生化实验05凯氏定氮法2
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加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂，浸泡数小时后在管 口盖一小漏斗，放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低 ，加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温，使消化管内液体 达到微沸，直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。
在消化过程中，可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧 化。如发现在消化管上部有黑色颗粒，应小心转动消化管， 用消化液将其冲洗下来。整个过程一般需3-4小时，均应在 通风橱中进行。
色）
16
三、实验步骤
1. 样品提取 准确称取3g左右样品放入研钵中，加入2%草酸溶液约
5mL研磨→匀浆液转入50 mL容量瓶，用草酸洗涤研钵3 次，洗涤液一并转入容量瓶中→用草酸定容至刻度→过滤 ，收集滤液，备用。
2.样品滴定 取滤液10 mL至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定 至粉红色，并在30s内不褪色为止。记录染料用量。
实验06 植物组织中总氮含量的测定 （微量凯氏定氮法）
Designed by XK Wang
1
氮素代谢在植物新陈代谢中占有主导地位。测定 氮素含量对于研究植物的氮素吸收、运输和代谢规 律，以及确定农产品品质、营养价值等均具有一定 意义。
动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类， 主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对 稳定，测定出样品中总氮含量，再乘上一个系数即 可得出样品中粗蛋白含量。
Designed by XK Wang
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二、材料、仪器设备及试剂
材料：包菜或其他果蔬
仪器设备：蒸发皿、天平、容量瓶、研钵、碱式滴定
管、漏斗、移液管等
试剂：
1. 2%草酸；
2. 碱性2,6-二氯酚靛酚溶液（蓝色）；
3. 0.1mg/mL 标准Vc溶液（用草酸配制）
2,6-二氯酚靛
酚溶液（蓝
Designed by XK Wang
2NH3 + 4H3BO3 →(NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O →2NH4Cl + 4H3BO3
Designed by XK Wang
4
二、材料、仪器设备及试剂
材料：面粉
仪器设备：消化管、分析天平、微量凯氏定氮蒸馏装
置、容量瓶、三角瓶、滴定管、移液管、消煮炉等。
Designed by XK Wang
3
一、原理
以甘氨酸为例的化学反应式： 消化：CH2NH2COOH + 3H2SO4→2CO2 + 3SO2 + 4H2O+NH3
2NH3 + H2SO4 →(NH4)2SO4 蒸馏: (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O + Na2SO4 + 2NH3↑
试剂：
1. 浓硫酸（AR级）；2. 30%（W/V）NaOH；
3. 30%H2O2； 5. 2%硼酸溶液；
4. 0.01mol/L HCl标准溶液； 6. 混合催化剂；
7. 混合指示剂（pH变化范围）
Designed by XK Wang
5
凯氏定氮蒸馏装置
全自动凯氏定氮仪
6
三、实验步骤
1. 样品消化（已完成） 准确称取0.1-0.2g样品（依其含氮量而定）至消化管中，
进样漏斗 密封阀
中加入2/3体积蒸馏水→关闭汽
冷凝管
水分离器阀和进样漏斗、并使管
蒸汽 发生器
道联通→打开冷凝管→打开电炉 加热蒸汽发生器，用热蒸汽通入
反应管 隔热套
吸收瓶
Designe仪d by器XK各W部ang分清洗15min。
8
3. Байду номын сангаас馏 （1）仪器洗涤
冲洗完毕，从加样漏斗向蒸馏管加入无氨蒸馏水，清洗 蒸馏反应管→打开汽水分离器阀、夹紧蒸汽发生器与蒸馏 反应管之间的橡皮管，由于冷却减压使得反应瓶中废液被 虹吸进入隔热套中→打开隔热套下端的活塞阀排出废液。 如此清洗2-3次。
（滴定空白蒸馏液的盐酸用量一般为0.20mL）
Designed by XK Wang
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四、数据记录
W= g（根据样品管编号在讲台上查表获得）； VT= mL; Vs= mL; A= mL；B= 0.20 mL
五、结果计算
样品总氮含量（%）= C ( A B) 14 VT 100 W VS 1000
12
注意事项：
• 每次蒸馏前均需清洗蒸馏反应瓶； • 在蒸馏过程中，不能同时关闭汽水分离阀和
蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹； • 定氮仪各连接处不能漏气。
Designed by XK Wang
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实验07 抗坏血酸（Vc）含量的测定 （滴定法）
Designed by XK Wang
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抗坏血酸又称为维生素c（Vc），在一般水果、果蔬中含 量较高。测定Vc含量，可作为衡量果蔬品质指标之一。
