病毒感染的实验诊断
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液中。 （8）尸检标本：应在死亡后尽早采取，
采集各种器官时要分开使用器械和
容器。
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10
（二）标本的运送和保存
标本采集后注意无菌、冷冻、保湿、 立即送检。
分离培养病毒的标本要尽快送到实 验室处理和接种。如不能及时送检，可 在4℃冷藏数小时，如需较长时间保存则 应 置 -70℃ 。 放 置 在 -20℃ ， 病 毒 容 易 灭 活，冻存液中需加入甘油或二甲亚砜等 作保护，避免反复冻融使病毒灭活。
应部位采取标本，处理标本时要考虑病
毒的生物学特性。常见分离病毒标本的
选择见教材P64表4-2。
（1） 心脏疾病
（2） 中枢神经系统感染
（3） 先天或新生儿感染
（4） 胃肠道疾病
（5） 呼吸道感染
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6
3．常见标本的采集方法
（1） 血液：以无菌手续抽取抗凝血10ml， 抗凝剂可选用100u/ml肝素钠。为了血清 学检查的需要，应抽取另一管5ml血液， 不抗凝送检。
程度上取决于标本的恰当采样和处理，为了保 证标本质量，应注意以下问题：
1．采样时间 尽可能在发病的初期，急性期 或患者入院的当天进行，越早越好，最好在治 疗之前。疾病后期体内产生免疫力，病毒量减 少或消失。
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5
2．标本种类的选择
根据临床感染的症状及流行病学资
料，判断可能感染病毒的种类，选择相
清学实验；后者主要是核酸杂交与PCR 及现代免疫学技术。
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3
病毒分离培养
病原学诊断 形态学检测
病 毒
分子生物学技术——病毒核酸
学
补体结合试验
检
中和试验
验
血清学诊断 血凝抑制试验
间接免疫荧光检测
酶联免疫吸附试验
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4
一、标本采集与运送
（一）标本的采集 要从临床标本中成功地分离出病毒，很大
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34
（1） 中和试验
是将病毒与特异性抗体进行免疫反 应，使病毒失去感染性，在细胞培养和 活的机体内不出现病变的试验。常用细 胞培养进行中和试验。
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35
方 法：
①固定病毒（100TCID50），稀释血清，测 Ab效价。两次效价相差4倍以上有诊断意 义。 TCID50：50%组织细胞感染的病毒 剂量(50%Tissue cell infective dose TCID50)。 ② 固定血清（1：20或1：40），稀 释病毒，求中和指数。
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16
3．传代细胞系
来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程的变异 细胞。细胞增殖特征和染色体均类似于肿瘤细 胞。不宜用于疫苗的制备，常用于病毒的分离 和鉴定。
（4）组织培养的特点
优点：A．来源广；B．不受机体免疫因素 影响，个体差异小，敏感范围广；C．易于观 察病变；D．可用于病毒的分离、鉴定、疫苗 的制备；E．易管理，相对比较经济。
病毒感染的实验诊断
张德纯 教授
临床微生物教研室
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1
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
病毒（Virus）是结构最简单、体积 最小的微生物。病毒感染十分常见，约 70%~80%的传染病由病毒感染所引起。 迄今已证实500多种病毒对人有致病性， 其中不少病毒危害极大，如最近流行的 SARS病毒。因此尽快获得病毒的实验诊 断，对控制病毒的传播、疾病的诊断和 防治具有重要的意义。
缺点：条件要求高，必须要有细胞培养的 条件。
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17
2. 鸡胚接种
鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、 痘类病毒的较为理想的材料。
（1） 常用接种部位和用途
38-39℃ 新鲜受精卵
5-13天
卵黄囊接种 羊水腔接种 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种
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18
气室 羊膜
羊水囊
卵壳
卵白
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尿囊 绒毛尿 囊膜 卵黄囊
抑制试验等
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（3） 病毒在细胞培养中的表现
① 细胞代谢类型改变：细胞代谢产酸可 导致培养液pH指示剂呈黄色，病毒 增殖抑制了细胞代谢，使培养液不变 色或变红。但腺病毒不抑制细胞代谢， 反而促进糖酵解增加产酸。
② 细胞形态学变化 由病毒增殖所引起的细胞变化称为
细胞病变效应(cytopathic effect CPE)。
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2
病毒性疾病实验诊断的一般原则：
