细胞周期检验点与肿瘤发生之间关系的研究进展_牟华

在细胞生命活动过程中，多种内外因素（如氧自由基和紫外辐射）都会影响细胞基因组的完整性。

为确保细胞周期这一生命增殖过程有条不紊地进行，细胞内发展了一系列调控机制，以检测和修复DNA损伤、维持细胞遗传稳定性和完整性。

细胞周期检验点就是其中一种重要的调控机制。

所谓周期检验点就是细胞周期不同时相间存在的类似“开关”式的关键调控点，以保证各个细胞周期事件的启动、完成与忠实地按序进行。

在细胞周期检验点中，如果调节蛋白检测到DNA损伤或其他结构异常，细胞会很快启动DNA损伤修复调控体系，抑制细胞周期运转，以提供足够的时间修复损伤，保证细胞遗传的稳定性。

在人类细胞中，检验点功能缺陷引起的遗传不稳定性与细胞癌变密切相关。

一些检验点蛋白突变显著增加了人类患癌症的几率。

因此，深入研究细胞周期检验点将有助于寻找有效的癌症治疗方法。

1细胞周期检验点通路及其调控机制
对细胞周期的研究表明，这些周期检验点可以检测到损伤或结构异常的DNA，启动相应的信号转导途径，引发一系列生物学事件，如阻滞细胞周期和修复受损DNA。

作为蛋白质的网络系统，细胞周期检验点通路包括感受器、转导器和效应器。

感受器［如哺乳动物的毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ataxia telangiectasia mutated，ATM）和ATR（ATM－Rad3－related）］负责检测结构异常的DNA并启动检验点信号；转导器负责将信号转导到相应的效应器。

哺乳动物细胞中，检验点激酶（checkpoint kinase，CHK）CHK1、CHK2分别是ATR与ATM激酶的底物；检验点经过一系列信号转导，最后由效应器引发生物学效应。

这些效应器蛋白包括与DNA复制、转录调控和细胞周期调控有关的蛋白，如BRCA1、CDC25A、CDC25C、p21等。

在哺乳动物细胞中存在G1／S、S和G2／M等一系列细胞周期调控检验点[1－3]。

1．1G1期和G1／S检验点通路及其调控机制
G1期是M期结束后S期开始前的一段间隙。

在此期间，检验点主要监控细胞个体的大小及遗传物质的完整性，一旦检测到基因组结构异常，细胞就会迅速启动修复系统。

在哺乳动物细胞中，p53和pRb是G1期主要的调控蛋白，可以通过ATM（ATR）／CHK1（CHK2）－p53／MDM2－P21通路诱导持续的、有时甚至是永久性的G1期阻滞[4－6]。

这条通路主要包括3条途径，即ATM－p53途径、ATM－CHK2－p53途径和ATR－p53途径。

细胞中出现DNA损伤时，ATM／ATR可以直接磷酸化p53 N端的转录激活结构域，特别是Ser15、Thr18和Ser20[4－8]，激活下游反应元件，阻滞G1期向S期的转换。

另外，ATM／ATR和CHK1／CHK2也可以通过调控MDM2间接增强p53基因的转录活性。

doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．01．032综述细胞周期检验点与肿瘤发生之间关系的研究进展
牟华
山东省科技情报研究所，山东济南250101
［摘要］DNA损伤反应引起的基因组不稳定性并不足以导致肿瘤发生，还需要一些协同突变促进肿瘤的生长或存活，因此，基因组结构不稳定和周期检验点突变失活是肿瘤发生的重要因素。

与正常细胞不同，肿瘤细胞中细胞周期检验点反应缺陷，当肿瘤细胞遭受基因毒药物损伤时，可通过激活周期检验点反应阻滞细胞周期进程，加强损伤修复，导致耐药表型的产生。

因此，寻找特异性的检验点抑制剂来加强化疗药物或辐射对肿瘤细胞的杀伤效应，已成为肿瘤治疗的一个研究方向。

［关键词］细胞周期；检验点；肿瘤
［中图分类号］Q25［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2009)01－0111－03
Progress of Relationship Between Cell－Cycle Checkpoint and Tumorigenesis
MU Hua
Shandong Institute of Scientific and Technical Information,Ji＇nan250101,China
［Abstract］Genomic instability caused by DNA damages is not enough to result in tumorigenesis,and some coordinate mutation is required for tumor growth and survival．Hence,both genomic instability and cell－cycle checkpoint dysfunction are critical factors for tumorigenesis．Different from normal cells,tumor cells always have some checkpoint defects．When suffering genotoxicity,tumor cells can activate cell－cycle checkpoints to block cell－cycle progress,which enhances damage repairing and leads to resistance phenotype．For the reasons above,looking for specific checkpoint inhibitor to intensify tu-mor－cell lethal effects of chemotherapeutics and radiotherapeutics has already been a new trend for tumor therapy re-search．
［Key words］cell－cycle;checkpoint;tumor
［收稿日期］2008－05－20
［作者简介］牟华（1979－），女，（E－mail）muhua．1979＠yahoo．com．cn
已知MDM2是p53的主要拮抗剂，在正常细胞中通过泛素化反应调控p53的降解[9]，维持p53的低活性状态。

