不同培养基对水稻胚性愈伤组织诱导及分化的影响

不同培养基对水稻胚性愈伤组织诱导及分化的影响
刘书梅;王姗姗;辛晓云;王玲玲;朱正歌
【摘要】以水稻成熟胚为材料诱导愈伤组织,统计在不同基本培养基上的愈伤诱导率以及绿苗分化率,分析不同基本培养基及外源激素的含量和比例时愈伤组织生长及分化的影响.结果表明,试验材料对基本培养基具有选择性,MS培养基对籼稻种胚愈伤的诱导培养效果较好,NB培养基则更适合粳稻种胚愈伤的诱导培养;诱导继代培养基中加入多种氨基酸组合可有效提高出愈率和分化率,特别是粳稻的愈伤组织的诱导和分化需要多种氨基酸的共同作用;不同基因型水稻材料对激素和氨基酸组合的需求不同.%Rice calli of two subspecies were induced from mature seeds, callus induction and regeneration rate were analyzed in this experiment. The result showed that NB medium was most suitable for Nipponbare ( Oryza sativa L. subsp. Japonica) ; MS, NB and LS medium were all appropriate for Longtepu ( Oryza sativa L. subsp. Indica) . Some kinds of amino acids and hormone were necessary for Nippobare calli. It indicated that the rice calli induction and regeneration rate was related to rice variety.
【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】2011(028)004
【总页数】3页(P54-56)
【关键词】水稻;成熟胚;愈伤组织;愈伤诱导率;绿苗分化率
【作者】刘书梅;王姗姗;辛晓云;王玲玲;朱正歌
【作者单位】石家庄科技工程职业学院,石家庄,050800;河北师范大学生命科学院,石家庄,050016;河北师范大学生命科学院,石家庄,050016;河北师范大学生命科学院,石家庄,050016;河北师范大学生命科学院,石家庄,050016;河北师范大学生命科学院,石家庄,050016
【正文语种】中文
【中图分类】Q943.1
植物基因工程及分子生物学技术的发展,为作物遗传育种开辟了一条崭新的途径。

水稻 (Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,培育优质高产抗逆的水稻品种是育种学家的追求,遗传转化技术为实现这一愿望提供了可能性。

水稻遗传转化的基础是获得优良的水稻愈伤组织,愈伤组织状态直接决定了遗传转化的效率。

水稻愈伤组织的诱导,常用的外植体是未成熟胚、原生质体和成熟胚。

由未成熟胚获得的愈伤组织绿苗分化率高,但由于未成熟胚材料来源受时间和空间上的限制,消弱了它的实用性;以原生质体作为水稻遗传转化的受体,转化效率较高,但培养过程比较繁琐,且培养周期长;而以成熟胚诱导胚性愈伤,不受时间和季节限制,且操作简便,但不同的水稻品种的愈伤诱导率有很大差异,因此提高主要栽培品种成熟胚的培养力和植株再生能力是一项关键因素。

在基本培养基方面,朱根发等认为,N6-MS培养基交替继代能使粳稻愈伤组织分化能力提高[1-4]。

植物组织培养中,影响培养力的因素是多方面的,而植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素[5-8]。

杨跃生等进一步证实了培养基、激素等条件对水稻种胚愈伤组织的形成和再生植株有很大影响[9-14]。

本实验选取籼稻“龙特普”及粳稻“日本晴”为试验材料,系统地进行了水稻成熟胚诱导愈伤、继代、分化实验,分析不同基本培养基及培养物中外源激素的含量和比例对培养力高
低的影响,找出其规律性,以期探索不同培养基成分对不同基因型水稻品种的影响。

1 材料与方法
以龙特普(Oryza SativaL.indica)和日本晴 (Oryza SativaL.japonica)为本研究的实验材料。

诱导继代培养基为 NB(N6培养基的大量元素, B5培养基的微量元素和有机物)、MS和 LS基本培养基,辅加2,4-D(2.5mg/L),6-BA(0.5mg/L),30 g/ L蔗糖,10 g/L 琼脂或 3 g/L植物胶。

分化培养基以NB培养基为基本培养基,辅加 300 mg/L水解酪蛋白, 500 mg/L脯氨酸,500 mg/L谷氨酰胺,0.5 mg/L NAA,2 mg/L 6-BA,12 g/L琼脂粉,30 g/L蔗糖(粳稻)或 10 g/L山梨醇和 20 g/L蔗糖(籼稻)。