特异、敏感、快速和简便。首先根据流
行病学和临床特点，初步判断可能感染
的病毒；然后根据可疑病毒生物学特点、
机体免疫应答和临床过程，以及病人当
前所处的时机，确定实验诊断的方法。
目前病毒感染的检查主要依靠经典的方
法和近来发展起来的分子生物学等方法。
前者主要包括病毒分离培养、鉴定及血
加8~10ml运送液立即送检。
（5） 含漱液 可用无菌生理盐水，让患者含漱几
次取得，与运送液等量混合。
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9
（6） 喉拭子：用生理盐水湿润的拭子采 取咽喉部表面，置运送液中，注意
避免唾液污染。 （7）尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸
入尿道4cm轻轻转动2~3次，以获 得较多的上皮细胞，取出后置运送
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32
③ 耐酸试验
肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在 酸性环境下易被灭活。
④ 乙醚敏感试验
病毒外周如有类脂包膜，则易被乙醚 破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可 作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可 用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。
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33
2 最后鉴定——血清学试验
在初步鉴定的基础上，对已分离出 阳性结果需选择适当的血清学方法对病 毒分离株作最后鉴定。血清学方法鉴定 是将分离到的病毒和已知病毒的参考血 清作中和试验、补体结合试验、血凝抑 制试验等。由于分子病毒学的发展，病 毒的最后鉴定还应包括分子生物学方法 的鉴定，它还能检出不产生细胞病变的 那些病毒。
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① 卵黄囊接种：用于流行性脑炎病毒分 离
② 羊水腔接种：用于流感病毒、副流感 病毒的初次分离
③ 尿囊腔接种：用于流感病毒、腺病毒、 腮腺炎病毒分离
④ 绒毛尿囊膜接种：用于痘病毒、疱疹 病毒分离
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20
（2） 鸡胚接种的特点 优点：A.鸡胚是一个整体，可有多种 接种途径；
B.可收获大量病毒； C.鸡胚本是无菌无病毒的，对
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11
为了抑制细菌生长通常在病毒传送
培养基（VTM）中加入抗生素如青霉素 100U/l 和 链 霉 素 100μg/ml ， 为 了 抑 制 真 菌 的 生 长 加 入 2.5μg/ml 二 性 霉 素 B 或 40μg/ml制霉菌素。
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12
二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒分离和鉴定的一般程序 见书P66图4-1
（二）病毒的分离
病毒是专性细胞寄生，需要在活细胞 或动物体内才能得到分离。选择何种动物 或细胞来分离，应根据临床感染的症状和 流行病学资料，推测可能的病毒种类，选 择相对敏感的动物和细胞来分离标本中的 病毒。
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13
1.组织培养
（1） 概念
将人或动物离体的活组织或分散的活细胞， 在实验室的试管或培养基中，模拟体内的生理 条件使之生存和生长，称之为组织培养。
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29
④ 干扰现象
一种病毒感染细胞后，可以干扰以 后进入的病毒的增殖。利用此现象鉴定 不引起形态学变化的病毒。如某些型别 的鼻病毒能干扰以后进入的副流感Ⅰ型 病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸 附作用。
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30
⑤ 红细胞吸附及吸附抑制试验
红细胞吸附现象的产生是由于病毒 在细胞膜成熟时，将其血凝素插入细胞 膜，使感染细胞吸附红细胞，是病毒增 殖的指标。该现象可被相应的病毒特异 性抗体所抑制，称为红细胞吸附抑制试 验，可用来鉴定病毒。
病毒感染动物的范围、发病的潜伏期有差 异。如柯萨奇B组病毒对新生乳鼠致病，对成 年小鼠不致病；小鼠脑内接种乙脑病毒，潜伏 期一般为4天，少于4天发病则可能为非乙脑病 毒引起。
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（2）对鸡胚的敏感性 不同病毒对鸡胚不同接种途径
敏感性不同。 直接法：如观察绒毛尿囊膜是
否有病灶 间接法：尿囊液、羊水做血凝
接种病毒不产生抗体；
D.来源广，操作简便。 缺点: A.易感病毒较少，应用较局限；
B.反复用鸡胚传代，病毒毒力 可下降。
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3. 动物接种
（1） 常用动物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、 猴等
（2） 接种途径： 呼吸道病毒，如流感病毒，滴鼻接种3周龄新生 小鼠 肠道病毒，如柯萨奇病毒，腹腔接种乳鼠（一 日龄） 乙肝病毒，静脉注射猩猩 嗜神经病毒，如乙脑病毒（用3周龄小鼠）、狂 犬病毒（用家兔），颅内接种
