8 高等植物基因工

• 图 T-DNA 从农杆菌的Ti 质粒转移到植物细胞中，接着TDNA 整合到细胞核基因组中进行表达，对宿主细胞进行 遗传转化。
Ti质粒诱导植物生瘤的机理
• 图8-3
• 1、信号分子的激活作用，virD基因编 码的一种核酸内切酶, • 2、先在T-DNA的RB序列中的第3和第4 碱基之间切开一个单链缺口,
• 由根瘤土壤杆菌的染色体基因组编码的，其表达产物的功能是使细菌 细胞结合到感染植物的创伤部位。
8.2 高等植物的基因转移系统
• Ti质粒简介（tumor-inducing）
• 1、一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子，约200-800kb
• 2、存在于根瘤土壤杆菌细胞中
• 3、它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。Ti是英文肿 瘤诱发的缩略式。
Ti质粒的分子结构－－Vir区结构
• virD基因
• 编码一种核酸内切酶，先在T-DNA的RB序列中的第3和第4 碱基之间切开一个单链缺口，随后在T-DNA同一条链的LB
序列中切出第二个单链缺口。于是T-DNA便以单链形式释 放出来，并在RB序列的引导下定向地从根瘤土壤杆菌细胞 转移到寄主植物细胞。这条转移的单链T-DNA特称为T-链。
物细胞核中，占Ti质粒DNA总长度的10％左右，
在T-DNA上的基因控制的。
Ti质粒有可能用作植物基因克隆 的载体
图 在Ti 质粒的两端，T-DNA 有两个几乎完全相同的25bp 的重复。右端重复对于TDNA 的转移和整合是必需的。T-DNA 与植物基因组中的右接口拼接相当精确，右边接 口保留有1-2bp 的右端重复，但左边接口处序列变化较大，有大约100bp 以内的序列来
8.2 高等植物的基因转移系统－Ti质粒
• 诱发冠瘿瘤的有三种遗传成分。 • 1 T-DNA， • Ti质粒基因组中被转移并整合到寄主植物细胞染色体上去的特定DNA 片段，一种移位单元。
• 2 vir基因
• 位于Ti质粒DNA上，其编码产物为反式作用蛋白质，是植物细胞转化 的必要因子。
• 3 间接参与植物细胞转化的基因
Ti质粒的分子结构－－T-DNA结构
• T-DNA结构特征（图8-2）
• 1、 T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(分别称为左边界序列和右边界序列).
• 2、T-DNA中间携带的一些与激素合成有关的致瘤基因. • 3、T-DNA的右端序列对T-DNA转移到植物细胞内具有重要意义.保留TDNA两端的末端序列,然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA 的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去,从而导致转化的植物细 胞不具有成瘤能力.
Ti质粒的分子结构－－Vir区结构
• virB、virC、virD和vrE基因 • 在转录水平上的表达，是受由植物创伤细胞分泌产生的酚类物质 的 正调节，它可激活T-DNA发生从细菌至植物细胞的定向转移。
• virA和virG
• 属组成型表达的基因，它们控制着其它vir基因的表达活性。VirA蛋 白质跨越根瘤土壤杆菌细胞内膜，作为酚类及单糖类信号分子的受体。 由VirA蛋白质检测到的信号，被传递到VirG蛋白质，它可激活其它的 vir基因进行转录。
• 图 Ti 质粒的毒区(vir region) 六个座位上的基
因负责将T-DNA 转移到受感染植物中。
Ti质粒的分子结构－－Con区和Ori区结构
• Con区(regions encoding conjugations)
该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因(tra),调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移.
•冠瘿碱种类不同 :瘴内碱型(octopine,),胭脂碱型(nopaline),农杆碱型 (agropine），每种Ti质粒只有一套tmt基因组
T-DNA，即转移DNA 是整合在植物细胞核基因组上的、决定植物
形成冠瘿瘤的一段DNA片段。它只存在于植
而且已知植物冠瘿瘤细胞中冠瘿碱的合成和 不依赖于植物激素的生长能力，都是由编码
• 与植物感染和致瘤有关的元件
• T-DNA区和毒性区
Ti质粒分成三种类型
根据其诱导的植物冠瘿瘤中
所合成的冠瘿碱种类不同 : 瘴内碱型(octopine,), 胭脂碱型(nopaline), 农杆碱型(agropine）
图 示：携带胭脂碱型Ti 质粒的农杆菌诱导 植物产生肿瘤的情形，而且图中的分化组织 已经开始发育。
T-DNA转移的机制特点
• T-DNA瞄准整合的位点没有序列特异性.
• 3、随后在T-DNA同一条链的LB序列中 切出第二个单链缺口.
• 图17.25 由VirAVirG 组成的双组 分系统通过激活 靶基因的转录来 应答酚信号。
Ti质粒诱导植物生瘤的机理
• 4、T-DNA便以单链形式 释放出来,并在RB序列 的引导下定向地从根瘤 土壤杆菌细胞转移接合 到寄主植物细胞.
• T-DNA区(transferred-DNA regions) • 毒性区 (Vir-region, vir)
• 质粒复制起点 (Origin of replication, ori)
• 质粒结合转移位点 (Transfer function site, tra) • 冠瘿碱分解位点 (ocs or nos)
Ti质粒的分子结构－－Vir区结构
• Vir区中各个位点的表达情况
• VirA • 在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平; • VirB,VirC,VirD和VirE • 在土壤农杆菌感染植物受伤组织时,植物细胞分泌的信号 分子作用下才能启动表达.