一旦发生细胞损伤，ATM／ATR和CHK2／CHK2可以诱导MDM2磷酸化，降低后者对p53的解聚作用，促进细胞内p53蛋白的聚集，增强其转录因子的活性。

CHK1／CHK2还可以活化p53的其他一些序列，使其免受MDM2的降解，维持p53的稳定。

作为重要的肿瘤抑制蛋白，p53可以转录激活p21CIP1／WAF1，一种周期蛋白依赖性蛋白激酶的抑制剂[5－6]，封闭周期蛋白E／CDC2激酶活性，阻滞G1期。

这种阻滞不仅抑制DNA合成的起始，而且使RB／E2F路径处于活性状态，限制细胞生长。

因此，G1期检验点的调控分子是p53和pRb两种蛋白。

如果周期抑制因子p53或转录抑制因子Rb发生突变，将使细胞周期紊乱，并导致肿瘤发生。

除了上述途径，CHK1／CHK2－CDC25A途径也参与G1期检验点通路。

在正常细胞增殖中，ATR／CHK2通过适度磷酸化CDC25A的多个Ser残基位点，维持CDC25A在细胞中的含量。

一旦基因组受到损伤，随着CHK1和CHK2活性的增强，大量CDC25A降解，进一步抑制了周期蛋白E（A）／CDK2复合物的活性[4,9－10]。

而且，CHK2／CHK2－CDC25A途径不依赖p53，不需要新蛋白的转录和积累，反应时间短暂，仅能持续几个小时。

因此，G1期检验点反应包括p53非依赖性和p53依赖性通路，后者需要经过ATM／ATR、p53、p21、GADD45等多种蛋白，消耗时间长，因此是一个在后期起维持作用的慢反应G1期阻滞效应。

1．2S期检验点通路及其调控机制
细胞周期中，S期即为DNA合成期。

S期检验点的生物学功能是检测细胞内存在的DNA损伤并阻断DNA复制的继续进行。

目前已经发现一些参与S期DNA损伤检验点的途径，包括ATM－CHK2－CDC25A和ATM－NBS1－SMC1。

DNA损伤后，ATM可以活化CHK2，激活下游靶分子CDC25A。

CDC25A磷酸化CDK2（CDK2是S期启动和推进的重要分子引擎）的Tyr15，下调CDK2活性，进而阻止CDC45结合到染色体上。

已知，CDC45对DNA聚合酶α结合复制复合体必不可少。

因此，CDK2活性的阻遏阻止了S期启动。

作为ATM的一个直接底物，NBS1也参与S期DNA检验点调控。

IR处理后，ATM可以直接磷酸化NBS1的Ser343、Ser397和Ser615等3个位点[5,8]，这3个位点中的任何一个突变都会导致细胞S期损伤检验点功能丧失。

活化后的NBS1和ATM共同作用，磷酸化SMC1（structure maintenance of chromosome）的Ser957和Ser966。

已发现，以Ala替代这2个位点的SMC1突变体高表达导致细胞丢失S期检验点。

缺少NBS1或SMC1的细胞对辐射高度敏感也可能是由于ATM无法磷酸化SMC1的这2个关键位点。

因此，SMC1在DNA损伤诱导的S期检验点通路中非常重要。

除此以外，S期检验点（特别是复制阻滞激活的复制检验点）另一个重要功能是保持被阻滞的复制叉的完整性，并促进随后DNA复制的恢复[9,11]。

1．3G2／M期检验点及其调控机制
DNA复制结束，细胞周期由S期进入G2期，并准备进行细胞分裂。

当DNA复制尚未完成时，M期激酶的活性不能表现出来。

G2期检验点的功能是阻止带有DNA损伤的细胞进入M期，确保细胞基因组的完整性和稳定性。

这是一个复杂的信号转导网络，涉及多种分子的相互作用，ATM／ATR－CHK2／CHK2－CDC25C－CDC2是主要的转导途径。

哺乳动物细胞正常通过G2／M期需要CDC25C的磷酸酶活性。

这种磷酸酶活性可以介导CDC2的Thr14和Tyr15去磷酸化，进一步活化周期蛋白B／CDC2复合物，直接诱导细胞从G2期进入M期。

在此过程中，CDC25C的作用至关重要。

ATR和ATM则是此检验点的2个关键信号分子，各自经不同的途径控制G2／M 期进程。

在ATR－CHK2－CDC25C途径中，DNA损伤诱导ATR激活CHK2，活化的CHK2随后磷酸化CDC25C的Ser216，使CDC25C 结合14－3－3σ，抑制CDC25C入核与CDC2作用，从而阻滞G2／M周期。