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（3） 接种后观察应每日至少两次，必要时 每隔2~4小时观察一次。根据实验目 的的不同，观察不同的反应情况。
（4） 动物接种特点 优点：A.可以按照不同途径分离鉴定 病毒，可模拟人类感染途径 B.可用于疫苗的筛选、制备 C.可用于制备抗血清 D.操作简便，对环境要求低
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23
缺点：A.可自然带毒或隐性感染，影响
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中和指数>50为阳性，有意义；
中和指数<9为阴性，无意义；
中和指数10~49，为可凝。
中和试验较复杂和费时，多用于V的鉴定和 流行病学调查，对临床诊断价值不大。
（2）血凝与血凝抑制试验
某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类的 红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可 抑制血凝现象的发生，称为血凝抑制试验。可作 为病毒型别鉴定的依据。
（3）补体结合试验
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三、病毒感染的快速诊断
（一）、病毒的形态学检查 1. 光学显微镜 可以观察到大型的病毒如痘病毒类。在光学
显微镜下还可以观察到病毒感染的宿主细胞的胞 质内或细胞核内出现嗜酸性的包涵体（inclusion body）。根据包涵体的特点，可以作出辅助诊断。 包涵体可能是病毒增殖的场所或病毒颗粒的聚合 体，也可能是宿主细胞对病毒作用的反应产物， 一般来说，产生核内包涵体的是在细胞核内装配 的病毒（通常为DNA病毒），产生胞质内包涵体 的是在胞质中装配病毒（通常为RNA病毒）。
离体的新鲜组织或器官，机械处理
胰蛋白
洗涤
吹打
酶消化
加入营养液
单个细胞悬液
1-3次
细胞计数 、调整细胞浓度
分装在培养
生长
瓶内培养 形成单层细胞，称为原代细胞培养
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胰酶消化 转种新的培养瓶
形成单层
细胞，称为次代细胞培养
2． 二倍体细胞株
原代细胞多次连续传代后仍保持二倍体染 色体特性（即含23对染色体），称之为二倍体 细胞。传代细胞寿命一般为40~50代，大多数 为成纤维细胞,如人胚肺细胞。广泛用于病毒分 离和疫苗制备。
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A. 细胞溶解，细胞培养瓶中出现空斑, 如肠道病毒；
B. 细胞融合形成多核巨细胞，如疱疹病
毒； C .细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，如腺
病毒； D .胞浆内或核内出现嗜酸性包涵体，如
狂犬病毒： E .不出现细胞病变现象。
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③ 空斑或蚀斑（plaque）形成试验
空斑是指在单层细胞中被病毒感染引 起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。 一般而言，一个空斑是由一个感染性病 毒颗粒感染所引起。不同的病毒引起的 空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒 的计数、纯化，结合中和试验可进行病 毒的鉴定。
结果的观察 B.存在个体差异 C.敏感病毒较少，或有些病毒感
染后不出现明显症状，不宜观
察 D.不经济，难管理
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（三）病毒的鉴定
1.初步鉴定 根据临床症状、流行病学特点、标本来
源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特 性、理化性质，可初步确定病毒属于何科何属。 （1） 动物感染范围及潜伏期
（2） 脑脊液：以无菌手续抽取脑脊液 1~2ml，置无菌试管内，在冰浴中立
即送检。4℃可存放72h。
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7
（3）宫颈或阴道拭子
采取病灶部位分泌物，将拭子置运 送液中；如无病损部位，则清理宫颈口 粘液，将拭子伸入宫颈约1cm停留5秒以 上取出，置运送液中4℃冰浴立即送检。
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（4） 粪便标本 取2~4g粪便标本在无菌的容器中，
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（4） 理化性质的测定
① 病毒的大小和形态：可用电镜观察 病毒的大小和形态。
② 核酸类型鉴别及序列测定：利用 5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）抑制DNA复制 的特性，在细胞培养液中加入该物质， 可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细 胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用， 以此判断病毒核酸类型。也可对病毒特 异序列或全序列的碱基排列测定或DNA 杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。
（2） 组织培养的类型
