高效液相色谱法测定丹参胶囊脂溶性和水溶性成分含量＊

高效液相色谱法测定丹参胶囊脂溶性和水溶性成分含量＊
张珺;程月发;张爱兵
【摘要】目的：采用高效液相色谱法分别建立同时测定丹参胶囊中脂溶性成分二
氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I及丹参酮IIA和水溶性成分丹参素、原儿茶醛、
迷迭香酸、丹酚酸B及丹酚酸A的含量的方法。

方法：脂溶性成分：采用Welch ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，流速1 mL·min-1，检测波长为270 nm。

水溶性成分：采用Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱，以甲醇-乙腈-0.02%磷酸溶
液为流动相进行梯度洗脱，流速1 mL·min-1，检测波长为286 nm。

结果：丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参
酮I和丹参酮IIA分别在0.472-9.44μg（r=0.9998）、0.352-7.04μg
（r=0.9999）、0.244-4.88μg（r=1.0000）、2.268-45.36μg（r=0.9999）、0.168-3.36μg（r=0.9999）、0.088-1.76μg（r=0.9999）、0.18-3.6μg
（r=0.9999）、0.208-4.16μg（r=0.9999）和0.17-3.4μg（r=0.9999）呈良好的线性关系；加样回收率在97.48%-98.59%之间。

结论：该方法稳定，重复性好，可用于丹参胶囊含量的测定。

%This study was aimed to establish a HPLC method for the content determination of liposoluble components, such as dihydrotanshione I, croptotanshinone, tanshinone I and tanshinone IIA, as well as the content determination of water-soluble components, such as danshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinc acid, salvianolic acid B,
and salvianolic acid A in Danshen capsule simultaneously. For liposoluble components, the determination was performed on a Welch ultimate XB-
C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) by gradient elution using
acetonitrile-water as the mobile phase. The flow rate was 1 mL·min-1. And the detection wavelength was set at 270 nm. For water-soluble components, the determination was performed on a Thermo Syncronis
C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) by gradient elution using methanol-acetonitrile-0.02%phosphoric acid as the mobile phase. The flow rate was 1 mL·min-1. And the detection wavelength was set at 286 nm. The results showed that there were good linear relationships between components of peak areas and the ranges were 0.472-9.44 μg (r = 0.999 8) for danshensu,
0.352-7.04 μg (r = 0.999 9) for protocatechuic ald ehyde, 0.244-4.88 μg (r =
1.000 0) for rosmarinc acid,
2.268-45.36 μg (r = 0.999 9) for salvianolic acid B, 0.168-
3.36 μg (r = 0.999 9) for salvianolic acid A, 0.088-1.76 g(r=0.999 9) for dihydrotanshione I, 0.18-3.6μg (r=0.999 9) for croptotanshinone, 0.208-
4.16μg (r=0.999 9) for tanshinone I, and 0.17-3.4μg (r=0.999 9) for tanshinone IIA. Average recoveries of the method were between
97.48%and 98.59%. It was concluded that the analysis was stable and reproducible, which can be used as a method for the analysis of Danshen capsule.
【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》
【年(卷),期】2014(000)012
【总页数】6页(P2740-2745)
【关键词】丹参胶囊;脂溶性成分;水溶性成分;高效液相;含量测定
【作者】张珺;程月发;张爱兵
【作者单位】河北联合大学冀唐学院唐山 063300;河北联合大学冀唐学院唐山063300;河北省唐山市药品检验所唐山 063000
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1
丹参胶囊作为临床常用中成药，具有活血化瘀的功效。

其药效成分主要可分为2
大类：脂溶性的二萜醌类成分和水溶性的酚酸类成分。

其中脂溶性的成分主要有二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I及丹参酮IIA 等，水溶性的成分主要有丹参素、
原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 和丹酚酸A 等。

目前大多采用高效液相色谱法（High Performance Liquld Chromatography，HPLC）分别测定丹参酮IIA 和丹酚酸B 的含量评价丹参胶囊的质量[1]。

