工程酵母INVSC1与H1246的生长与目标化合物积累的比较

山西农业科学2020，48（9）：1435-1439工程酵母INVSC1与H1246的生长与
目标化合物积累的比较
李
宏1,刘萌萌2,唐中伟1,李友莲2
（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学农学院，
山西太谷030801）摘
要:为了筛选出有价值的工程酵母菌株以应用于构建真核生物模型和研究相关目的基因的功能等，
以工程酵母INVSC1与H1246为试验材料，在适宜的条件下培养并测定其菌液浓度，经尼罗红染色观察、中性油脂的检测、目标化合物的提取与分析以及薄层色谱分析一系列试验来研究正常型酵母和缺陷型酵母油脂代谢机制。

结果表
明，在相同的生长条件下，工程酵母INVSC1比H1246生长快，先进入对数生长期和稳定期；正常酵母INVSC1油脂代谢途径正常，可以正常合成积累三脂酰甘油（TAG ），而缺陷酵母H1246丧失合成TAG 的能力；INVSC1的脂肪酸含量是H1246的2倍，其脂肪酸成分有3种，
而H1246有2种。

研究结果可为后期油脂代谢相关基因功能验证等分子生物学试验提供可靠的研究材料。

关键词:工程酵母INVSC1；H1246；目标化合物；脂肪酸成分；比较分析中图分类号:Q939.9
文献标识码:A
文章编号:1002-2481（2020）09-1435-05
Comparative of Growth and Target Compound Accumulation in
Engineering Yeast INVSC1and H1246
LI Hong 1，LIU Mengmeng 2，TANG Zhongwei 1，LI Youlian 2
（1.College of Life Sciences ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ；2.College of Agronomy ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）
Abstract ：To screen valuable engineering yeast strains for construction of eukaryotic model and study the function of related genes,in this study,engineering yeast INVSC1and H1246were cultured under suitable conditions and the concentration of bacteria solution was determined.The mechanism of lipid metabolism in normal and defective yeast was studied by Nile Red Staining,neutral lipid detection,extraction and analysis of target compounds and TLC analysis.The result showed that under the same growth conditions,INVSC1grew faster than H1246,and entered the logarithmic growth phase and the stable phase first.The lipid metabolic pathway of normal yeast INVSC1was normal,which could normally synthesize and accumulate triacylglycerol （TAG ）,while defective yeast H1246lost the ability to synthesize TAG.The fatty acid content of INVSC1was 2times of H1246.There were 3kinds of fatty acid composition in INVSC1and 2kinds in H1246.This experiment provides reliable research materials and basis for molecular biology experiments such as functional verification of genes related to oil metabolism in the later stage.
Key words ：engineering yeast INVSC1;H1246;target compound;fatty acid composition;comparative analysis
收稿日期:2020-07-04
基金项目:山西农业大学科技创新基金项目（2016ZZ09）；山西省科技攻关项目（20140311025-3）作者简介:李
宏（1975-），男，山西天镇人，实验师，硕士，主要从事农学、微生物学、转基因检测研究工作。

李友莲为通信作者。

随着基因组学和代谢工程技术的不断发展，
各种代谢途径的关键酶基因得到广泛的研究，相关的
工程酵母也逐渐被大家关注。

酵母与动物、
植物都为真核生物，具有生长繁殖较快、代谢周期较短、容易分离和培养等特点，可广泛应用于构建真核生物
模型，研究相关目的基因的功能等。

酿酒酵母是单
细胞真核微生物，属于酵母属（Saccharomyces ）酿酒
酵母种（Saccharomyces cerevisiae ）。

工程酵母IN-VSC1就是酿酒酵母中的一个重要代表种，又称酿
酒酵母INVSC1（Cerevisiae INVSC1），它生长繁殖较
快，代谢周期较短，发酵工艺简单，成本低廉，容易
分离和培养，而且全基因组比较小，遗传代谢背景比较清楚，具有完整的亚细胞结构和控制严密的基
因表达调控系统机制，
是外源基因[1]表达最为理想的真核生物表达系统，由于易于对其基因组进行连
锁分析、分子克隆及序列检测等，所以，还可广泛应用于构建真核生物模型和绘制更加详细而精准的遗传谱图，为人类的遗传疾病治疗和检测水平提供
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强有力的支撑。

