虾苗场3种重要病原同步定量PCR检测技术的建立

文章编号：１００４－２４９０（２０２０）０３－０３７５－１０
虾苗场３种重要病原同步
定量ＰＣＲ检测技术的建立
收稿日期：２０１９－０３－２５
基金项目：中国水产科学研究院基本科研业务费（２０１７ＨＹ ＺＤ０３０２）；上海市虾类产业技术体系建设项目［沪农科产字（２０１４）第５号］；公益性行业（农业）科研专项基金（２０１３０３０４７）
作者简介：李楠英（１９９３—），男，硕士研究生，研究方向：水产动物病害与防治。

Ｅ ｍａｉｌ：９３５４５４９５１＠ｑｑ．ｃｏｍ通信作者：周俊芳，副研究员。

Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｊｆ＠ｅｃｓｆ．ａｃ．ｃｎ
李楠英１，２，房文红１，王　元１，马清扬１，２，
李新苍１，赵　姝１，符贵红１，周俊芳１
（１．中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室，
上海　２０００９０；２．上海海洋大学水产与生命学院，上海　２０１３０６）
摘　要：白斑综合征病毒（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＷＳＳＶ）、虾肝肠胞虫（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ，ＥＨＰ）和虾虹彩病毒（ｄｅｃａｐｏｄｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔｖｉｒｕｓ１，ＤＩＶ１）为近年来凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）育苗场内的主要生物性危害因素，其中２种或３种病原共感染的现象也较为常见，快速、准确地检测和鉴别这３种病原是大型苗场生物安保体系构建和无特定病原虾苗生产的迫切需求。

基于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料法，建立了同步扩增３种病原的定量ＰＣＲ检测技术。

结果显示，该同步方法对３种病原的标准曲线相关系数（Ｒ２）均大于０．９９，且检测限可低至１０ｃｏｐｙ·μＬ－１，尤其是ＷＳＳＶ，在低至１ｃｏｐｙ·μＬ－１时仍能保持较好的组内和组间重复性。

熔解曲线分析显示，该同步定量ＰＣＲ技术对对虾样品的扩增产物只在７８．４℃、７９．７℃、８３．５℃处出现３个尖锐峰，分别与３种病原（ＤＩＶ１、ＥＨＰ和ＷＳＳＶ）扩增产物的Ｔ
ｍ
值相对应。

以上结果表明，建立的同步定量ＰＣＲ检测技术具有较高的检测灵敏度和良好的病原特异性，可以在５０ｍｉｎ内同步完成对３种病原的快速鉴定和组织内病原含量的确定，既可用于对虾育苗场内对这３种病原的监测，也适用于对养殖对虾病原感染与病害发生的风险预测。

关键词：白斑综合征病毒；虾肝肠胞虫；虾虹彩病毒；同步定量ＰＣＲ
中图分类号：Ｓ９４５．１ 文献标志码：Ａ
引进品种凡纳滨对虾（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）因为生长速度快、适应性强，其种苗培育和养殖产业在我国得到持续发展，成为我国重要水产养殖经济品种。

然而，随着混养与集约化等多种模式的开发和国内外虾类产品与苗种流通的增加，我国凡纳滨对虾病原种类呈现增多趋势，如白斑综合征病毒（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＷＳＳＶ）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈｙｐｏｄｅｒｍａｌａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＩＨＨＮＶ）、偷死病野田村病毒（ｃｏｖｅｒｔｍｏｒｔａｌｉｔｙｎｏｄａｖｉｒｕｓ，ＣＭＮＶ）、桃拉综合征病毒（Ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＴＳＶ）、黄头病毒（ｙｅｌｌｏｗｈｅａｄｖｉｒｕｓ，ＹＨＶ）、传染性肌肉坏死病毒（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＩＭＮＶ）和最近发生的虾虹彩病毒（ｄｅｃａｐｏｄｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔｖｉｒｕｓ１，ＤＩＶ１）等病毒性病原［１－２］、虾肝肠胞虫（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ，ＥＨＰ）等寄生虫性病原［３］，以及副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、哈维弧菌（Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ）和气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）等细菌性病原［４－７］。

其中，ＷＳＳＶ、ＩＨＨＮＶ、ＴＳＶ、ＹＨＶ、ＩＭＮＶ所致疾病被农业部动物疫病名录（２０１３）列为二类疫病；尽管ＥＨＰ、ＤＩＶ１和致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌
海　洋　渔　业２０２０年
（Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓＡＨＰＮＤ，Ｖｐ
ＡＨＰＮＤ
）为近几年新发的病原，但是这几种病原对对虾养殖造成的经济损失却非常严重，已经成为虾类养殖业的重要威胁［８－１１］。

鉴于对虾病原种类的多样性、危害严重性以及许多养殖病害的暴发源于病原对种苗的微量感染等，近年来生物安保育苗技术在大型对虾育苗场逐步推广［１２］，部分病原的发病率和暴发程度得到明显控制，如ＴＳＶ和ＩＨＨＮＶ的检出率大幅降低，ＷＳＳＶ也从２０世纪末的一类疫病降为二类疫病。

笔者近几年在上海、海南和福建等省市的几家大型凡纳滨对虾育苗场对常见病原的检测结果表明，ＥＨＰ、ＷＳＳＶ和ＤＩＶ１为育苗场内的主要生物性危害因素，因此，这３种病原为凡纳滨对虾育苗场内构建生物安保体系的重点监控病原。

由于苗种携带病原呈微量、隐性的感染特征，因此，其检测方法首选样品用量低、灵敏度高的分子生物学技术，如常规、套式和定量ＰＣＲ等检测技术。

其中，定量ＰＣＲ技术由于比普通ＰＣＲ技术灵敏度更高且能够确定病原感染程度，因此，越来越多地被应用于重要病原的检测［１３－１４］。

与此同时，为了适应大量样品和多种病原的检测需求，ＰＣＲ检测技术也在向高通量方向发展，比如多重和同步检测技术［１５－１７］。

然而，到目前为止还没有见到同步检测ＥＨＰ、ＷＳＳＶ和ＤＩＶ１的定量ＰＣＲ技术的报道，因此，本研究的目标是建立同步检测ＥＨＰ、ＷＳＳＶ和ＤＩＶ１的定量ＰＣＲ技术，以期在提高病原检测通量的同时，提高对种苗隐性感染病原的检测灵敏度和对种苗风险评估的精确度，为苗场生物安保体系的构建和对虾健康养殖提供技术支撑。

