瘦素减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤

瘦素减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤
韩铭;张金英;宋翠红;梁辰;冯杰;颜光涛
【摘要】目的探讨瘦素对鱼藤酮(rotenone)所诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞凋亡的抑制作用.方法建立鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型,用瘦素进行干预,采用MTT比色法检测细胞存活率,锥虫蓝检测细胞死亡率,细胞形态学观察,并用Western blot法检测Bcl-2、Bax、p-GSK-3 β (Ser9)和GSK-3β的表达水平,免疫荧光检测α-synuclein的表达水平.结果成功建立了鱼藤酮诱导的SH-SY5Y 细胞损伤模型.在模型的基础上,瘦素干预后,细胞状态改善,细胞存活率提高约14％(P＜0.05),细胞死亡率降低约17％(P＜0.05),α-synuclein的浓度下降,Bcl-2和p-GSK-3 β的表达显著提高.结论瘦素对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有明显的抑制作用,可能是通过抑制GSK-3β的活性上调Bcl-2/Bax的比率和降低α-synuclein的表达而得以实现.
【期刊名称】《解放军医学院学报》
【年(卷),期】2014(035)002
【总页数】4页(P170-173)
【关键词】鱼藤酮;SH-SY5Y细胞;瘦素
【作者】韩铭;张金英;宋翠红;梁辰;冯杰;颜光涛
【作者单位】解放军总医院基础所生化室,北京100853;解放军总医院基础所生化室,北京100853;解放军总医院基础所生化室,北京100853;解放军总医院基础所生化室,北京100853;解放军总医院基础所生化室,北京100853;解放军总医院基础所生化室,北京100853
【正文语种】中文
【中图分类】R34
SH-SY5Y细胞系是一种分化程度较低的肿瘤细胞，其细胞形态、生理和生化功能
与正常神经细胞相似，并具有许多多巴胺能神经元的特点，可以合成多巴胺和去甲肾上腺素的能力和表达多巴胺转运蛋白。

因此，SH-SY5Y细胞近年来被用来作为
帕金森病研究的神经元模型[1]。

鱼藤酮是一种广泛使用且被认为“安全可靠”的农药，在蔬菜和鱼中会有少量残留，现发现鱼藤酮是帕金森病的一种危险因素，被认为是一种人类容易少量长期接触的环境毒素[2]。

α-突触核蛋白(α-synuclein)是路易小体的重要组成部分，其过表达和错误折叠与帕金森病相关。

而鱼藤酮能导致α-synuclein的表达增多，并最终
聚集，而能很好地模拟帕金森病模型[3]。

因此鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞通常作为帕金森病的细胞模型。

糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK-3β)作为一种调控
糖原代谢的主要激酶，可使多种底物蛋白磷酸化，最近研究表明，GSK-3β与帕金森病发生密切相关[4]。

瘦素主要由白色脂肪组织分泌，通过下丘脑来调节新陈代谢、摄食、能量平衡等生理活动。

Vannucci等研究发现db/db小鼠与正常小鼠
比较大脑体积明显缩小，并伴有神经元密度减低和功能下降，提示瘦素可能参与神经系统生理活动[5]。

本实验建立鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞模型，采用瘦素保护该模型，拟初步阐明瘦素减轻鱼藤酮诱导的多巴胺能神经细胞损伤的机制。

1 材料人神经纤维母细胞瘤细胞系SHSY5Y(本实验室保藏)；DMEM培养基、胎
牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibico公司)；二甲基亚砜(DMSO)，鱼藤酮(rotenone)、MTT、锥虫蓝(sigma公司)；人重组瘦素(peprotech公司)；一抗：α-synuclein、Bax抗体(Epitomics公司)，Bcl-2、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)抗体(Cell
Signaling Technology公司)、β-actin抗体(Santa Cruz公司)；二抗：山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶(北京中杉金桥公司)、山羊抗兔IgG/Cy3标记(武汉博士德生
物工程公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)(北京益利精细化学品公司)；Western blot超敏发光液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术公司)。

2 MTT检测鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞的存活率将SH-SY5Y细胞(6×104个
/ml)200 μl接种于96孔板，每组设12个平行孔，培养24 h后加入鱼藤酮，使
终浓度达到0、0.005、0.05、0.5、5 μmol/L，继续培养24 h，其中0组为对照组(鱼藤酮用DMSO溶解，DMSO终浓度为0.1%)。