所有培养基 pH值均调至5.8,高压灭菌处理后备用。

1.1 愈伤组织的培养
1)选取饱满的成熟水稻种子,除去颖壳,选取干净而完整的稻米粒作为水稻成熟胚愈伤组织诱导的起始材料。

70%乙醇浸泡 1min,2.5%次氯酸钠浸泡 25～30min,无菌水冲洗 4～5次。

接种于相应的愈伤诱导培养基上,于26℃～28℃暗培养。

2)两周后,统计出愈率,并将愈伤组织转移至相应的新鲜继代培养基上继续暗培养。

3)愈伤组织在继代培养基上培养到第 4d,接种至相应分化培养基上,24℃～26℃,14 h(L)/10 h(D)培养。

为了统计预分化对两种水稻愈伤组织分化率的影响,我们把转到分化培养基的部分愈伤组织首先进行3d的暗培养,然后再光照培养。

4)水稻愈伤组织在分化培养基上培养 25d,统计其分化率。

1.2 观察与统计方法
出愈率(%)=(产生愈伤组织的种胚数/接种的种胚数)×100%
绿苗分化率(%)=(分化绿苗的愈伤块数/转移的愈伤块数)×100%
2 结果与分析
2.1 胚性愈伤组织的诱导
将籼稻品种龙特普和粳稻品种日本晴的成熟胚接种到诱导培养基上,诱导培养两周后,可观察到从盾片部位长出的愈伤组织呈淡黄色,瘤状,结构致密,并可看到龙特普的愈伤组织较日本晴的愈伤组织结构更致密,颜色更鲜黄(图 1)。

愈伤组织出愈率的统计见表1 (表中接种数、愈伤数和出愈率均为 3次平行试验的平均值)。

可见,对龙特普来说,MS、NB和LS培养基都是适合的成熟胚愈伤组织诱导继代培养基,而对日本晴来说,NB培养基更为适合。

表1 不同水稻品种在不同培养基上出愈率的比较Table 1 Rice callus induction rate in differentmediaNB MS LS 442 211 236 414 203 220 93.6% 96.2% 93.2% 0.001062 0.001551 0.008269 228 236 253 206 191 220 90.2% 80.9% 80.7% 0.008181 0.012366 0.027029
图1 水稻愈伤组织的诱导Fig 1 The induction of rice callus
2.2 愈伤组织的分化
2.2.1 愈伤组织暗培养 3d的绿苗分化率
将诱导出的胚性愈伤组织置于相应的分化培养基上进行分化培养。

其中一部分先进行 3d的暗培养,然后转入光培养;另一部分直接进行光照培养,其它条件相同,经过25 d的分化培养,比较其绿苗分化率(结果见表2,表中数据均为 3次平行试验的平均值)。

表2 不同培养基愈伤组织分化率的比较Table 2 Rice callus regeneration rate in differentmedium under different conditions水稻品种培养基平均分化率(光) 标准差平均分化率(暗+光) 标准差LS 34.1%0.02367937.2%0.011235日本晴MS NB LS 38.5% 37.3% 91.5% 0.013172 0.016211 0.036281 47.1% 55.0% 97.4% 0.028714 0.029681 0.056981龙特普MS NB 96.4% 92.5% 0.057382 0.038264 97.5% 97.2% 0.086254 0.012593
结果表明,水稻品种不同,愈伤组织分化率差异较大,龙特谱的适应性较强,3种基本培
养基都适合。

暗培养 3d对日本晴愈伤组织的分化率有一定的提高,尤其是NB培养基,能使分化率提高18%;但对龙特谱的愈伤组织分化率却基本没有影响。

2.2.2 氨基酸对不同水稻品种愈伤组织分化率的影响
在分化培养基里添加了甘氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺等氨基酸,以比较氨基酸对愈伤组织分化率的影响。

结果表明,龙特谱对氨基酸的依赖较小,而氨基酸的添加能明显增加日本晴愈伤组织的分化率(数据未显示)。

研究还表明,诱导培养基不同,分化培养基相同时,愈伤组织的分化率也有差异,对日本晴来讲,NB> MS>LS,而对龙特普来说,MS>NB>LS。

由此可见, NB更适合日本晴愈伤组织的诱导及分化,而MS更适合龙特谱愈伤组织的诱导及分化。

3 讨论
3.1 培养基种类对水稻成熟胚诱导愈伤及分化率的影响
在植物组织培养中,基本培养基的成分、元素的浓度含量是影响水稻高频再生体系的重要因素之一。

不同基因型的材料在同一基本培养基上或同一基因型的材料在不同的基本培养基上,愈伤组织的诱导率各不相同。

本研究表明,对于粳稻日本晴来讲,N6培养基在愈伤组织诱导和分化方面均优于MS和LS;对龙特谱来讲,MS培养基在愈伤组织诱导和分化方面均优于NB和LS。

3.2 不同水稻亚种对成熟胚诱导及分化的影响
由于基因型不同导致水稻愈伤组织形成和分化能力的差异是一种较为普遍的现象。

粳稻比籼稻具有较高的愈伤组织诱导率和植株再生频率。

Abe和 Futsahara认为基因型不同导致籼稻愈伤组织形成和植株再生的差异可能是籼稻品种间内源激素的浓度和比例不同所致[15]。

不同的基因型对基本培养基及激素配比的要求都有一定的差异。

因此,对于不同的基因型的材料选取适合它的基本培养基及激素配比是很重要的。

在本研究中,龙特普在 3种培养基上的诱导率与分化率都较高,可能与该品种的基因型有关。

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