也有一些关于测定其多种有效成分含量
的研究[2-6]，但少见有文献报道同时测定丹参胶囊中多种脂溶性和水溶性成分的
含量。

本文建立了HPLC 法分别同时测定丹参胶囊中多种成分的方法，并用该法
测定了两个厂家22 个批次丹冬胶囊中多种成分的含量，以期为丹参胶囊质量标准的完善提供参考。

1 仪器与试剂
Agrlent 1100 型系列高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），包括G1311A 四元梯度泵、G1313A 自动进样器、G1316A 柱温箱和G1315B 检测器；Chem StationRev.A 10.02 色谱工作站；BP211D 电子天平（德国Sartorius 公司）；SB2200 超声波清洗仪（上海Branson 公司，频率为33 kHz，消耗功率为80 W）。

西双版纳雨林制药有限责任公司（以下简称雨林）丹参胶囊（批号：100526、100701、100910、120526、120527、120721、120722、120820、120821、
121103、121104 和121105）和海南赛立克药业有限公司（以下简称赛立克）
的丹参胶囊（批号：090802、1 0 0 1 0 1、1 0 0 9 0 1、1 1 1 2 0 4、1 2 0 3 0 5、1 2 0 9 0 4、120905、121201、130101 和130304）均为市售；原儿茶醛（批号：813-9201）和丹参酮ⅡA（批号：110766-200416）对照品均购自中国食品药品检定研究院；丹参素（批号：22681-72-7）、迷迭香酸（批号：20283-92-5）、丹酚酸B（批号：115939-25-8），丹酚酸A（批号：96574-01-5）、二氢丹参酮I（批号：87205-99-0）、隐丹参酮（批号：35825-57-1）和丹参酮I（批号：568-73-0）对照品均购自贵州迪大生物有限公司，纯度>98%；甲醛（色谱纯，批号：201309010，天津科密欧化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，批号：201305009，天津科密欧化学试剂有限公司）；甲醇和乙腈均为色谱纯磷
酸（分析纯，批号：201311002，天津科密欧化学试剂有限公司）；水为去离子水。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.1.1 丹参胶囊脂溶性成分的色谱条件
色谱柱：美国Welch ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脱（见表1）；柱温：25℃；流速：1 mL·min-1；
检测波长：270 nm；进样量：10 μL。

色谱图见图1。

2.1.2 丹参胶囊水溶性成分的色谱条件
色谱柱：Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲
醇（A）- 乙腈（B）-0.02%磷酸水溶液（C），梯度洗脱（见表2）；柱温：30℃；流速：1 mL·min-1；检测波长：286 nm，进样量：10 μL。

色谱图见图2。

2.2 混合对照品、样品及阴性对照液的制备
2.2.1 丹参胶囊脂溶性成分混合对照品的制备
分别精密称取二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I 和丹参酮ⅡA 0.44、0.90、1.04 和0.85 mg 置于10 mL 棕色容量瓶中，加纯甲醇溶液溶解并定容，配成浓度分别为44、90、104 和85 μg·mL-1 的混合对照品溶液。

表1 梯度洗脱中流动相的比例（脂溶性成分）t/minA/%B/************ 55 65 35 65 45 45
表2 梯度洗脱中流动相的比例（水溶性成分）t/min A/% B/% C/%0 10 0 90 15 30 0 70 25 10 15 75 60 0 30 70 80 0 80 20
图1 丹参胶囊脂溶性成分样品及对照品色谱图注：A.丹参胶囊脂溶性成分（雨林），B.丹参胶囊脂溶性成分（赛立克），C.混合对照品，D.阴性对照；1.二氢丹参酮Ⅰ，2.隐丹参酮，3.丹参酮Ⅰ，4.丹参酮ⅡA。

图2 丹参胶囊水溶性成分样品及对照品色谱图注：A.丹参胶囊水溶性成分（雨林），B.丹参胶囊水溶性成分（赛立克），C.混合对照品，D.阴性对照；1.丹参素，2.原儿茶醛，3.迷迭香酸，4.丹酚酸B，5.丹酚酸A。

2.2.2 丹参胶囊水溶性成分混合对照品的制备
分别精密称取丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 和丹酚酸A 1.18、0.88、0.61、5.67 和0.42 mg 置于5 mL 棕色容量瓶中，加去离子水溶解并定容，配成浓度分别为236、176、122、1 134 和84 μg·mL-1 的混合对照品溶液。