A 器官培养：如气管、肠段。器官保存了原功
能，用于分离某些有器官特异性的病毒。
B 组织块培养：如肝组织块培养肝炎病毒。
C 细胞培养（单层细胞培养）：现广泛使用的
组织培养技术。 最新课件
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（3）细胞培养的种类和方法
根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不
同可分为三类：
1． 原代和次代细胞培养
采集各种器官时要分开使用器械和
容器。
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（二）标本的运送和保存
标本采集后注意无菌、冷冻、保湿、 立即送检。
分离培养病毒的标本要尽快送到实 验室处理和接种。如不能及时送检，可 在4℃冷藏数小时，如需较长时间保存则 应 置 -70℃ 。 放 置 在 -20℃ ， 病 毒 容 易 灭 活，冻存液中需加入甘油或二甲亚砜等 作保护，避免反复冻融使病毒灭活。
应部位采取标本，处理标本时要考虑病
毒的生物学特性。常见分离病毒标本的
选择见教材P64表4-2。
（1） 心脏疾病
（2） 中枢神经系统感染
（3） 先天或新生儿感染
（4） 胃肠道疾病
（5） 呼吸道感染
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3．常见标本的采集方法
（1） 血液：以无菌手续抽取抗凝血10ml， 抗凝剂可选用100u/ml肝素钠。为了血清 学检查的需要，应抽取另一管5ml血液， 不抗凝送检。
程度上取决于标本的恰当采样和处理，为了保 证标本质量，应注意以下问题：
1．采样时间 尽可能在发病的初期，急性期 或患者入院的当天进行，越早越好，最好在治 疗之前。疾病后期体内产生免疫力，病毒量减 少或消失。
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2．标本种类的选择
根据临床感染的症状及流行病学资
料，判断可能感染病毒的种类，选择相
清学实验；后者主要是核酸杂交与PCR 及现代免疫学技术。
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病毒分离培养
病原学诊断 形态学检测
病 毒
分子生物学技术——病毒核酸
学
补体结合试验
检
中和试验
验
血清学诊断 血凝抑制试验
间接免疫荧光检测
酶联免疫吸附试验
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一、标本采集与运送
（一）标本的采集 要从临床标本中成功地分离出病毒，很大
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（1） 中和试验
是将病毒与特异性抗体进行免疫反 应，使病毒失去感染性，在细胞培养和 活的机体内不出现病变的试验。常用细 胞培养进行中和试验。
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方 法：
①固定病毒（100TCID50），稀释血清，测 Ab效价。两次效价相差4倍以上有诊断意 义。 TCID50：50%组织细胞感染的病毒 剂量(50%Tissue cell infective dose TCID50)。 ② 固定血清（1：20或1：40），稀 释病毒，求中和指数。
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3．传代细胞系
来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程的变异 细胞。细胞增殖特征和染色体均类似于肿瘤细 胞。不宜用于疫苗的制备，常用于病毒的分离 和鉴定。
（4）组织培养的特点
优点：A．来源广；B．不受机体免疫因素 影响，个体差异小，敏感范围广；C．易于观 察病变；D．可用于病毒的分离、鉴定、疫苗 的制备；E．易管理，相对比较经济。
病毒感染的实验诊断
张德纯 教授
临床微生物教研室
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1
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
病毒（Virus）是结构最简单、体积 最小的微生物。病毒感染十分常见，约 70%~80%的传染病由病毒感染所引起。 迄今已证实500多种病毒对人有致病性， 其中不少病毒危害极大，如最近流行的 SARS病毒。因此尽快获得病毒的实验诊 断，对控制病毒的传播、疾病的诊断和 防治具有重要的意义。
缺点：条件要求高，必须要有细胞培养的 条件。
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2. 鸡胚接种
鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、 痘类病毒的较为理想的材料。
（1） 常用接种部位和用途
38-39℃ 新鲜受精卵
5-13天
卵黄囊接种 羊水腔接种 尿囊腔接种 绒毛尿囊膜接种
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气室 羊膜
羊水囊
卵壳
卵白
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尿囊 绒毛尿 囊膜 卵黄囊
抑制试验等
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（3） 病毒在细胞培养中的表现
① 细胞代谢类型改变：细胞代谢产酸可 导致培养液pH指示剂呈黄色，病毒 增殖抑制了细胞代谢，使培养液不变 色或变红。但腺病毒不抑制细胞代谢， 反而促进糖酵解增加产酸。
② 细胞形态学变化 由病毒增殖所引起的细胞变化称为