然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h，每孔加入150 μl DMSO，继续培养直至紫色化合物全部溶解，振荡器上振荡10 min后，酶标仪570 nm，对比波长650 nm，测定吸光值，其值相对于对照组的比值，其中每组第1组均为对照组。

3 细胞形态学观察培养SH-SY5Y细胞丰度达到60%，加入5 μmol/L鱼藤酮诱导2
4 h，建立模型。

在鱼藤酮诱导前2 h，加入瘦素于培养基中，终浓度为2 μg/ml，对SH-SY5Y细胞进行预保护(后续试验，瘦素预处理和模型建立均采用此法)。

置
于倒置显微镜下观察，200×倍数下拍照。

4 MTT法检测瘦素对于鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞活性的影响将SH-SY5Y细胞(6×104个/ml)200 μl接种于96孔板，每组设12个平行孔，共3组，培养24 h 后其中一组加入瘦素，终浓度为2 μg/ml，2 h后瘦素组和另外一组加入终浓度为
5 μmol/L的鱼藤酮，剩下的一组加入DMSO(鱼藤酮用DMSO溶解，DMSO终
浓度为0.1%)。

然后按照方法2的MTT检测。

5 锥虫蓝法检测瘦素对于鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞死亡的影响以2×105个/孔种将对数生长期的SH-SY5Y细胞种于24孔板中，设8个平行孔，待瘦素预处理和
模型建立之后，消化并制备单细胞悬液，适当稀释后，将细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混合混匀(终浓度0.04%)。

在3 min内，分别计数活细胞和死细胞。

镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。

细胞死亡率(%)=死细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

6 免疫荧光检测α-synuclein的表达水平以2× 105个/孔的密度接种SH-SY5Y
细胞于Confocal专用小皿中，待瘦素预处理和模型建立(同方法3)之后，50%的
羊血清封闭1 h，加入α-synuclein的一抗过夜，PBS洗3遍，每次5 min，然后加入Cy3标记的二抗孵育，PBS再洗3遍，每次5 min，置于荧光显微镜下观察，100×倍数下拍照，成红色荧光。

7 Western blot检测Bcl-2、Bax和GSK-3β磷酸化的表达水平采用Western blot法，将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞以1×106个/孔种于6孔板中，待完全贴壁后，用不同浓度的鱼藤酮(0，0.005，0.05，0.5，5 μmol/L)处理(其中0组为对照组)，继续培养24 h。

然后收集细胞，用RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法蛋白定量。

蛋白上样量为50 μg，在质量分数为10%的SDSPAGE上进行垂直电泳，然后电转移到PVDF膜上(100 V，110 min)，5%脱脂奶粉(TBST溶解，下同)封闭1 h，然后一抗，Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、β-actin(1∶500)、p-GSK-3β(Ser9)(1∶1 000)和GSK-3β(1∶1 000)。

-4℃封闭过夜，TBST漂洗膜
3次，每次10 min，然后二抗(1∶4 000)，37℃孵育40 min，TBST漂洗3次，每次10 min，最后曝光显影。

扫描后，使用Image Plus 6.0软件，分析其灰度值，3次独立实验求平均值。

同理，待细胞贴壁后，进行瘦素预处理和模型建立(同方
法3)，但瘦素预处理的终浓度有两种，分别为0.5 μg/ml和2 μg/ml，然后继续
培养24 h，然后Western blot和分析。

8 统计学方法采用Stata 7.0软件统计进行统计学分析，数据以±s表示，组间比
较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1 鱼藤酮对SH-SY5Y细胞的存活率影响 MTT法检测SH-SY5Y细胞存活率显示，鱼藤酮的浓度在0.5 μmol/L，5 μmol/L时，细胞存活率在60%以下，差异有统
计学意义(aP＜0.05)(图1)。

后续模型的建立采用5 μmol/L鱼藤酮进行诱导，存
活率仅46%。

2 瘦素对于鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞形态的影响细胞形态学观察(200×下观察)，正常SH-SY5Y细胞在接种贴壁后呈梭形状(图2A)，5 μmol/L模型组细胞梭形减少，圆形皱缩变多(图2B)，在5 μmol/L鱼藤酮诱导之前加入2 μg/ml瘦素组(图
2C)，其细胞相对于不加瘦素组，细胞状态有所改善，梭形细胞增多。