１　材料与方法
１．１　虾和病原
ＥＨＰ、ＷＳＳＶ和ＤＩＶ１阳性对虾样品为本实验室在上海、浙江等地养殖场采集的、经ＰＣＲ分别鉴定的养殖对虾，保存于－８０℃冰箱；维氏气单胞菌（Ａ．ｖｅｒｏｎｉｉ）、副溶血弧菌、哈维弧菌等病原为本实验室保存；ＳＰＦ虾苗采自上海彰显渔业合作社，为阴性对照样品。

１．２　引物
分别设计靶向ＤＩＶ１ＭＣＰ基因（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＦ５９９４６８）、ＥＨＰＳＷＰ基因（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＸ２５８１９７）和ＷＳＳＶ基因组（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３３２０９３．３）的多对引物，送上海生工生物工程有限公司合成。

１．３　ＤＮＡ提取
由于苗场虾苗个体很小，可根据培育的不同时期采集一定数量的完整个体（约２０ｍｇ）匀浆，然后参考海洋动物基因组ＤＮＡ提取试剂盒说明书（天根）提取样品总ＤＮＡ。

１．４　实时定量ＰＣＲ质粒标准品的制备
以ＤＩＶ１、ＥＨＰ和ＷＳＳＶ阳性样品的总ＤＮＡ为模板，参考文献［１８］的方法和试剂，分别用合成的３种病原的定量ＰＣＲ引物进行普通ＰＣＲ扩增。

扩增产物经凝胶电泳纯化后连接ｐＭＤＴＭ１９ Ｔ载体，转化感受态细胞ＤＨ５α。

提取的阳性质粒ＤＮＡ按１０倍比稀释成不同梯度的质粒标准品，置于－２０℃冰箱保存备用。

１．５　同步扩增定量ＰＣＲ反应体系和条件的确定及方法建立
首先，参考文献［１８］的方法和试剂，确定一种病原（ＤＩＶ１）的ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时定量ＰＣＲ扩增的最佳引物、反应体系和程序。

然后，基于ＤＩＶ１的反应体系和程序，用ＥＨＰ和ＷＳＳＶ的系列候选引物对各自的质粒标准品进行定量扩增，根据检测灵敏度、病原特异性和熔解曲线等筛选出各自的最佳扩增引物。

最后，通过进一步验证和优化，建立基于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ的３种病原同步定量ＰＣＲ检测技术。

２　结果与分析
２．１　同步扩增３种病原的实时定量ＰＣＲ条件与体系的确定
首先，通过对ＤＩＶ１引物的筛选，确定了其最佳扩增引物（表１）、反应体系和条件：扩增体系（２０μＬ）包含２×ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑⅡ（Ｔａｋａｒａ）１０μＬ，引物ＩＶＱＦ（１０μＭ）０．６μＬ，引物ＩＶＱＲ（１０μＭ）０．６μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，无ＤＮＡ酶水６．８μＬ。

最后添加ＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅ０．４μＬ；扩增条件为９５℃３０ｓ；然后，９５℃５ｓ，６０℃２０ｓ，循环４０次［１９］。

最后，将以上ＤＩＶ１定量ＰＣＲ方法的体系和条件设定为３种病原同步定量ＰＣＲ扩增的体系和条件。

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第３期李楠英等：虾苗场３种重要病原同步定量ＰＣＲ检测技术的建立
２．２　同步扩增条件下，ＥＨＰ和ＷＳＳＶ最优实时定量ＰＣＲ检测方法的建立
为了达到同步、高效扩增３种病原的目的，基于ＤＩＶ１的扩增体系和条件，运用ＥＨＰ和ＷＳＳＶ的系列备选引物对各自的质粒标准品进行扩增。

通过对各自方法的灵敏度、特异性以及稳定性和熔解峰等筛选分析后，确定了ＥＨＰ和ＷＳＳＶ的最佳定量ＰＣＲ引物（表１），建立了同步扩增条件下两者的最优定量ＰＣＲ检测方法。

如图１～图２和表２～表３所示，两种方法的相关系数（Ｒ２）均大于０．９９。

其中，ＥＨＰ的标曲方程和相关系数（Ｒ２）分别为ｙ＝－３．３８１５ｘ＋３７．７１８和０．９９７，ＷＳＳＶ的标曲方程和相关系数（Ｒ２）分别为ｙ＝－３．１１２９ｘ＋３５．６２６和０．９９９。

将以上系列标准品分别置于－８０℃冰箱保存６０ｄ后，各自重复检测的结果差异均不显著（Ｐ＞０．０５）。

２．３　同步扩增ＤＩＶ１、ＥＨＰ和ＷＳＳＶ的实时定量ＰＣＲ检测技术的验证
运用本研究建立的３种病原同步定量ＰＣＲ检测技术，对经套式ＰＣＲ方法检测过的１５份样品（部分样品为１～３种病原阳性）进行同步扩增，并以无ＤＮＡ酶水作对照，熔解曲线分析结果如图３所示。

在同一块定量ＰＣＲ板上，熔解曲线只在７８．４℃、７９．７℃、８３．５℃处出现３个尖锐峰，分别与ＤＩＶ１、ＥＨＰ和ＷＳＳＶ定量扩增产物的Ｔ
ｍ
值一致，而阴性样品和阴性对照没有出现熔解峰。

检测结果如表４所示，１５份样品中包含８份ＤＩＶ１阳性样品、６份ＥＨＰ阳性样品和２份ＷＳＳＶ阳性样品，检出病原最低基因拷贝数分别为３４ｃｏｐｙ·μＬ－１（ＤＩＶ１）、２０ｃｏｐｙ·μＬ－１（ＥＨＰ）和６８ｃｏｐｙ·μＬ－１（ＷＳＳＶ），而原先ｎＰＣＲ的检测阳性数分别为６份（ＤＩＶ１）、４份（ＥＨＰ）和１份（ＷＳＳＶ）。