油脂是高级脂肪酸与甘油形成的酯，即三脂酰甘油（TAG）。

三脂酰甘油的生物合成途径主要是甘油-3-磷酸（Gly3P）和脂酰辅酶A（acyl-CoA）为前体并在内质网酰基转移酶作用下通过多步生物反应合成的。

其最后一步反应在二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT）作用下形成。

三脂酰甘油还可由PDAT途径合成，即磷脂和二酰甘油在磷脂二酰甘油酰基转移酶（PDAT）的作用下反应生成TAG和溶血磷脂[2-3]。

H1246是酵母突变体TAG缺陷型的酵母菌株，该菌株中调控编码TAG合成的DGA1（编码DGAT）、LRO1基因（编码PDAT）以及ARE1和ARE2基因（编码胆固醇脂的合成）均已被敲除，可
用于鉴定植物、动物和微藻等真核生物三脂酰甘油（TAG）合成途径中DGAT或PDAT的活性[4-5]。

三脂酰甘油（TAG）可以由DGAT和PDAT途径合成[6]，由于H1246是TAG缺陷型酵母菌株，因而，不能通过上述途径合成和积累TAG。

而工程酵母INVSC1是正常型的酵母菌株，可以合成和积累TAG，用来验证相关目的基因的功能等。

近年来，在工程酵母的研究与应用方面取得了长足的进展。

如赵伟军[7]利用代谢工程技术对工业酿酒酵母菌株合成S-腺苷蛋氨酸（SAM）的代谢网络进行优化和改造，大幅度提高了该工业菌株生产SAM的能力；傅盈盈等[8]以油菜菌核病原菌为试验病菌，工程酵母INVSC1在温度28℃条件下培养繁殖20h后，经测定，当接种量为5%时，INVSC1对油菜菌核病原菌的抑菌效果最好；李媛等[9]通过对酿酒酵母基因工程菌的构建和工艺优化的研究以及加强对细胞代谢工程、基因组学、蛋白组学的商讨，从而获取了更多酵母的相关基因信息；王珍[10]通过对圆红冬孢酵母细胞内的DGAT基因进行鉴定和功能性分析，确定了产油酵母圆红冬孢酵母中只有RtDGATb具有DGAT的活性，并和油脂积累相关联，是调控油脂积累过程中的关键因素。

这些成果为工程酵母各个方面的研究奠定了基础。

本研究以工程酵母INVSC1和H1246为研究材料，通过培养并测定INVSC1与H1246的生长曲线，经尼罗红染色、苏丹黑染色、总脂肪酸含量测定、脂肪酸分析及薄层色谱分析等研究，分析工程酵母INVSC1与H1246的生长状况及目标化合物积累情况，旨在为后期油脂代谢相关基因功能验证等分子生物学试验提供基础，同时为酵母互补试验提供一定的科学依据。

1材料和方法
1.1试验材料
供试工程酵母INVSC1和H1246由山西农业大学分子农业与生物能源研究所提供。

1.2试验方法
1.2.1生长趋势测定
1.2.1.1培养基的配制及接种分别称取4g酵母膏、8g蛋白胨、8g无水葡萄糖于1000mL容量瓶中，向容量瓶中加入400mL蒸馏水，振荡使其混合均匀制备为YPD液体培养基。

将液体培养基于灭菌锅高温（120℃）高压（33.78kPa）中灭菌20min。

在已灭菌的YPD液体培养基中分别接入20μL工程酵母INVSC1和H1246菌种。

1.2.1.2菌液浓度的测定将接完菌的液体培养基于温度30℃、转速180r/min的空气浴振荡器中振荡，每2h用移液枪分别吸取工程酵母INVSC1和H1246的培养基液体3mL于2个比色皿中，以未接种酵母的YPD液体培养基作为对照，用紫外可见分光光度计测量其吸光度[11]并记录数据。

1.2.2工程酵母INVSC1和H1246菌株的尼罗红染色[12]观察将INVSC1与H1246的菌液离心并将二者菌株汇集起来，蒸馏水洗涤二者的沉淀，稀释菌体沉淀，将菌液OD600调整至0.2～0.3（菌液浓度过高影响染色效果）。

分别向菌液中依次加入菌液100μL、蒸馏水850μL、二甲基亚砜（DMSO）50μL、尼罗红染液（5mg/mL）10μL，强烈振荡混合均匀5s，避光染色1min，用荧光相差显微镜观察蓝色激发光下酵母的染色情况，并记录结果。