敲除ATR基因的人类体细胞遭受电离辐射后，仍携带损伤DNA错误地进入有丝分裂期。

ATM－CHK2同样也参与G2期检验点。

DNA损伤后，ATM可磷酸化CHK2的Thr68，进而磷酸化CDC25磷酯酶，阻滞G2／M 期转换。

在缺失ATM的细胞中，尽管存在正常的ATR通路，损伤细胞仍可以错误地进入M期，说明ATM－CHK2－CDC25C是一条与ATR－CHK2－CDC25C平行的调控途径，只是在同时表达ATM／ATR的细胞中，ATM－CHK2途径加强了ATR－CHK2途径对周期蛋白B／CDC2的抑制作用。

2细胞周期检验点与肿瘤发生
细胞周期检验点的存在保证了产生具有正常遗传功能和生理功能的子代细胞。

DNA一旦受到损伤，细胞就会迅速通过周期检验点和损伤修复途径，维持基因组的稳定性。

如果DNA损伤反应或有丝分裂检验点发生突变，携带错误基因的细胞就会越过检验点，继续生长增殖，这样大大增加了细胞发生恶性转化的几率。

完全破坏ATR的2个等位基因，小鼠在胚胎期就会死亡[12]，而塞克尔综合征（Seckel syndrome）患者，由于存在少量表达的ATR蛋白，即使丝裂霉素C作用后出现不稳定的基因组，患肿瘤的几率也不会增强[13]。