2.2.3 丹参胶囊脂溶性成分样品溶液的制备
取丹参胶囊20 粒，精密称定，研磨成粉末，精密称取0.30 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm 滤膜，即得。

2.2.4 丹参胶囊水溶性成分样品溶液的制备
分别取雨林和赛立克丹参胶囊20 粒，精密称定，研磨成粉末，精密称取0.30 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入去离子水20 mL，称定重量，超声提取30 min，放
冷，再称定重量，用去离子水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm 滤膜，即得。

2.2.5 阴性对照液的制备
分别按丹参胶囊的生产工艺制备缺丹参的阴性制剂，并分别按照样品溶液的制备方法（“2.2.3”和“2.2.4”）制备2 份阴性对照溶液，见图1D 和2D。

2.3 线性关系考察
2.3.1 丹参胶囊脂溶性成分样品线性关系考察
吸取混合对照品溶液（按“2.2.1”方法制得）过0.45 μm 滤膜后，在本实验色谱条件下分别进样2、5、10、15、20 和40 μL，记录色谱峰面积。

以浓度X（μg）为横坐标，峰面积Y 为纵坐标绘制标准曲线，对其进行线性回归，得回归方程
（表3）。

2.3.2 丹参胶囊水溶性成分样品线性关系考察
吸取混合对照品溶液（按“2.2.2”方法制得）过0.45 μm 滤膜后，在本实验色谱条件下分别进样2、5、10、20、30 和40 μL，记录色谱峰面积。

以浓度X（μg）为横坐标，峰面积Y 为纵坐标绘制标准曲线，对其进行线性回归，得回归方程
（表3）。

2.4 方法学考察
2.4.1 丹参胶囊脂溶性成分方法学考察
精密度试验：精密吸取“2.2.1”中混合对照溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，连续重复进样6 次，记录色谱图。

分别测定各峰面积，结果二氢丹参酮工、隐丹
参酮、丹参酮I 和丹参酮IIA峰面积的RSD 分别为0.93%、1.04%、0.87%、1.32%。

重复性试验：取赛立克丹参胶囊（批号：130101），按样品溶液的制备方法分别
平行制备6份样品溶液，按上述色谱条件测二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I 和
丹参酮ⅡA 的平均含量。

结果4 种成分的含量分别为0.432 5、1.792、2.679 和2.408 mg·g-1，RSD 分别为2.78%、1.80%、2.07%和1.75%，表明本方法重复性良好。

稳定性试验：取赛立克丹参胶囊（批号：130101），按上述色谱条件，分别于0、2、4、6 和8 h 进行测定、记录色谱图，分别计算二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I 和丹参酮ⅡA 峰面积的RSD。

结果4 种成分峰面积RSD 分别为1.73%、
0.98%、1.62%和2.01%。

说明样品溶液在避光密闭容器中保存，在8 h 内含量变化不大，比较稳定。

2.4.2 丹参胶囊水溶性成分方法学考察
精密度试验：精密吸取“2.2.2”中混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，连续重复进样6 次，记录色谱图。

分别测定各峰面积，结果丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 和丹酚酸A 峰面积的RSD 分别为1.11%、1.35%、
0.72%、1.32%、0.98%。

重复性试验：取赛立克丹参胶囊（批号：130101），按样品溶液的制备方法分别
平行制备6 份样品溶液，按实验色谱条件测丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚
酸B 和丹酚酸A 的平均含量。

结果5 种成分的含量分别为2.376、0.005 680、1.431、64.09 和0.205 3 mg g-1，RSD分别为1.92%、1.35%、1.77%、0.99%和1.65%，表明本方法重复性良好。

稳定性试验：取赛立克丹参胶囊（批号：130101），按本实验色谱条件，分别于0、2、4、6 和8 h 进行测定、记录色谱图，分别计算丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 和丹酚酸A 峰面积的RSD。

结果5 种成分峰面积RSD 分别为
1.21%、1.05%、1.78%、1.38%和1.53%。

说明样品溶液在避光密闭容器中保存，在8 h 内含量变化不大，比较稳定。

2.5 加样回收率试验
2.5.1 丹参胶囊脂溶性成分加样回收率试验
取赛立克丹参胶囊（批号：130101，已知丹参胶囊片中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I 和丹参酮ⅡA 的含量分别为0.432 5、1.792、2.679 和2.408 mg·g-1），分别加入一定量的对照品溶液后，测定含量，计算回收率（表4）。