可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果， 当硼酸-指示剂混合液不变色时，表明蒸馏装置清洗干净 。
Designed by XK Wang
9
3. 蒸馏 （2）样品蒸馏
在三角瓶中装入20mL硼酸-指示剂混合液（此时应为紫 红色，如变为蓝色，应倒出重装或清洗三角瓶）承接在冷 凝管下端出口，将出口浸入在溶液中→打开汽水分离阀隔 活塞,打开蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹→准确 吸取10mL样品消化液通过加样漏斗加入蒸馏瓶中→通过漏 斗加入10mL NaOH溶液→用少量无氨蒸馏水重复冲洗漏斗 3次→塞紧漏斗塞，再在漏斗中加入少量蒸馏水密封漏斗→ 关闭汽水分离阀，开始蒸馏→观察硼酸-指示剂混合液颜色 变化，从颜色变绿起再蒸馏3-5min后，将三角瓶液面移离 Design冷ed b凝y X管K W下an口g 约1cm → 继续蒸馏1min左右，结束蒸馏。
面粉粗蛋白含量（%）=样品含氮量（%）×5.70
（C：滴定时标准盐酸溶液浓度（0.0100mol/L ）；VT：消化液定容总体积 （mL）；W：样品质量（g）；Vs：蒸馏时取样体积（mL）；A：滴定样品 所用盐酸体积（mL）；B：滴定空白所用盐酸体积（0.2 0mL） ）
Designed by XK Wang
一、原理
Vc具有很强的还原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的 氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈 蓝色。用草酸提取Vc，然后用蓝色的碱性2,6-二氯酚靛酚 溶液对其进行滴定时，Vc可将2,6-二氯酚靛酚还原成无色。 但当Vc被消耗完后，再滴入少许2,6-二氯酚靛酚就会使溶 液呈现红色，借此可指示滴定终点。根据标准2,6-二氯酚 靛酚的用量，可以计算出被测样品中Vc的含量。
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3. 蒸馏 （3）空白蒸馏
用未加植物样品的消化液（其余试剂都加入并按同样方 法进行消化）为空白液，按样品消化液的蒸馏方法进行蒸 馏。 4. 样品及空白滴定
样品和空白蒸馏完毕后，分别用0.01 mol/L盐酸标准溶 液滴定，直到硼酸-指示剂混合液变回淡紫红色即为滴定终 点，记录滴定样品和空白蒸馏液的盐酸用量。
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三、实验步骤
3. 染料标定 取10 mL标准Vc溶液至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶
液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为滴定终点。计算 1mL染料相当于Vc的mg数，即滴定度（A）。 4.空白滴定
取2%草酸10 mL至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴 定至粉红色，并在30s内不褪色为滴定终点，记录染料用
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量。
Designed by XK Wang
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四、数据记录
W= g；V1= mL; V0= mL； VT= mL; Vs= mL
五、结果计算
滴定度（ mg/mL）A=
标准Vc浓度10 (V标 V0）
样品Vc含量（mg/100g）= (V1 V0 ) AVT 100 W VS
（ A：滴定度（mg/mL）；V标：染料标定所用染料体积（mL）；V1：滴定 样品所用染料的mL数； V0：滴定空白所用染料的mL数； VT：样品液定容 总体积（mL）；Vs：滴定时取样品溶液的体积（mL）； W：样品质量 Des（ignged）by）XK Wang
组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。
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一、原理
在催化剂（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的条件下， 将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解成CO2和H2O， 其中的氮转变为氨，并进一步生成(NH4)2SO4，这个过程 称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH，经强碱 碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量 的硼酸溶液中生成四硼酸铵；再用标准盐酸滴定，直到硼 酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出 样品中总氮的含量。
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7
2. 定容： 消化液冷却后，沿管壁仔细加入10mL左右无氨蒸馏水以
冲洗管壁→冷却后转入100mL容量瓶，再用少量无氨蒸馏水 冲洗消化管数次，洗涤液一并转入容量瓶→冷却后用无氨蒸 馏水定容至刻度，混匀后备用。
3. 蒸馏
安全管