人类或小鼠细胞缺失ATM极易形成淋巴瘤或其他恶性肿瘤[14]。

ATM的缺失可能诱导细胞发生过量的同源重组，从而诱发肿瘤形成。

作为肿瘤抑制剂，CHK2蛋白不足也会引起检验点功能缺陷，从而诱导肿瘤形成。

小鼠乳腺上皮细胞部分缺失CHK2表现出S期异常，复制过程中DNA损伤累积和M期异常[15]。

研究还发现，CHK2－／－的小鼠并不会自发形成肿瘤，但在致癌物存在的情况下，缺乏CHK2增加了患皮肤癌的几率[16]。

BRCA是重要的肿瘤抑制基因。

BRCA1或BRCA2突变导致乳腺癌和卵巢癌的发生[17]。

虽然BRCA1和BRCA2都参与DNA 损伤反应，但功能各异。

前面已经谈到，BRCA1是ATM、ATR和CHK2激酶作用靶标，在S期和G2／M期检验点反应中发挥重要作用。

BRCA1蛋白还可以定位在DNA断裂处，与染色体重组蛋白相互作用，并参与转录调控[18]。

在缺失p53的情况下，BRCA1部分突变会增加患乳腺癌和淋巴癌的几率。

可能是p53调控的凋亡消除了BRCA1突变无法修复的DNA损伤[19]。

BRCA2可以直接结合RAD51重组酶，并参与S期检验点和同源重组[20]。

已证实，患有范可尼综合征D1的患者存在BRCA2基因的双位点突变[21]。

而且，BRCA1与范可尼D2蛋白在DNA损伤信号通路中相互作用。

携带范可尼A或C基因突变的小鼠虽然出现染色体不稳定性和生殖细胞发育阻滞，但不会自发形成
肿瘤。

与此相反，缺乏范可尼D2基因的小鼠和缺乏BRCA2基因的小鼠可以形成上皮癌，如乳腺癌、卵巢癌和肝癌。

小鼠单个位点BRCA2基因突变并不会增加患肿瘤的几率，一旦发生BRCA2双位点突变，小鼠就会形成胸腺瘤。

进一步的研究表明，当细胞周期检验点失活时，即使发生BRCA2基因突变也不会出现生长阻滞和基因组结构不稳定。

所以，周期检验点基因与BRCA2基因协同作用，促进遗传性乳腺癌和其他基因组不稳定疾病的发生。

除此以外，其他一些成分的突变也会导致肿瘤发生。

小鼠缺乏H2AX或53BP1就会丧失周期检验点功能[22－24]，容易发生肿瘤。

在缺乏p53的情况下，单独的H2AX不足也会导致显著的基因组不稳定并诱发肿瘤。

DNA损伤反应引起的基因组不稳定性并不足以导致肿瘤的发生，还需要一些协同突变促进肿瘤的生长或存活。

Mre11蛋白不足，小鼠基因结构不稳定，但并不易发生恶性转化。

如果同时存在p53单位点突变，则这些小鼠易形成肿瘤。

所以，周期检验点失活和基因组结构不稳定是肿瘤发生的两个重要因素。

3细胞周期检验点通路在肿瘤治疗中的作用
与正常细胞不同，肿瘤细胞中细胞周期检验点反应缺陷。

当肿瘤细胞遭受基因毒药物损伤时，可通过激活周期检验点反应阻滞细胞周期进程，加强损伤修复，导致耐药表型的产生。

因此，寻找特异性的检验点抑制剂来加强化疗药物或辐射对肿瘤细胞的杀伤效应，已成为肿瘤治疗的一个研究方向。

近年来发现一些检验点抑制剂，如咖啡因，可通过抑制细胞周期检验点增强肿瘤细胞对辐射和基因毒药物的敏感性。

研究表明，咖啡因通过ATM 依赖性方式阻断CHK2和p53的磷酸化，进而抑制下游检验点途径的相继活化，使肿瘤细胞更易于被辐射或化疗药物杀灭。

活化的p53蛋白是一种重要的肿瘤抑制蛋白，可以防止有机体细胞发生恶性转化，超过1／2的肿瘤患者体内都发现存在p53功能丧失，其余的肿瘤患者都不同程度表现出p53信号通路缺陷。

由于p53在抑制肿瘤发生中的重要性，科学家设计出多种策略调控肿瘤细胞中的p53，以期最大限度地发挥其对肿瘤细胞的特异杀伤功能。

这些策略分为两类：一类针对携带野生型p53的肿瘤细胞，主要依赖诱导其活性；另一类针对含p53突变体的肿瘤细胞，使p53突变体能恢复正常功能。

另外，还有一种方法是通过p53的上游调控子或下游效应因子间接调控p53信号通路。

将p53从MDM2的抑制中释放出来，是活化p53的一种有效策略。

MDM2和p53形成一种自主调控的反馈途径。

p53促进MDM2表达，后者反过来又通过泛素化p53在细胞核和细胞质中促进p53的降解，阻遏其转录活性。

MDM2完全缺失的小鼠胚胎在子宫时就会死亡，如果同时缺失p53则小鼠存活，这从基因角度证实发育早期就存在MDM2与p53的相互作用。

DNA损伤剂或癌基因突变都会磷酸化p53和MDM2，破坏二者的相互作用，稳定p53，促进其在细胞内的积累并发挥生物学作用。

现在有两种方法可阻挠p53－MDM2相互作用和下调MDM2表达。

一种方法是通过MDM2反义mRNA抑制MDM2表达。

研究人员还设计出一些抑制剂来破坏或阻止二者结合，如一种非肽类MDM2抑制剂syc－7可以诱导野生型p53的积累，活化下游靶基因（p21和MDM2），促进细胞凋亡[25]。

另外，Nutlins、咪唑啉类似物，因为与MDM2的p53结合位点匹配并可相互结合，所以可以破坏二者的相互作用[26]。

细胞中加入Nutlins，MDM2和p21表达增强，抑制细胞周期，并引发凋亡。

另外，CHK2缺失小鼠的研究可使人们尝试设计CHK2的化学抑制剂。

这些药物选择在肿瘤治疗中具有重要的应用前景。

4结语
细胞通过细胞周期检验点保证产生具有正常遗传功能和生理功能的子代细胞，维持基因组的稳定性。

如果DNA损伤反应或有丝分裂检验点发生突变，携带错误基因的细胞就会越过检验点，继续生长增殖，这样大大增加了细胞发生恶性转化的几率。

对细胞周期检验点的深入了解，有助于阐述在肿瘤癌变过程中细胞周期检验点调控失常与癌变的分子机制，并为药物设计和基因治疗提供合理的依据。

现在人们正努力通过研究动物模型和肿瘤高危人群DNA 损伤反应探讨周期检验点各通路的串话、DNA修复和凋亡的发生机制等。

深入了解它们在检验点通路中的作用并综合评价其在肿瘤治疗中的医用价值，分离CHK1和CHK2的小分子抑制剂，并结合传统的放疗和化疗设计新的策略，调节检验点，为改进肿瘤治疗提供了美好的蓝图。

对这些途径的深入研究有利于寻找治疗肿瘤的有效手段，也有利于找到有效抑制肿瘤发生的方法。

除此以外，也为衰老研究提供了新的思路。

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生物技术通讯
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