表１　同步扩增ＤＩＶ１、ＥＨＰ和ＷＳＳＶ的定量ＰＣＲ引物
Ｔａｂ．１　ＰｒｉｍｅｒｓｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＩＶ１，ＥＨＰａｎｄＷＳＳＶ
引物Ｐｒｉｍｅｒ序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ病原ＰａｔｈｏｇｅｎＩＶＱＦＣＡＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴ
ＩＶＱＲＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＣＴＣＧ
ＤＩＶ１ＳＷＰＱＦＧＣＡＧＡＧＴＧＴＴＧＴＴＡＡＧＧＧＴＴＴＡＡＧＴ
ＳＷＰＱＲＧＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＴＴＧＡ
ＥＨＰＷＳＦ４ＣＧＡＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＡＴ
ＷＳＲ１ＡＡＧＡＧＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＧＴＴ
ＷＳＳＶ
表２　ＥＨＰ实时定量ＰＣＲ技术的组内重复性
Ｔａｂ．２　ＩｎｔｒａｇｒｏｕｐｖａｒｉａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠｑＰＣＲｆｏｒＥＨＰｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｄｉｌｕｔｉｏｎｓ
质粒标准品浓度／（ｃｏｐｙ·μＬ－１）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ
ＣＴ值　ＣＴｖａｌｕｅ
１２３平均Ｍｅａｎ
标准偏差
ＳＤ
变异系数／％
ＣＶ
１．０×１０８１０．２４１０．３６１０．２０１０．２７０．０８０．８０１．０×１０７１３．７４１３．９９１３．７４１３．８２０．１４１．０３１．０×１０６１７．９９１７．９７１８．００１７．９９０．０２０．０９１．０×１０５２１．４２２１．３１２１．２５２１．３３０．０８０．３９１．０×１０４２４．１３２４．３７２４．６４２４．３８０．２６１．０５１．０×１０３２６．９５２６．８４２６．８６２６．８８０．０６０．２１１．０×１０２３１．２６３０．９６３０．９２３１．０５０．１９０．６０１．０×１０１３４．５４３４．３１３４．０３３４．２９０．２５０．７４
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年
图１　ＥＨＰＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ实时定量ＰＣＲ检测技术的建立Ｆｉｇ．１　ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ ｂａｓｅｄｑＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒＥＨＰ
注：Ａ．不同浓度质粒标准品扩增曲线（１～８：质粒标准品浓度分别为从曲线１的１．０×１０８ｃｏｐｙ·μＬ－１起依次１０倍稀释至曲线８的１．０×１０１ｃｏｐｙ·μＬ－１）；Ｂ．熔解曲线；Ｃ．特异性实验：１：ＥＨＰ阳性样品ＤＮＡ；２：ＥＨＰ质粒标准品（１．０×１０４ｃｏｐｙ·μＬ－１）；３：ＳＰＦ
对虾；４：哈维弧菌；５：维氏气单胞菌；６：副溶血弧菌；７：无ＤＮＡ酶水；Ｄ．标准曲线
Ｎｏｔｅ：Ａ．ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲｆｏｒＥＨＰｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ１－８：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓａｒｅｉｎ１０ｔｉｍｅｓ
ｄｉｌｕｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍ１．０×１０８ｃｏｐｙ·μＬ－１ｏｆｃｕｒｖｅ１ｔｏ１．０×１０１ｃｏｐｙ·μＬ－１ｏｆｃｕｒｖｅ８；Ｂ．ｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲｆｏｒＥＨＰｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ；Ｃ．ａｓｓａｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ：１：ＥＨＰ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｈｒｉｍｐＤＮＡ；２：ｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓｏｆＥＨＰ（１．０×１０４ｃｏｐｙ·μＬ－１）；３：
ＳＰＦＬ．ｖａｎｎａｍｅｉ；４：Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ；５：Ａｅｒｏｍｏｎａｓｖｅｒｏｎｉｉ；６：Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；７：ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅｄｄＨ２Ｏ；Ｄ．ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲｆｏｒＥＨＰｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ
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第３期李楠英等：虾苗场３种重要病原同步定量ＰＣＲ
检测技术的建立图２　ＷＳＳＶＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时定量ＰＣＲ检测技术的建立Ｆｉｇ．２　ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ ｂａｓｅｄｑＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒＷＳＳＶ
注：Ａ．不同浓度质粒标准品扩增曲线（１～８：质粒标准品浓度分别为从曲线１的１．０×１０７ｃｏｐｙ·μＬ－１
起依次１０倍稀释至曲线８的１．０×１００ｃｏｐｙ·μＬ－１）；Ｂ．熔解曲线；Ｃ．特异性实验：１：ＷＳＳＶ质粒标准品（１．０×１０４ｃｏｐｙ·μＬ－１），２：ＷＳＳＶ阳性样品ＤＮＡ；３：
ＳＰＦ对虾；４：哈维弧菌；５：维氏气单胞菌；６：副溶血弧菌；７：无ＤＮＡ酶水；Ｄ．标准曲线
Ｎｏｔｅ：Ａ．ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲｆｏｒＷＳＳＶｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ１－８：ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓａｒｅｉｎ１０ｔｉｍｅｓ
ｄｉｌｕｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍ１．０×１０７ｃｏｐｙ·μＬ－１ｏｆｃｕｒｖｅ１ｔｏ１．０×１００ｃｏｐｙ·μＬ－１ｏｆｃｕｒｖｅ８；Ｂ．ｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲｆｏｒＷＳＳＶｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ；Ｃ．ａｓｓａｙｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ：１：ｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓｏｆＷＳＳＶ（１．０×１０４ｃｏｐｙ·μＬ－１）；２：ＷＳＳＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｈｒｉｍｐＤＮＡ；
３：ＳＰＦＬ．ｖａｎｎａｍｅｉ；４：Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ；５：Ａｅｒｏｍｏｎａｓｖｅｒｏｎｉｉ；６：Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；７：ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅｄｄＨ２Ｏ；Ｄ．ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲｆｏｒＷＳＳＶｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ
表３　ＷＳＳＶ实时定量ＰＣＲ技术的组内重复性
Ｔａｂ．３　ＩｎｔｒａｇｒｏｕｐｖａｒｉａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲｆｏｒＷＳＳＶｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｄｉｌｕｔｉｏｎｓ
质粒标准品浓度／（ｃｏｐｙ·μＬ－１）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｔａｎｄａｒｄｓ
ＣＴ值ＣＴｖ
ａｌｕｅ１２３平均Ｍｅａｎ标准偏差
ＳＤ变异系数／％
ＣＶ
１．０×１０
７
１３．７４１３．７５１３．７９１３．７６０．０２０．１４１．０×１０６
１６．７８１６．７０１６．９０１６．７９０．０８０．５０１．０×１０
５
２０．２３２０．２６２０．３２２０．２７０．０４０．１８１．０×１０４
２３．３８２３．３２２３．３１２３．３４０．０３０．１２１．０×１０
３２６．６１２６．６１２６．６４２６．６２０．０１０．０５１．０×１０２
２８．９２２８．９３２８．８５２８．９００．０４０．１２１．０×１０
１３２．２４３２．２９３２．２９３２．２８０．０２０．０７１．０×１０
０
３５．９３
３５．８５
３５．８８
３５．８９
０．０３
０．１０
９
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图３　同步定量ＰＣＲ检测技术扩增对虾ＤＮＡ的产物熔解曲线图
Ｆｉｇ．３　ＭｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｓｏｆｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐＤＮＡｂｙｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓＳＹＢＲＧｒｅｅｎｑＰＣＲａｓｓａｙ
注：１：ＤＩＶ１阳性ＤＮＡ；２：ＥＨＰ阳性ＤＮＡ；３：ＷＳＳＶ阳性ＤＮＡ；４：ＤＩＶ１、ＥＨＰ和ＷＳＳＶ阴性ＤＮＡ以及无ＤＮＡ酶水
Ｎｏｔｅ：１：ＤＩＶ１ ｐｏｓｉｔｉｖｅＤＮＡ；２：ＥＨＰ ｐｏｓｉｔｉｖｅＤＮＡ；３：ＷＳＳＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅＤＮＡ；４：ＤＩＶ１ ，ＥＨＰ ，ａｎｄＷＳＳＶ ｎｅｇａｔｉｖｅＤＮＡａｎｄＤＮａｓｅ ｆｒｅｅｄｄＨ２
Ｏ表４　同步定量ＰＣＲ和套式ＰＣＲ对对虾样品中３种病原的检测结果对比
Ｔａｂ．４　ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎＬ．ｖａｎｎａｍｅｉｓａｍｐｌｅｓｂｙｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｑＰＣＲａｎｄｎＰＣＲａｓｓａｙ
样品编号Ｓａｍｐｌｅｎｕｍｂｅｒ
ＤＩＶ１
ｎＰＣＲｑＰＣＲ／
（ｃｏｐｙ·μＬ－１
）
ＥＨＰ
ｎＰＣＲｑＰＣＲ／
（ｃｏｐｙ·μＬ－１
）
ＷＳＳＶ
ｎＰＣＲｑＰＣＲ／
（ｃｏｐｙ·μＬ－１
）
１－０－０－０２＋２０３３５－０－０３－０＋１９７０６９－０４－０－０－０５＋３３２４５５７５５－０－０６＋２１４７＋５３６＋１９５７７－０－０－０８－３４＋１８１４３９－０９＋４５７－０－０１０＋１３０９－２０－０１１－０－０－０１２－７３－０－０１３－０－５２－０１４
－０－０－６８１５＋１０１９＋１１７０－０ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅｄｄＨ２
Ｏ－
０
－
０
－
０
３　讨论
白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫和虾虹彩病毒自发生以来先后对我国养殖凡纳滨对虾造成了
重大经济损失［９，２０－２１］。