2.5.2 丹参胶囊水溶性成分加样回收率试验
取赛立克丹参胶囊（批号：130101，已知丹参胶囊片中丹参素、原儿茶醛、迷迭
香酸、丹酚酸B 和丹酚酸A 的含量分别为2.376、0.005 680、1.431、64.09和0.205 3 mg·g-1），分别加入一定量的对照品溶液后，测定含量，计算回收率（表4）。

2.6 样品含量测定
2.6.1 丹参胶囊脂溶性成分样品含量测定
取22 个批号丹参胶囊，分别按“2.2.3”项下方
表3 线性关系考察结果对照品回归方程线性范围/μg 相关系数二氢丹参酮I Y=-41.53+2 531.43X 0.088-1.76 0.999 9隐丹参酮 Y=16.98+4 589.44X 0.18-3.6 0.999 9丹参酮I Y=-40.79+2 531.43X 0.208-4.16 0.999 9丹参酮ⅡA
Y=12.44+5 183.56X 0.17-3.4 0.999 9丹参素 Y=42.75+566.38X 0.472-9.44 0.999 8原儿茶醛 Y=80.39+3 214.58X 0.352-7.04 0.999 9迷迭香酸 Y=-
2.888+1 32
3.52X 0.244-
4.88 1.000 0丹酚酸B Y=-0.924 5+578.42X 2.268-4
5.36 0.999 9丹酚酸A Y=13.07+868.96X 0.168-3.36 0.999 9
表4 加样回收率试验结果（n=9）对照品平均回收率/% 相对标准偏差RSD/%二氢丹参酮I 97.79 1.558隐丹参酮 98.59 1.128丹参酮I 97.48 1.665丹参酮ⅡA 98.21 1.983丹参素 98.05 1.095原儿茶醛 97.95 1.377迷迭香酸 97.93 1.660丹酚酸B 98.32 1.983丹酚酸A 97.78 1.447
表5 雨林样品脂溶性成分含量测定结果（mg·g-1，n=3）雨林二氢丹参酮I 隐丹
参酮丹参酮I 丹参酮IIA 100526 0.428 1 1.726 1.818 1.023 100721 0.376 4
1.494 1.799 0.707 100910 0.452 2 1.743 1.784 0.810 120526 0.433 3 1.228
2.280 1.845 120527 0.413 8 1.213 2.252 1.873 120721 0.385 5 1.169 2.186 1.817 120722 0.379 1 1.150 2.149 1.803 120820 0.383 9 1.189 2.229 1.802 120821 0.383 9 1.175 2.218 1.779 121103 0.438 1 1.292 2.309 1.833 121104 0.384 3 1.178 2.095 1.661 121105 0.344 2 0.968 1.900 1.567平均含量 0.400 2 1.294 2.085 1.543
表6 赛立克样品脂溶性成分含量测定结果（mg·g-1，n=3）赛立克二氢丹参酮I 隐丹参酮丹参酮I 丹参酮IIA 090802 0.449 2 1.497 2.520 2.753 100101 0.641 1 1.897 2.856 1.794 100901 0.542 0 1.978 3.010 1.650 111204 0.697 9 2.265 3.500 2.171 120305 0.728 2 2.383 3.654 2.308 120904 0.357 4 1.467 2.324 2.148 120905 0.363 0 1.533 2.534 2.284 121201 0.430 8 1.797 2.694 2.434 130101 0.432 4 1.792 2.679 2.408 130104 0.415 8 1.747 2.602 2.349平均含量 0.505 8 1.835 2.837 2.229
表7 雨林样品水溶性成分含量测定结果（mg·g-1，n=3）雨林丹参素原儿茶醛迷迭香酸丹酚酸B 丹酚酸A 100526 1.930 0.007 451 1.158 44.40 0 100721
2.841 0.022 07 1.143 39.27 0 100910 5.133 0.028 17 1.135 40.26 0 120526
3.133 0.018 01 1.125 53.56 0.635 3 120527 3.033 0.011 02 0.942 1 45.98 0.282 4 120721 3.176 0.009 457 0.867 4 4
4.84 0.275 5 120722 2.928 0 0.957 7 48.12 0.320 6 120820 3.111 0.016 30 1.015 49.33 0.174 8 120821 2.962 0 0.987 5 46.93 0.282 5 121103 3.151 0.012 64 0.924 1 43.11 0.238 6 121104 2.977 0.012 19 1.026 48.94 0.395 9 121105 1.334 0 0.745 3 42.44 0.104 3平均含量 2.976 0.011 44 1.002 4
5.59 0.225 8
表8 赛立克样品水溶性成分含量测定结果（mg·g-1，n=3）赛立克丹参素原儿
茶醛迷迭香酸丹酚酸B 丹酚酸A 090802 3.855 0.023 37 1.764 83.05 0.871 3 100101 7.578 0.093 28 1.958 77.81 3.161 100901 6.959 0.070 15 1.804
72.11 3.152 111204 2.281 0 1.430 64.08 1.573 120305 3.122 0.006 350
1.646 70.29 1.826 120904 6.303 0.133 3
2.421 78.87 2.516 120905 6.445
0.129 8 2.334 77.28 1.744 121201 2.400 0.004 181 1.598 69.60 0.102 1 130101 2.376 0.005 680 1.430 64.09 0 130104 3.166 0.006 320 1.647 70.29 0.205 3平均含量 4.448 0.047 24 1.803 72.75 1.515
法制备供试品溶液各3 份，按相应的色谱条件对样品溶液中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I 和丹参酮ⅡA 的含量进行测定，用外标法计算（表5、6）。