3 瘦素预处理后对于鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞存活率和死亡率的影响 MTT法检
测SH-SY5Y细胞存活率，锥虫蓝检测SH-SY5Y死亡率，显示2 μg/ml瘦素可以提高5 μmol/L的鱼藤酮诱导的SH-SY5Y的存活率约14%(图3A)，降低死亡率约17%(图3B)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

4 瘦素降低了鱼藤酮诱导的α-synuclein表达免疫荧光检测结果显示，正常组SH-SY5Y细胞α-synuclein的荧光强度较弱(图4A)，在模型建立之后，模型组的α-synuclein的荧光强度(图4B)明显增强，表明鱼藤酮促进了该蛋白的表达，而加入瘦素组(图4C)其荧光强度又有所下降，表明瘦素降低了鱼藤酮引起的α-synuclein 的表达。

5 瘦素预处理后Bcl-2、Bax和GSK-3β磷酸化表达变化Western blot结果显示，随着诱导SHSY5Y细胞的鱼藤酮浓度的增加，Bcl-2和p-GSK-3β(Ser9)的表达显著降低(图5A)。

0.5 μg/ml和2 μg/ml的瘦素对PD模型组(5 μmol/L鱼藤酮诱导)的Bcl-2和p-GSK-3β(Ser9)的表达显著增加(图5B)。

其中图5A和图5B中第
1组均为对照组，图5B中第2组为模型组。

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种以黑质纹状体通路的退变为主要特征
的神经系统变性疾病。

帕金森患者的大脑黑质区有路易小体的出现，并伴随多巴胺能神经元的进行性变性缺失[6]。

治疗帕金森病的经典药物是左旋多巴，但长期应
用后会导致恶心、低血压、精神症状等不良反应，对慢性帕金森病患者基本失去治
疗作用。

鉴于此，很有必要探索其他药物治疗帕金森病[7]。

目前，人们对帕金森病发病机制仍未明确，但越来越多的研究表明选择性多巴胺神经元损伤和丧失与神经元凋亡密切相关，出现帕金森病症状的患者其脑内多巴胺能细胞80%以上发生凋亡[8]。

Tang等[9]研究认为各种病因可经由细胞凋亡这一条
共同路径而导致帕金森病发病，凋亡是导致帕金森病神经元变性的基础。

鱼藤酮可以直接通过血脑屏障抑制脑组织的线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，而多巴胺神经元又对能量障碍特别敏感，因此低剂量的鱼藤酮在不影响其他部位线粒体功能的情况下，可引起多巴胺神经元的凋亡[2]。

瘦素是一种潜在的神经保护因子，在神经退行性疾病中有着一定的治疗作用[10-11]，能防止黑质细胞损伤，对小鼠帕金森病的发病有一定的预防和治疗作用[12]。

抗凋亡蛋白Bcl-2可与促凋亡蛋白Bax拮抗，抑制细胞色素C自线粒体释放至胞质，进而抑制凋亡，Bcl-2和Bax比值(Bcl-2/Bax)能提示是否发生凋亡[13]。

在帕金森病研究模型中，GSK-3β活性增高，诱导多巴胺能神经元凋亡，而GSK-3β活性被抑制时，α-突触核蛋白表达降低，神经元的凋亡降低，神经元得到保护，其
中p-GSK-3β(Ser9)是GSK-3β的活性抑制形式[14-16]。

在本研究中，鱼藤酮能够诱导SH-SY5Y细胞损伤，降低细胞存活率，提高死亡率，抑制了Bcl-2的表达和GSK-3β的磷酸化，促进了Bax的表达。

模型建立后，通
过瘦素的干预，探索了瘦素在帕金森病中的神经保护作用，实验显示与模型组相比，瘦素的干预抑制了SH-SY5Y细胞的死亡，提高了存活率，对细胞的状态有了一定的改善，α-synuclein的荧光强度有所下降，p-GSK-3β(Ser9)和Bcl-2的水平显
著增加，上调了Bcl-2/Bax，降低了GSK-3β的活性。

因此瘦素使p-GSK-
3β(Ser9)的水平显著增加，抑制其活性，进而促进了Bcl-2/Bax的比值，并降低了α-synuclein的表达，这可能是瘦素保护的基础。

这些结果进一步证实了瘦素可能对帕金森病有一定的治疗作用，为临床用于帕金森病防治提供了实验依据。

然而，
瘦素对于帕金森病中神经保护作用的具体机制，还有待于进一步深入研究。

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