1.2.3酵母中性油脂的检测将INVSC1与H1246的菌液离心并将二者菌株收集起来，然后用蒸馏水洗涤二者的沉淀，并将菌体沉淀稀释，将菌液OD600调整至0.4～0.5。

用无菌水重悬菌体沉淀，混合均匀后5000r/min离心5min，倒掉上清液，分别向INVSC1与H1246的离心管中加入3mL0.3%的苏丹黑[13-14]染液，染色15min后于8000r/min下离心3min后去掉上清液，分别向离心管中加入10mL 70%的酒精溶液混合均匀后离心去掉上清液，重复3次。

用无菌水重悬菌体沉淀测OD580值，并记录数据。

1.2.4工程酵母INVSC1和H1246目标化合物的提取与分析
1.2.4.1总脂肪酸的提取分别称取50mg充分研磨的工程酵母INVSC1与H1246酵母粉末于50mL
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李宏等：工程酵母INVSC1与H1246的生长与目标化合物积累的比较
离心管中，加入7.5mL的氯仿-甲醇（体积比为1∶2）混合溶剂，将离心管置于温度37℃、转速200r/min的空气浴振荡器中抽提24h。

离心后收集上层有机相，向剩余的样品残渣再加入7.5mL的氯仿-甲醇（体积比为1∶2）混合溶剂重复抽提12h，并离心收集上层有机相，抽提3次并合并有机相。

向收集上层有机相的离心管中加入5mL氯仿溶液，9mL1%的氯化钠溶液，混合均匀后8000r/min 离心10min，收集下层有机相到已经称质量的指形管中，水浴锅加热至有机相挥发并用烘箱烘干，冷却至室温后称取指形管质量，计算脂肪酸总量[15-17]。

每组3次重复。

总脂肪酸含量＝（提取后总质量－提取前管质量）/酵母菌粉质量（1）1.2.4.2酵母脂肪酸成分分析通过高速冷冻离心机将工程酵母INVSC1与H1246酵母冷冻24h 即可得到二者的干燥菌体。

用分析天平分别称取100mg工程酵母INVSC1与H1246的干燥菌体并用液氮将其研磨成粉末，之后向工程酵母INVSC1与H1246中分别加入1.5mL提取buffer（含2.5%浓硫酸的甲醇，V/V），并且用水浴锅80℃温浴2h，待二者冷却至室温后分别向其中加入2mL0.9%（V/V）氯化钠和1mL正己烷，轻轻振荡混合均匀后在室温条件下4000r/min离心10min。

取二者上清液并真空抽干，将沉淀用50μL乙酸乙酯溶解。

在提取过程中加10μL C17∶0内标。

通过GC System测定工程酵母INVSC1与H1246酵母的脂肪酸含量。

色谱柱采用BPX-70柱，毛细柱采用30mm×0.25mm，设定GC的升温程序：初始温度设定为120℃并保持1min，色谱柱的温度以10℃/min的速率上升至150℃，然后再以4℃/min的速率让色谱柱温度上升至230℃并保持10min。

分别取其1μL样品上样后检测其脂肪酸含量[18]。

每组3次重复。

1.2.5薄层色谱分析（TLC）在硅胶板的下端1.5cm处用毛细管依次均匀点上TAG标样、工程酵母INVSC1和H1246总脂肪酸，点样斑点直径不大于0.5cm，每样间隔2.5cm，待斑点溶剂挥发干后将硅胶板放入展开剂（按照正己烷∶乙醚∶甲酸＝40∶1∶1（体积比））饱和的层析缸中进行展开。

当上行展开溶剂前沿距硅胶板上端约2cm处时，将硅胶板取出并晾干[19]。

等展开剂挥发后，将硅胶板放置于染色碘缸中进行染色，确定斑点位置。

每组3次重复。

2结果与分析
2.1菌液浓度的测定结果
微生物生长曲线一般包括迟缓期、对数期、稳定期3个阶段。

从图1可以看出，工程酵母INVSC1与H1246的生长时期有着明显的区别，INVSC1在0～8h处于迟缓期，8～18h处于对数期，18～28h 处于稳定期；H1246在0～12h处于迟缓期，12～22h 处于对数期，22～28h处于稳定期。