细胞病变效应(cytopathic effect CPE)。
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2
病毒性疾病实验诊断的一般原则：
特异、敏感、快速和简便。首先根据流
行病学和临床特点，初步判断可能感染
的病毒；然后根据可疑病毒生物学特点、
机体免疫应答和临床过程，以及病人当
前所处的时机，确定实验诊断的方法。
目前病毒感染的检查主要依靠经典的方
法和近来发展起来的分子生物学等方法。
前者主要包括病毒分离培养、鉴定及血
加8~10ml运送液立即送检。
（5） 含漱液 可用无菌生理盐水，让患者含漱几
次取得，与运送液等量混合。
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（6） 喉拭子：用生理盐水湿润的拭子采 取咽喉部表面，置运送液中，注意
避免唾液污染。 （7）尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸
入尿道4cm轻轻转动2~3次，以获 得较多的上皮细胞，取出后置运送
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③ 耐酸试验
肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在 酸性环境下易被灭活。
④ 乙醚敏感试验
病毒外周如有类脂包膜，则易被乙醚 破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可 作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可 用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。
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2 最后鉴定——血清学试验
在初步鉴定的基础上，对已分离出 阳性结果需选择适当的血清学方法对病 毒分离株作最后鉴定。血清学方法鉴定 是将分离到的病毒和已知病毒的参考血 清作中和试验、补体结合试验、血凝抑 制试验等。由于分子病毒学的发展，病 毒的最后鉴定还应包括分子生物学方法 的鉴定，它还能检出不产生细胞病变的 那些病毒。
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① 卵黄囊接种：用于流行性脑炎病毒分 离
② 羊水腔接种：用于流感病毒、副流感 病毒的初次分离
③ 尿囊腔接种：用于流感病毒、腺病毒、 腮腺炎病毒分离
④ 绒毛尿囊膜接种：用于痘病毒、疱疹 病毒分离
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（2） 鸡胚接种的特点 优点：A.鸡胚是一个整体，可有多种 接种途径；
B.可收获大量病毒； C.鸡胚本是无菌无病毒的，对
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为了抑制细菌生长通常在病毒传送
培养基（VTM）中加入抗生素如青霉素 100U/l 和 链 霉 素 100μg/ml ， 为 了 抑 制 真 菌 的 生 长 加 入 2.5μg/ml 二 性 霉 素 B 或 40μg/ml制霉菌素。
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二、病毒的分离与鉴定
（一）病毒分离和鉴定的一般程序 见书P66图4-1
（二）病毒的分离
病毒是专性细胞寄生，需要在活细胞 或动物体内才能得到分离。选择何种动物 或细胞来分离，应根据临床感染的症状和 流行病学资料，推测可能的病毒种类，选 择相对敏感的动物和细胞来分离标本中的 病毒。
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1.组织培养
（1） 概念
将人或动物离体的活组织或分散的活细胞， 在实验室的试管或培养基中，模拟体内的生理 条件使之生存和生长，称之为组织培养。
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④ 干扰现象
一种病毒感染细胞后，可以干扰以 后进入的病毒的增殖。利用此现象鉴定 不引起形态学变化的病毒。如某些型别 的鼻病毒能干扰以后进入的副流感Ⅰ型 病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸 附作用。
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30
⑤ 红细胞吸附及吸附抑制试验
红细胞吸附现象的产生是由于病毒 在细胞膜成熟时，将其血凝素插入细胞 膜，使感染细胞吸附红细胞，是病毒增 殖的指标。该现象可被相应的病毒特异 性抗体所抑制，称为红细胞吸附抑制试 验，可用来鉴定病毒。
病毒感染动物的范围、发病的潜伏期有差 异。如柯萨奇B组病毒对新生乳鼠致病，对成 年小鼠不致病；小鼠脑内接种乙脑病毒，潜伏 期一般为4天，少于4天发病则可能为非乙脑病 毒引起。
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（2）对鸡胚的敏感性 不同病毒对鸡胚不同接种途径
敏感性不同。 直接法：如观察绒毛尿囊膜是
否有病灶 间接法：尿囊液、羊水做血凝
接种病毒不产生抗体；
D.来源广，操作简便。 缺点: A.易感病毒较少，应用较局限；
B.反复用鸡胚传代，病毒毒力 可下降。
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3. 动物接种
（1） 常用动物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、 猴等