研究表明，对虾常常被两
种以上的病原同时感染，即对虾病原存在共感染
甚至协同致病现象。

ＪＯＳＥＰＨ等［２２］
在斑节对虾
（Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ）育苗场内调查发现，１０４份虾苗样品中，ＷＳＳＶ、斑节对虾杆状病毒（Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，ＭＢＶ）和肝胰腺细小病毒（ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）共感染（双病原或３病原共感染）率占被检虾苗总数的
０８３
第３期李楠英等：虾苗场３种重要病原同步定量ＰＣＲ检测技术的建立
６０．６％；胡文娟等［２３］对对虾病毒的调查中也发现，ＷＳＳＶ与ＩＨＨＮＶ在我国养殖的凡纳滨对虾中存在共感染现象。

本研究中对虾样品的验证结果也表明，当前养殖对虾体内存在两种病原（ＥＨＰ与ＷＳＳＶ或ＥＨＰ与ＤＩＶ１）甚至３种病原（ＥＨＰ、ＤＩＶ１和ＷＳＳＶ）共感染的现象。

多个研究表明，建立同步或多重定量ＰＣＲ检测技术可以让对虾病原的共感染现象和相对感染程度得到更清晰的揭示：ＳＩＢＯＮＧＡ等［２４］通过建立多重ＰＣＲ技术，发现斑节对虾育苗场内同时存在ＷＳＳＶ、ＭＢＶ和ＩＨＨＮＶ；刘飞等［２５］则建立了可同时检测６种对虾病毒［ＷＳＳＶ、ＩＨＨＮＶ、ＨＰＶ、ＴＳＶ、ＩＭＮＶ和对虾杆状病毒（ＢＰ）］的多重ＰＣＲ检测方法，大幅提高了病原检测效率。