（1）仪器洗涤：在蒸汽发生器
导管 汽水分离器
在消化过程中，可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧 化。如发现在消化管上部有黑色颗粒，应小心转动消化管， 用消化液将其冲洗下来。整个过程一般需3-4小时，均应在 通风橱中进行。
色）
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三、实验步骤
1. 样品提取 准确称取3g左右样品放入研钵中，加入2%草酸溶液约
5mL研磨→匀浆液转入50 mL容量瓶，用草酸洗涤研钵3 次，洗涤液一并转入容量瓶中→用草酸定容至刻度→过滤 ，收集滤液，备用。
2.样品滴定 取滤液10 mL至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定 至粉红色，并在30s内不褪色为止。记录染料用量。
实验06 植物组织中总氮含量的测定 （微量凯氏定氮法）
Designed by XK Wang
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氮素代谢在植物新陈代谢中占有主导地位。测定 氮素含量对于研究植物的氮素吸收、运输和代谢规 律，以及确定农产品品质、营养价值等均具有一定 意义。
动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类， 主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对 稳定，测定出样品中总氮含量，再乘上一个系数即 可得出样品中粗蛋白含量。
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二、材料、仪器设备及试剂
材料：包菜或其他果蔬
仪器设备：蒸发皿、天平、容量瓶、研钵、碱式滴定
管、漏斗、移液管等
试剂：
1. 2%草酸；
2. 碱性2,6-二氯酚靛酚溶液（蓝色）；
3. 0.1mg/mL 标准Vc溶液（用草酸配制）
2,6-二氯酚靛
酚溶液（蓝
Designed by XK Wang
2NH3 + 4H3BO3 →(NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O →2NH4Cl + 4H3BO3
Designed by XK Wang
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二、材料、仪器设备及试剂
材料：面粉
仪器设备：消化管、分析天平、微量凯氏定氮蒸馏装
置、容量瓶、三角瓶、滴定管、移液管、消煮炉等。
Designed by XK Wang
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一、原理
以甘氨酸为例的化学反应式： 消化：CH2NH2COOH + 3H2SO4→2CO2 + 3SO2 + 4H2O+NH3
2NH3 + H2SO4 →(NH4)2SO4 蒸馏: (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O + Na2SO4 + 2NH3↑
试剂：
1. 浓硫酸（AR级）；2. 30%（W/V）NaOH；
3. 30%H2O2； 5. 2%硼酸溶液；
4. 0.01mol/L HCl标准溶液； 6. 混合催化剂；
7. 混合指示剂（pH变化范围）
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凯氏定氮蒸馏装置
全自动凯氏定氮仪
6
三、实验步骤
1. 样品消化（已完成） 准确称取0.1-0.2g样品（依其含氮量而定）至消化管中，
进样漏斗 密封阀
中加入2/3体积蒸馏水→关闭汽
冷凝管
水分离器阀和进样漏斗、并使管
蒸汽 发生器
道联通→打开冷凝管→打开电炉 加热蒸汽发生器，用热蒸汽通入
反应管 隔热套
吸收瓶
Designe仪d by器XK各W部ang分清洗15min。
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3. Байду номын сангаас馏 （1）仪器洗涤
冲洗完毕，从加样漏斗向蒸馏管加入无氨蒸馏水，清洗 蒸馏反应管→打开汽水分离器阀、夹紧蒸汽发生器与蒸馏 反应管之间的橡皮管，由于冷却减压使得反应瓶中废液被 虹吸进入隔热套中→打开隔热套下端的活塞阀排出废液。 如此清洗2-3次。
（滴定空白蒸馏液的盐酸用量一般为0.20mL）
Designed by XK Wang
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四、数据记录
W= g（根据样品管编号在讲台上查表获得）； VT= mL; Vs= mL; A= mL；B= 0.20 mL
五、结果计算
样品总氮含量（%）= C ( A B) 14 VT 100 W VS 1000
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注意事项：
• 每次蒸馏前均需清洗蒸馏反应瓶； • 在蒸馏过程中，不能同时关闭汽水分离阀和
蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹； • 定氮仪各连接处不能漏气。
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实验07 抗坏血酸（Vc）含量的测定 （滴定法）
Designed by XK Wang
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抗坏血酸又称为维生素c（Vc），在一般水果、果蔬中含 量较高。测定Vc含量，可作为衡量果蔬品质指标之一。