由此可知，在相同的生长条件下，工程酵母INVSC1比H1246生长快，先进入对数生长期和稳定期。

此外，从图1还可以看出，工程酵母生长的每个阶段有不同的特点，迟缓期测定的浓度与刚开始时测定浓度一样；对数期菌的生长速度大大加快，单位时间内菌液的浓度增加量保持一致并达到最大值；稳定期测定的菌液浓度增加量最小，基本上为0。

2.2工程酵母INVSC1和H1246菌株的尼罗红染色观察结果
从图2可以看出，通过明场和荧光场的比较，工程酵母INVSC1经过尼罗红染色细胞呈橘红色，内部有明亮的油滴，因为尼罗红会与中性油脂
发生
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山西农业科学2020年第48卷第9期
结合，并且在蓝色激发光下发出荧光。

而H1246经
过尼罗红染色后细胞也呈橘红色，但是内部未见到
油滴。

2.3酵母中性油脂的检测结果
经苏丹黑染色后工程酵母INVSC1与H1246
中性油脂被染成了黑色，苏丹黑附着在油脂上，故吸
光度会提高。

将2种酵母的初始悬浮液OD值都调
至0.4左右，染色后，工程酵母INVSC1的OD580值
明显比H1246高，工程酵母INVSC1的OD580值在
0.9左右，而H1246的OD580值在0.65左右（图3）。

2.4总脂肪酸的测定结果
2.4.1脂肪酸的提取结果由图4可知，工程酵母INVSC1的总脂肪酸含量明显比H1246的高，工程酵母INVSC1的总脂肪酸含量大约在20%左右，而H1246的总脂肪酸含量大约在10%左右。

2.4.2酵母脂肪酸各成分分析从图5、6可以看出，工程酵母INVSC1含有3种不同的脂肪酸，H1246则含有2种不同的脂肪酸，而它们的目的峰分离效果较为明显，基线也比较平稳，没有重叠和拖尾等现象，能够准确判断脂肪酸的类型及其相对含量，它们的出峰时间依次为C16∶0（棕榈酸）、C16∶1（棕榈油酸）、C18∶1（油酸）、C18∶2（亚油酸），每种脂肪酸所对应的峰面积越大，相对浓度越高，含量就越高[20]。

由表1和图7可知，工程酵母INVSC1中棕榈酸和油酸相对含量较高，而棕榈油酸的相对含量非常低，几乎没有，所以，INVSC1中脂肪酸的主要成分是棕榈酸（C16∶0）和油酸（C18∶1），而H1246中棕榈酸（C16∶0）和亚油酸（C18∶2）的含量很少，几乎没有。

2.5薄层色谱分析(TLC)测定结果
由图8可知，工程酵母INVSC1在硅胶板上有明显的TAG，而H1246则没有，即酵母INVSC1能正常合成积累TAG，而H1246则不能。

表1酵母脂肪酸组分分析
成分
C16∶0
C16∶1
C18∶1
C18∶2
INVSC1
0.2103767
0.0003200
0.0766947
H1246
0.0075703
0.0033427
相对含量
/% 1438
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3结论与讨论
本研究通过培养工程酵母并测定其生长曲线，经尼罗红染色、苏丹黑染色、总脂肪酸含量测定、酵母脂肪酸成分分析以及薄层色谱分析等一系列试验，结果表明，在相同的生长条件下，工程酵母IN-VSC1合成的油脂多，H1246基本上不合成油脂，可以比较出正常酵母和缺陷酵母合成和积累油脂的能力，即正常酵母比缺陷酵母产油脂能力强，从而为后期油脂代谢相关基因功能验证等分子生物学试验提供研究材料和研究基础。

阳天泉等[3-4]在研究小桐子磷脂二酰甘油酰基转移酶时，通过工程酵母的互补试验得出，INVSC1能合成积累TAG，而H1246不能，且他在研究烟草二脂酰甘油酰基转移酶基因时，通过TLC层析试验、尼罗红染色、酵母油脂含量试验也得出了这个结论。

谭太龙等[18]通过薄层色谱分析试验研究得出，INVSC1能合成积累TAG，而H1246则不能。

本试验所获得结果和前人的研究结果是一致的。

本研究还表明，工程酵母INVSC1与H1246的脂肪酸成分及含量也各不相同，可以提取不同的脂肪酸应用于分子生物学试验、医疗保健、农药含量检测等方面，为工程酵母INVSC1与H1246的进一步研究奠定研究基础。

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(责任编辑:李素娟
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