但是，由于普通ＰＣＲ方法需要对扩增产物进行电泳等后续处理，而且其检测灵敏度比定量ＰＣＲ要低很多，因此，多重或同步ｑＰＣＲ技术更加符合高通量、快速出报告的苗场生物安保监测要求；而且，ｑＰＣＲ技术还可以对病原的感染程度进行准确评估。

ＬＥＡＬ等［１６］和ＸＩＥ等［２６］通过建立同时检测ＷＳＳＶ、ＩＨＨＮＶ的双重ｑＰＣＲ技术和同时检测ＷＳＳＶ、ＩＨＨＮＶ与ＴＳＶ的三重（ＲＴ ）ｑＰＣＲ技术，不仅鉴别了对虾样品中共感染的病原，而且对每种病原的感染程度进行了定量分析。

由于寡核苷酸的添加会影响ｑＰＣＲ的扩增效率，因此，多重ｑＰＣＲ检测灵敏度比单病原ｑＰＣＲ技术要低［１６］。

如果检测对象为体质量较大的养殖对虾，这种细小差异对于疾病诊断和病害防控策略的影响相对较小，但是对于体质量很轻且病原含量很低的虾苗而言，采用同步ｑＰＣＲ检测方法也许更为合适。

本研究的质粒扩增结果表明，当总ＤＮＡ中靶基因含量低至１０ｃｏｐｙ·μＬ－１时，本研究建立的３病原同步定量ＰＣＲ检测技术对每种病原均能保持良好的组内和组间重复性，其中，ＷＳＳＶ在基因拷贝数为１ｃｏｐｙ·μＬ－１时仍然保持较好的组内和组间重复性。

对经套式ＰＣＲ鉴定过的对虾样品的验证结果也显示，１５份样品ＤＮＡ中３种病原的最低基因含量分别为３４ｃｏｐｙ·μＬ－１（ＤＩＶ１）、２０ｃｏｐｙ·μＬ－１（ＥＨＰ）和６８ｃｏｐｙ·μＬ－１（ＷＳＳＶ），这些病原的基因含量均低于ｎＰＣＲ对同一样品的检测限，因此，同步定量ＰＣＲ检测阳性数显著多于ｎＰＣＲ。

值得一提的是，本研究建立的ＷＳＳＶ定量ＰＣＲ检测技术，在ＷＳＳＶ含量为２ｃｏｐｙ·ｒｅａｃｔｉｏｎ－１（即１
ｃｏｐｙ·μＬ－１）时对应的平均Ｃ
Ｔ
值仍然小于３６，而已经报道的、同样基于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料法的ＷＳＳＶ定量ＰＣＲ检测方法，在ＷＳＳＶ基因含量为
１１．８５ｃｏｐｙ·ｒｅａｃｔｉｏｎ－１时，其Ｃ
Ｔ
值已经大于３６［２７］。

以上分析表明，本研究所建立的同步定量ＰＣＲ技术不仅稳定，而且具有较高的检测灵敏度。

对熔解曲线进行分析还可以看出，在同一块定量ＰＣＲ板上对３种病原进行同步扩增后，扩增产物熔解曲线只在７８．４℃、７９．７℃、８３．５℃处出现３个尖锐峰，恰好对应ＤＩＶ１、ＥＨＰ和ＷＳＳＶ的
产物Ｔ
ｍ
值，而阴性样品和阴性对照均没有出现熔解峰。

事实上，该同步ｑＰＣＲ检测技术已经多次被用于养殖凡纳滨对虾样品的检测，包括对部分养殖示范合作社内养殖虾类病原的长期跟踪检测，并多次检出了目的病原，其熔解曲线始终未见到异常扩增的情况（结果未显示），表明此同步ｑＰＣＲ方法具有良好的病原特异性，在复杂样品中只扩增目标病原基因序列［２８］。

除此之外，由于感染对虾的微孢子虫种类较多，因此，本研究选择编码ＥＨＰ的ＳＷＰ基因为靶标［２９］，也在一定程度上提高了该同步定量ＰＣＲ技术的病原特异性。

综上，本研究建立的３种病原同步定量ＰＣＲ检测技术，可以充分发挥定量ＰＣＲ技术９６孔板、３８４孔板的高通量优势，尤其是当单份样品中个体数量较少时，可实现多病原同板扩增，不仅能大幅缩短检测时间，提高苗场病原监测的时效性，而且可以快速揭示病原的共感染或协同现象。