可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果， 当硼酸-指示剂混合液不变色时，表明蒸馏装置清洗干净 。
Designed by XK Wang
9
3. 蒸馏 （2）样品蒸馏
在三角瓶中装入20mL硼酸-指示剂混合液（此时应为紫 红色，如变为蓝色，应倒出重装或清洗三角瓶）承接在冷 凝管下端出口，将出口浸入在溶液中→打开汽水分离阀隔 活塞,打开蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹→准确 吸取10mL样品消化液通过加样漏斗加入蒸馏瓶中→通过漏 斗加入10mL NaOH溶液→用少量无氨蒸馏水重复冲洗漏斗 3次→塞紧漏斗塞，再在漏斗中加入少量蒸馏水密封漏斗→ 关闭汽水分离阀，开始蒸馏→观察硼酸-指示剂混合液颜色 变化，从颜色变绿起再蒸馏3-5min后，将三角瓶液面移离 Design冷ed b凝y X管K W下an口g 约1cm → 继续蒸馏1min左右，结束蒸馏。
面粉粗蛋白含量（%）=样品含氮量（%）×5.70
（C：滴定时标准盐酸溶液浓度（0.0100mol/L ）；VT：消化液定容总体积 （mL）；W：样品质量（g）；Vs：蒸馏时取样体积（mL）；A：滴定样品 所用盐酸体积（mL）；B：滴定空白所用盐酸体积（0.2 0mL） ）
Designed by XK Wang
一、原理
Vc具有很强的还原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的 氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈 蓝色。用草酸提取Vc，然后用蓝色的碱性2,6-二氯酚靛酚 溶液对其进行滴定时，Vc可将2,6-二氯酚靛酚还原成无色。 但当Vc被消耗完后，再滴入少许2,6-二氯酚靛酚就会使溶 液呈现红色，借此可指示滴定终点。根据标准2,6-二氯酚 靛酚的用量，可以计算出被测样品中Vc的含量。
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3. 蒸馏 （3）空白蒸馏
用未加植物样品的消化液（其余试剂都加入并按同样方 法进行消化）为空白液，按样品消化液的蒸馏方法进行蒸 馏。 4. 样品及空白滴定
样品和空白蒸馏完毕后，分别用0.01 mol/L盐酸标准溶 液滴定，直到硼酸-指示剂混合液变回淡紫红色即为滴定终 点，记录滴定样品和空白蒸馏液的盐酸用量。
Designed by XK Wang
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三、实验步骤
3. 染料标定 取10 mL标准Vc溶液至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶
液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为滴定终点。计算 1mL染料相当于Vc的mg数，即滴定度（A）。 4.空白滴定
取2%草酸10 mL至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴 定至粉红色，并在30s内不褪色为滴定终点，记录染料用
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量。
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四、数据记录
W= g；V1= mL; V0= mL； VT= mL; Vs= mL
五、结果计算
滴定度（ mg/mL）A=
标准Vc浓度10 (V标 V0）
样品Vc含量（mg/100g）= (V1 V0 ) AVT 100 W VS
（ A：滴定度（mg/mL）；V标：染料标定所用染料体积（mL）；V1：滴定 样品所用染料的mL数； V0：滴定空白所用染料的mL数； VT：样品液定容 总体积（mL）；Vs：滴定时取样品溶液的体积（mL）； W：样品质量 Des（ignged）by）XK Wang
组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。
Designed by XK Wang
2
一、原理
在催化剂（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的条件下， 将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解成CO2和H2O， 其中的氮转变为氨，并进一步生成(NH4)2SO4，这个过程 称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH，经强碱 碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量 的硼酸溶液中生成四硼酸铵；再用标准盐酸滴定，直到硼 酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出 样品中总氮的含量。
Designed by XK Wang
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2. 定容： 消化液冷却后，沿管壁仔细加入10mL左右无氨蒸馏水以
冲洗管壁→冷却后转入100mL容量瓶，再用少量无氨蒸馏水 冲洗消化管数次，洗涤液一并转入容量瓶→冷却后用无氨蒸 馏水定容至刻度，混匀后备用。
3. 蒸馏
安全管
（1）仪器洗涤：在蒸汽发生器
导管 汽水分离器