（2） 接种途径： 呼吸道病毒，如流感病毒，滴鼻接种3周龄新生 小鼠 肠道病毒，如柯萨奇病毒，腹腔接种乳鼠（一 日龄） 乙肝病毒，静脉注射猩猩 嗜神经病毒，如乙脑病毒（用3周龄小鼠）、狂 犬病毒（用家兔），颅内接种
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（3） 接种后观察应每日至少两次，必要时 每隔2~4小时观察一次。根据实验目 的的不同，观察不同的反应情况。
（4） 动物接种特点 优点：A.可以按照不同途径分离鉴定 病毒，可模拟人类感染途径 B.可用于疫苗的筛选、制备 C.可用于制备抗血清 D.操作简便，对环境要求低
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缺点：A.可自然带毒或隐性感染，影响
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中和指数>50为阳性，有意义；
中和指数<9为阴性，无意义；
中和指数10~49，为可凝。
中和试验较复杂和费时，多用于V的鉴定和 流行病学调查，对临床诊断价值不大。
（2）血凝与血凝抑制试验
某些病毒可与一定种类的哺乳动物或禽类的 红细胞产生血凝现象。加入相应的血凝素抗体可 抑制血凝现象的发生，称为血凝抑制试验。可作 为病毒型别鉴定的依据。
（3）补体结合试验
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三、病毒感染的快速诊断
（一）、病毒的形态学检查 1. 光学显微镜 可以观察到大型的病毒如痘病毒类。在光学
显微镜下还可以观察到病毒感染的宿主细胞的胞 质内或细胞核内出现嗜酸性的包涵体（inclusion body）。根据包涵体的特点，可以作出辅助诊断。 包涵体可能是病毒增殖的场所或病毒颗粒的聚合 体，也可能是宿主细胞对病毒作用的反应产物， 一般来说，产生核内包涵体的是在细胞核内装配 的病毒（通常为DNA病毒），产生胞质内包涵体 的是在胞质中装配病毒（通常为RNA病毒）。
离体的新鲜组织或器官，机械处理
胰蛋白
洗涤
吹打
酶消化
加入营养液
单个细胞悬液
1-3次
细胞计数 、调整细胞浓度
分装在培养
生长
瓶内培养 形成单层细胞，称为原代细胞培养
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胰酶消化 转种新的培养瓶
形成单层
细胞，称为次代细胞培养
2． 二倍体细胞株
原代细胞多次连续传代后仍保持二倍体染 色体特性（即含23对染色体），称之为二倍体 细胞。传代细胞寿命一般为40~50代，大多数 为成纤维细胞,如人胚肺细胞。广泛用于病毒分 离和疫苗制备。
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A. 细胞溶解，细胞培养瓶中出现空斑, 如肠道病毒；
B. 细胞融合形成多核巨细胞，如疱疹病
毒； C .细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，如腺
病毒； D .胞浆内或核内出现嗜酸性包涵体，如
狂犬病毒： E .不出现细胞病变现象。
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③ 空斑或蚀斑（plaque）形成试验
空斑是指在单层细胞中被病毒感染引 起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。 一般而言，一个空斑是由一个感染性病 毒颗粒感染所引起。不同的病毒引起的 空斑形态和大小不同。可进行病毒颗粒 的计数、纯化，结合中和试验可进行病 毒的鉴定。
结果的观察 B.存在个体差异 C.敏感病毒较少，或有些病毒感
染后不出现明显症状，不宜观
察 D.不经济，难管理
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（三）病毒的鉴定
1.初步鉴定 根据临床症状、流行病学特点、标本来
源、易感动物范围、细胞病变特征及生物学特 性、理化性质，可初步确定病毒属于何科何属。 （1） 动物感染范围及潜伏期
（2） 脑脊液：以无菌手续抽取脑脊液 1~2ml，置无菌试管内，在冰浴中立
即送检。4℃可存放72h。
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（3）宫颈或阴道拭子
采取病灶部位分泌物，将拭子置运 送液中；如无病损部位，则清理宫颈口 粘液，将拭子伸入宫颈约1cm停留5秒以 上取出，置运送液中4℃冰浴立即送检。
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（4） 粪便标本 取2~4g粪便标本在无菌的容器中，
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（4） 理化性质的测定
① 病毒的大小和形态：可用电镜观察 病毒的大小和形态。
② 核酸类型鉴别及序列测定：利用 5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）抑制DNA复制 的特性，在细胞培养液中加入该物质， 可抑制DNA病毒的复制和增殖，抑制细 胞病变的出现，但对RNA病毒无抑制作用， 以此判断病毒核酸类型。也可对病毒特 异序列或全序列的碱基排列测定或DNA 杂交、DNA-RNA杂交来鉴定病毒。
（2） 组织培养的类型
A 器官培养：如气管、肠段。器官保存了原功
能，用于分离某些有器官特异性的病毒。
B 组织块培养：如肝组织块培养肝炎病毒。
C 细胞培养（单层细胞培养）：现广泛使用的
组织培养技术。 最新课件
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（3）细胞培养的种类和方法
根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不
同可分为三类：
1． 原代和次代细胞培养