明圈。
待筛选的菌株能
指示剂直接掺入或喷洒固体 培养基，菌落周围形成变色 圈。如淀粉的平皿上喷上稀 碘液
分泌产生某些能 利用一些有特别营养要 抑制工具菌生长 求的微生物作为工具菌， 的物质 如待筛选菌具有该营养 物的前体转化成营养物
能力，工具菌就能围绕
二、生产菌种的选育
工业化菌种的要求 ➢ 1.遗传性能要相对稳定 ➢ 2.生长速度快，不易感染它种微生物或噬菌体 ➢ 3.目标产物产量接近理论转化值 ➢ 4.目标产物分泌到胞外 ➢ 5.尽可能减少类似物产量 ➢ 6.能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高
效地合成产物
（1）自然选育
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9
诱变育种步骤
•出发菌株的选择 •处理菌悬液的制备 •诱变处理 •中间培养 •分离和筛选
筛选的方法
随机筛选 形态 理性化筛选
（4）杂交育种
➢ 通过有性生殖进行
(5)原生质体融合
两个细胞融合
➢ 1.原生质体融合的一般程序
去细胞壁
融合
筛选
➢ 2.酶
溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶
（6）基因重组进化育种