2.6.2 丹参胶囊水溶性成分样品含量测定
取22 个批号丹参胶囊，分别按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液各3份，按相
应的色谱条件对样品溶液中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B 和丹酚酸A
的含量进行测定，用外标法计算（表7、8）。

3 讨论
3.1 色谱条件的选择
3.1.1 流动相的选择
在分离丹参脂溶性成分时，流动相的选择研究中曾考察了甲醇-水系统和乙腈- 水
系统作为流动相进行梯度洗脱，结果发现，采用适当比例的乙腈-水系统梯度洗脱
时具有较好的分离效果。

在分离丹参水溶性成分时，流动相的选择研究中分别采用了乙腈-磷酸水溶液、甲
醇-磷酸水溶液及甲醇-乙腈-磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，研究结果表明，采用甲醇-乙腈-0.02%磷酸水溶液系统作为流动相对样品进行分离能达到良好效果。

与其它研究中所建立的分析方法相比[7]，该方法能使样品各个色谱峰达到较好的
分离，并缩短了色谱分离时间。

3.1.2 检测波长的选择
在脂溶性成分选定的色谱条件下，采用二极管阵列检测器考察了270、275和
280 nm 波长下的图谱，结果在270 nm 下出峰多，因此选定270 nm 为测定波长。

在水溶性成分选定的色谱条件下，采用二极管阵列检测器考察了270、280和
286 nm 波长下的样品色谱分离情况。

从色谱中观察，在286 nm 下色谱峰较多，因此选定286 nm 作为检测波长。

3.2 样品含量分析
本研究分别建立了丹参胶囊中脂溶性成分和水溶性成分含量测定方法，所建立的方法不但具有良好的稳定性、精密度和重现性，而且专属性强。

在已有研究基础上[8]，增加了所选择测定的成分，并且均为丹参胶囊的主要药效成分，更能用于全
面地评价丹参胶囊的质量，具有实际应用价值。

在研究中发现，对于同一厂家的不同批次的样品，部分测定成分含量差异较大，雨林药厂生产的丹参胶囊丹参酮IIA 相差2.6 倍，丹参素和原儿茶醛均相差3 倍以上，而丹酚酸A 相差6 倍之多。

相比之下，该厂样品中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、迷迭香酸和丹酚酸B 含量相对稳定。

赛立克药厂生产的丹参胶囊中迷迭香酸、丹酚酸B、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA 含量均较稳定。

而丹参素、原儿茶醛和丹酚酸A 含量相差较大。

对于不同的厂家，由表5-8 可知，赛立克生产的丹参胶囊中有效成分含量相对于
雨林药厂生产的丹参胶囊较高。

参考文献
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