参考文献：
［１］　ＦＬＥＧＥＬＴＷ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍａｊｏｒｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐｖｉｒｕｓｅｓｉｎＡｓｉａ，ａｈｉｓｔｏｒｉｃａｌｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｗｉｔｈｅｍｐｈａｓｉｓｏｎ
Ｔｈａｉｌａｎｄ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００６，２５８（１）：１－
３３．
［２］　ＺＨＡＮＧＱＬ，ＸＵＴＴ，ＷＡＮＸＹ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｏｖｅｒｔｍｏｒｔａｌｉｔｙｎｏｄａｖｉｒｕｓ
（ＣＭＮＶ）ｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｃｒｕｓｔａｃｅａｎ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７（２３３）：１１３－１１９．
［３］　ＡＲＡＮＧＵＲＥＮＬＦ，ＨＡＮＪＥ，ＴＡＮＧＫＦＪ．Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ（ＥＨＰ）ｉｓａｒｉｓｋｆａｃｔｏｒ
ｆｏｒａｃｕｔｅｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｄｉｓｅａｓｅ
（ＡＨＰＮＤ）ａｎｄｓｅｐｔｉｃｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓ
１
８
３
海　洋　渔　业２０２０年
（ＳＨＰＮ）ｉｎｔｈｅＰａｃｉｆｉｃｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＰｅｎａｅｕｓ
ｖａｎｎａｍｅｉ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０１７（４７１）：３７－４２．［４］　ＺＨＯＵＪＦ，ＦＡＮＧＷＨ，ＹＡＮＧＸＬ，ｅｔａｌ．ＡｎｏｎｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔａｎｄｈｉｇｈｌｙｖｉｒｕｌｅｎｔＶｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ
ｓｔｒａｉｎｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ“ｂａｃｔｅｒｉａｌｗｈｉｔｅｔａｉｌ
ｄｉｓｅａｓｅ”ｏｆＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｓｈｒｉｍｐ［Ｊ］．ＰＬｏＳ
ｏｎｅ，２０１２，７（２）：ｅ２９９６１．
［５］　李林桂，周俊芳，李新苍，等．对虾源副溶血弧菌强毒株ＨＮＢＸ １的分离鉴定与毒性分析［Ｊ］．海
洋渔业，２０１３，３５（４）：４７９－４８４．
ＬＩＬＧ，ＺＨＯＵＪＦ，ＬＩＸＣ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄｔｏｘｉｃｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｖｉｒｕｌｅｎｔＶｉｂｒｉｏ
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｓｔｒａｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ
ｖａｎｎａｍｅｉ［Ｊ］．ＭａｒｉｎｅＦｉｓｈｅｒｉｅｓ，２０１３，３５（４）：
４７９－４８４．
［６］　刘　迪，房文红，周红霞，等．虾源哈维氏弧菌的致病性与生物学特性比较分析［Ｊ］．海洋渔业，
２０１７，３９（２）：１９７－２０５．
ＬＩＵＤ，ＦＡＮＧＷＨ，ＺＨＯＵＨＸ，ｅｔａｌ．Ａ
ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＶｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ
Ｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ［Ｊ］．ＭａｒｉｎｅＦｉｓｈｅｒｉｅｓ，２０１７，３９
（２）：１９７－２０５．
［７］　王　元，周俊芳，韦信贤，等．海水和淡水养殖凡纳滨对虾肠道和鳃的菌群结构分析［Ｊ］．湖南农
业大学学报（自然科学版），２０１８，４４（２）：１９８－
２０３．
ＷＡＮＧＹ，ＺＨＯＵＪＦ，ＷＥＩＸＸ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｇｉｌｌｏｆ
Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｉｎｓｅａｗａｔｅｒａｎｄｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ
［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｕｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ），２０１８，４４
（２）：１９８－２０３．
［８］　ＢＩＪＵＮ，ＳＡＴＨＩＹＡＲＡＪＧ，ＲＡＪＭ，ｅｔａｌ．ＨｉｇｈｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆＥｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉｉｎｓｈｒｉｍｐｓ
ＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎａｎｄＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｓａｍｐｌｅｄ
ｆｒｏｍｓｌｏｗｇｒｏｗｔｈｐｏｎｄｓｉｎＩｎｄｉａ［Ｊ］．Ｄｉｓｅａｓｅｓｏｆ
ａｑｕａｔｉｃｏｒｇａｎｉｓｍｓ，２０１６，１２０：２２５－２３０．
［９］　ＱＩＵＬ，ＣＨＥＮＭＭ，ＷＡＮＸＹ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ，
ｓｈｒｉｍｐｈｅｍｏｃｙｔｅｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔｖｉｒｕｓ（ＳＨＩＶ），ｆｏｕｎｄｉｎ
ｗｈｉｔｅｌｅｇｓｈｒｉｍｐ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）［Ｊ］．
ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ，２０１７，７：１１８３４．
［１０］　陈蒙蒙，董　宣，邱　亮，等．凡纳滨对虾感染致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌（Ｖｐ（ＡＨＰＮＤ））
的定量分析［Ｊ］．渔业科学进展，２０１８，３９（４）：９３
－１００．
ＣＨＥＮＭＭ，ＤＯＮＧＸ，ＱＩＵＬ，ｅｔａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｃｕｔｅｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｄｉｓｅａｓｅ
ｃａｕｓｉｎｇＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｖｐ
ＡＨＰＮＤ
）ｉｎｉｎｆｅｃｔｅｄＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ［Ｊ］．ＭａｒｉｎｅＦｉｓｈｅｒｉｅｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１８，３９（４）：９３－１００．
［１１］　刘雅梅，邱　亮，程东远，等．检出虾肝肠胞虫（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ）的凡纳滨对虾
（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）群体的体长和体重关系
［Ｊ］．渔业科学进展，２０１７，３８（４）：９６－１０３．
ＬＩＵＹＭ，ＱＩＵＬ，ＣＨＥＮＧＤＹ，ｅｔａｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ
ｂｅｔｗｅｅｎｂｏｄｙｌｅｎｇｔｈａｎｄｗｅｉｇｈｔｏｆＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ
ｖａｎｎａｍｅｉｇｒｏｕｐｏｆＥｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ［Ｊ］．ＭａｒｉｎｅＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，３８
（４）：９６－１０３．
［１２］　黄　絰，曾令兵，董　宣，等．水产生物安保发展趋势与政策建议［Ｊ］．中国工程科学，２０１６，１８
（３）：１５－２１．
ＨＵＡＮＧＪ，ＺＥＮＧＬＢ，ＤＯＮＧＸ，ｅｔａｌ．Ｔｒｅｎｄ
ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｐｏｌｉｃｙｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｏｎａｑｕｔｉｃ
ｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｃｉｅｎｃｅｓ，
２０１６，１８（３）：１５－２１．
［１３］　ＱＩＵＬ，ＣＨＥＮＭＭ，ＷＡＮＸＹ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｈｒｉｍｐｈｅｍｏｃｙｔｅｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔ
ｖｉｒｕｓｂｙＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅｂａｓｅｄｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ［Ｊ］．
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１８（１５４）：９５－
１０１．
［１４］　ＳＨＹＡＭＫＵ，ＫＲＩＳＨＮＡＮＲ，ＪＥＥＮＡＫ，ｅｔａｌ．ＮｅｗｓｅｔｏｆＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒＳＹＢＲｇｒｅｅｎ ｂａｓｅｄｑＰＣＲ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＩＭＮＶｉｎＩｎｄｉａ［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，
２０１８，４９５：７２６－７３０．
［１５］　ＫＨＡＷＳＡＫＰ，ＤＥＥＳＵＫＯＮＷ，ＣＨＡＩＶＩＳＵＴＨＡＮＧＫＵＲＡＰ，ｅｔａｌ．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＲＴ ＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｉｘｖｉｒｕｓｅｓｏｆｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐ［Ｊ］．
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，２００８，２２（３）：１７７－
１８３．
［１６］　ＬＥＡＬＣＡＧ，ＣＡＲＶＡＬＨＯＡＦ，ＬＥＩＴＥＲＣ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｕｐｌｅｘｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲｆｏｒｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＷＳＳＶａｎｄＰｓｔＤＶ１ｉｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｓｈｒｉｍｐ
［Ｊ］．ＢＭＣＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１４（１０）：１５０．［１７］　ＹＡＮＧＢ，ＳＯＮＧＸＬ，ＨＵＡＮＧＪ，ｅｔａｌ．Ａｓｉｎｇｌｅ ｓｔｅｐｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈｙｐｏｄｅｒｍａｌ
ａｎｄｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓｉｎｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐ
［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｉｓｈＤｉｓｅａｓｅｓ，２０１０，２９（５）：３０１
－３０５．
［１８］　陈甜甜，房文红，王　元，等．梭子蟹肌孢虫ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时定量ＰＣＲ检测方法的建立与应用
［Ｊ］．南方水产科学，２０１７，１３（６）：２２－２９．
ＣＨＥＮＴＴ，ＦＡＮＧＷＨ，ＷＡＮＧＹ，ｅｔａｌ．
２８３
第３期李楠英等：虾苗场３种重要病原同步定量ＰＣＲ检测技术的建立
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ
ｒｅａｌ ｔｉｍｅｑＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｍｅｓｏｎｐｏｒｔｕｎｕｓ［Ｊ］．
ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅ，２０１７，１３（６）：２２－
２９．
［１９］　周俊芳，程家骅，房文红，等．一种对虾虹彩病毒实时荧光定量ＰＣＲ检测试剂盒：中国，
ＣＮ１０８０１８３７９Ａ［Ｐ］．２０１８．０５．１１．
ＺＨＯＵＪＦ，ＣＨＥＮＧＪＨ，ＦＡＮＧＷＨ，ｅｔａｌ．Ａ
ｒｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲｋｉｔｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
Ｄｅｃａｐｏｄｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔｖｉｒｕｓ１（ＳＨＩＶ）：Ｃｈｉｎａ，
ＣＮ１０８０１８３７９Ａ［Ｐ］．２０１８．０５．１１．
［２０］　ＯＩＤＴＭＡＮＮＢ，ＤＩＸＯＮＰ，ＷＡＹＫ，ｅｔａｌ．Ｒｉｓｋｏｆｗａｔｅｒｂｏｒｎｅｖｉｒｕｓｓｐｒｅａｄ ｒｅｖｉｅｗｏｆｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｒｅｌｅｖａｎｔ
ｆｉｓｈａｎｄｃｒｕｓｔａｃｅａｎｖｉｒｕｓｅｓｉｎｔｈｅａｑｕａｔｉｃ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｍｅａｓｕｒｅｓ
［Ｊ］．ＲｅｖｉｅｗｓｉｎＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０１８（１０）：６４１－
６６９．
［２１］　ＴＯＵＲＴＩＰＳ，ＷＯＮＧＴＲＩＰＯＰＳ，ＳＴＥＮＴＩＦＯＲＤＧＤ，ｅｔａｌ．Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉｓｐ．ｎｏｖ．
（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄａ：Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｉｄａｅ），ａｐａｒａｓｉｔｅｏｆ
ｔｈｅｂｌａｃｋｔｉｇｅｒｓｈｒｉｍｐＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ（Ｄｅｃａｐｏｄａ：
Ｐｅｎａｅｉｄａｅ）：Ｆｉｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅＰａｔｈｏｌｏｇｙ，
２００９，１０２（１）：２１－２９．
［２２］　ＪＯＳＥＰＨＴＣ，ＪＡＭＥＳＲ，ＲＡＪＡＮＬＡ，ｅｔａｌ．ＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｖｉｒａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ
ｐｏｓｔ ｌａｒｖａｅｆｒｏｍａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅｈａｔｃｈｅｒｉｅｓ［Ｊ］．Ｄａｔａｉｎ
Ｂｒｉｅｆ，２０１５，４：１７０－１７６．
［２３］　胡文娟，房文红，江　敏，等．淡水养殖凡纳滨对虾ＩＨＨＮＶ ＷＳＳＶ共感染率调查分析及其对免疫
相关酶活性的影响［Ｊ］．上海海洋大学学报，
２０１５，２４（５）：６８５－６９３．
ＨＵＷＪ，ＦＡＮＧＷＨ，ＪＩＡＮＧＭ，ｅｔａｌ．
ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｅｓｏｆＩＨＨＮＶ ＷＳＳＶｃｏ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎＰｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ
ａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｓｏｎｉｍｍｕｎｅ ｒｅｌａｔｅｄｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］．
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈａｎｇｈａｉＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１５，２４
（５）：６８５－６９３．
［２４］　ＳＩＢＯＮＧＡＭＦＪ，ＧＥＤＵＳＰＡＮＪＳ，ＣＡＩＰＡＮＧＣＭＡ．ＯｐｔｉｍｉｚｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲａｓｓａｙｓｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｆｅｃｔｉｎｇｈａｔｃｈｅｒｙ ｒｅａｒｅｄ
ｓｈｒｉｍｐ，ＰｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎｉｎｔｈｅＰｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ［Ｊ］．
ＨＶＭＢｉｏｆｌｕｘ，２０１３，５（３）：１４２－１４５．
［２５］　刘　飞，张宝存，张晓华，等．对虾６种病毒多重ＰＣＲ检测方法的建立［Ｊ］．渔业科学进展，２０１４，
３５（１）：６０－６７．
ＬＩＵＦ，ＺＨＡＮＧＢＣ，ＺＨＡＮＧＸＨ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｉｘｖｉｒｕｓｅｓｉｎ
ｓｈｒｉｍｐ［Ｊ］．ＭａｒｉｎｅＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，３５
（１）：６０－６７．
［２６］　ＸＩＥＺＸ，ＸＩＥＬＪ，ＰＡＮＧＹＳ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｒｅａｌ ｔｉｍｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
ｖｉｒａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｏｆｐｅｎａｅｉｄｓｈｒｉｍｐ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００８，１５３（１２）：２２４５－２２５１．
［２７］　ＤＨＡＲＡＫ，ＲＯＵＸＭＭ，ＫＬＩＭＰＥＬＫＲ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｈｙｐｏｄｅｒｍａｌａｎｄ
ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓａｎｄｗｈｉｔｅｓｐｏｔｖｉｒｕｓｉｎ
ｓｈｒｉｍｐｕｓｉｎｇｒｅａｌ ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，３９（８）：２８３５－２８４５．
［２８］　ＩＳＨＩＤＡＮ，ＳＡＫＵＲＡＤＡＭ，ＫＵＳＵＮＯＫＩＨ，ｅｔａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ１３ａｎｉｍａｌｓｐｅｃｉｅｓｕｓｉｎｇｔｗｏｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅａｌ ｔｉｍｅ
ＰＣＲａｓｓａｙｓａｎｄｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｌｅｇａｌ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８（３０）：６４－７１．
［２９］　ＪＡＲＯＥＮＬＡＫＰ，ＳＡＮＧＵＡＮＲＵＴＰ，ＷＩＬＬＩＡＭＳＢＡＰ，ｅｔａｌ．ＡｎｅｓｔｅｄＰＣＲａｓｓａｙｔｏａｖｏｉｄｆａｌｓｅ
ｐｏｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａｎ
Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ（ＥＨＰ）ｉｎ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓａｍｐｌｅｓｉｎｓｈｒｉｍｐｆａｒｍｓ［Ｊ］．Ｐｌｏｓ
Ｏｎｅ，２０１６，１１（１１）：ｅ０１６６３２０．
３
８
３
海　洋　渔　业２０２０年
ＡｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆｔｈｒｅｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｓｈｒｉｍｐｈａｔｃｈｅｒｉｅｓ
ＬＩＮａｎｙｉｎｇ１，２，ＦＡＮＧＷｅｎｈｏｎｇ１，ＷＡＮＧＹｕａｎ１，ＭＡＱｉｎｇｙａｎｇ１，２
，
ＬＩＸｉｎｃａｎｇ１，ＺＨＡＯＳｈｕ１，ＦＵＧｕｉｈｏｎｇ１，ＺＨＯＵＪｕｎｆａｎｇ
１
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥａｓｔＣｈｉｎａＳｅａａｎｄＯｃｅａｎｉｃＦｉｓｈｅｒｙＲｅｓｏｕｒｃｅｓＥｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓ，ＥａｓｔＣｈｉｎａｓｅａＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎａＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｉｓｈｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００９０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｉｓｈｅｒｉｅｓａｎｄＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０１３０６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ），Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ（ＥＨＰ）ａｎｄｄｅｃａｐｏｄｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔｖｉｒｕｓ１（ＤＩＶ１）ｈａｖｅｂｅｅｎｍａｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｈａｚａｒｄｓｉｎＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｈａｔｃｈｅｒｉｅｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ａｎｄｃｏ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈｔｗｏｏｒｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓａｒｅｃｏｍｍｏｎ．Ｒａｐｉｄａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｓａｎｕｒｇｅｎｔｎｅｅｄｆｏｒｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙｓｙｓｔｅｍａｎｄｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ（ＳＰＦ）ｓｅｅｄｉｎｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅｓｈｒｉｍｐｈａｔｃｈｅｒｉｅｓ．ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ，ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ（Ｒ２
）ｆｏｒａｌｌｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｗｅｒｅｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ０．９９ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｓａｓｌｏｗａｓ１０ｃｏｐｙ·μＬ－１．ＥｓｐｅｃｉａｌｌｙｆｏｒＷＳＳＶ，ｗｈｅｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｗａｓａｓｌｏｗａｓ１ｃｏｐｙ·μＬ－１，ｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｔｉｌｌｍａｉｎｔａｉｎｅｄｇｏｏｄｌｅｖｅｌｓｏｆ
ｉｎｔｒａ ｇｒｏｕｐａｎｄｉｎｔｅｒ ｇｒｏｕｐｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ．Ｍｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｏｎｌｙｔｈｒｅｅｓｈａｒｐｐｅａｋｓｏｆｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｓｈｒｉｍｐｓａｍｐｌｅｓａｔ７８．４℃，７９．７℃，８３．５℃，ｗｈｉｃｈｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｄｔｏｔｈｅＴｍｖ
ａｌｕｅｓｏｆＤＩＶ１，ＥＨＰａｎｄＷＳＳＶ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｎｃｏｎｔｒａｓｔ，ｎｏｍｅｌｔｉｎｇｐｅａｋｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎａｌｌｏｆｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ．ＴｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ａｓｓａｙｈａｄｂｏｔｈｈｉｇｈｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｇｏｏｄｐａｔｈｏｇｅｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｑｕｉｃｋｌｙｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｉｓｓｕｅｓｗｉｔｈｉｎ５０ｍｉｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｑＰＣＲａｓｓａｙｃａｎｂｅｕｓｅｄｎｏｔｏｎｌｙｔｏｍｏｎｉｔｏｒｔｈｅｔｈｒｅｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｓｈｒｉｍｐｈａｔｃｈｅｒｉｅｓ，ｂｕｔａｌｓｏｔｏｐｒｅｄｉｃｔｔｈｅｒｉｓｋｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｅａｓｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｉｎｓｈｒｉｍｐｆａｒｍｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）；Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｈｅｐａｔｏｐｅｎａｅｉ（ＥＨＰ）；ｄｅｃａｐｏｄｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔｖｉｒｕｓ１（ＤＩＶ１）；ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｓｓａｙ
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