图 乙酰丁香酮(4-乙酰基-2,6-二甲氧苯酚) 由烟草产生，诱导农杆菌的T-DNA
Ti质粒的分子结构－－Vir区结构
• 单链的T-DNA 植物细胞酶体系 植物细胞------合成出互补 能形成双链形式的T-DNA分子。
• virE2基因
• 编码的VirE2蛋白质是一种单链DNA结合蛋白，以共价的方 式与经过加工了的T-DNA分子的5’-末端结合，保护其免受
核酸酶的降解作用，并定向地将此T-DNA导入植物细胞核 内，最终整合到染色体基因组上。
• Ori区(origin of replication)
该区段基因调控Ti质粒的自我复制,故称之为复制起始区.
Figure 2. Simplified representation of the major regions of the Ti plasmid of A. tumefaciens. The T-DNA, when inserted into the chromosomal DNA of the host plant, directs the synthesis of nopaline, which is then utilized by the bacterium for its own purposes. T-DNA also directs the plant cell to divide in an uncontrolled manner, producing a tumor.
8.2 高等植物的基因转移系统－Ti质粒
肿瘤？？？
1958年，A.C.Braun 提出了植物肿瘤诱导因子说，用以解释冠瘿病诱导的机理，而且还推测这种因子可能是 一种染色体外的遗传成分。 1974年，I.Zaenen 实验证明，这种因子实质上是一种存在于根瘤土壤杆菌细胞中的巨大的致瘤质粒，土壤 杆菌的致瘤能力正是由于这种质粒的存在所造成的。
Ti质粒的分子遗传学特性
• Ti质粒分成三种类型
• 根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同 :瘴内碱型 (octopine,),胭脂碱型(nopaline),有元件
• T-DNA区,毒性区,质粒复制起点,质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点
Ti质粒诱导植物生瘤的机理
• 5、植物细胞酶体系的催 化作用，合成出互补链形 成双链形式的T-DNA分子 • 6、在一系列酶的参与下
整合进植物基因组
Figure 1. In the process of causing crown gall disease, the bacterium
Agrobacterium tumefaciens inserts a part of its Ti plasmid—a region called TDNA—into a chromosome of the host plant.
•
思考：设计出具有非致瘤性的所谓卸甲载体(disarmed vector)?
Ti质粒的分子结构－－Vir区结构
• Vir区结构与功能（图8-2）
结构
• 总长约35kb,由7个互补群组成,分别命名为
VirA,VirB,VirC,VirD,VirE,VirG和VirH.
• 功能
• 1、促使T-DNA从细菌转移到植物细胞, • 2、使农杆菌表现出毒性。
8
高等植物基因工程
生命科学院 生物系 高 国 辉
转基因番茄
转基因棉花
转基因甜椒
受体：甜椒 供体：抗病毒基因 意义：在栽培的过程中， 容易受病毒感染的甜椒 产量提高。
• ８.２本节重点与难点内容
• 重点
• 高等植物的生物介导转移系统
• 难点
• 1 野生型Ti质粒的分子结构※ • 2 Ti质粒T-DNA和VIR区结构与功能的相关性 • 3 Ti质粒诱导生瘤的机理 • 4 二元载体的构建 • 5 植物病毒介导的转染系统
Ti质粒的分子遗传学特性
除了能够诱发植物产生冠瘿瘤之外，还具有多方面的功能： • • • ①为其寄主根瘤土壤杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； ②参与寄主细胞制造植物激素吲哚乙酸(IAA)和一些细胞分裂素的活动； ③决定所诱导的肿瘤之形态学特征和冠瘿碱的成分；
•
• • •
④赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力；
图 胭脂碱型Ti 质粒和农杆碱型Ti 质粒携带各种基因，这两个质粒都包含基因功 能有重叠的T 区。
Ti质粒的分子结构－－T-DNA结构
• T-DNA结构特征（图8-2）
LB、RB
一段25bp的重复序列
编码合成植物生长素的酶系
tms
三套基因 T-DNA
tmr
编码合成植物分裂素的酶系
tmt
编码催化合成植物生物碱的酶系
⑤赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性； ⑥决定寄主菌株的植物寄主范围； ⑦有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体的生长与发育，即具有 对噬菌体的“排外性”。控制冠瘿碱的新陈代谢是Ti质粒最显著的功能特性 之一。Ti质粒还编码有控制接合转移的基因。
Structure of Ti-plasmid
8.2 高等植物的基因转移系统－Ti质粒
农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
植 物 伤 口
毛状根
冠瘿瘤
细菌内的一个额外染色体,即质粒(plasmid) 称Ti质粒
细菌内的一个额外染色体,即质粒(plasmid) 称Ri质粒
※Ti和Ri质粒可以将外源的DNA转移到植物细胞,并再生出能够表达外源基因的转基 因植物.
转 基 因 牵 牛 花
用转基因 技术改变 矮牵牛花 的花色， 使矮牵牛 花的花色 更加丰富 多彩。
8.2 高等植物的基因转移系统
• 植物基因转移系统功能
• 1 将外源基因导入到植物细胞中并 整合到宿主细胞的基因组DNA上;
• 2 能提供被寄主细胞的复制和转录 系统所识别的启动子和复制子起始 位点,以保证转化的外源基因能在 植物细胞中进行复制和表达.
Ti质粒诱导植物生瘤的机理
三个元件图8-3
• 1、T-DNA • 2、vir区 感染植物细胞并进入 促进植物细胞的转化
•当Vir基因与T-DNA分别位于两个不 同的复制子上时,即Vir区与T-DNA区 分割开来以后, Vir基因仍然能够 为T-DNA提供转移功能
• 3、农杆菌染色体上的基因
促使细菌接近植物细胞
转基因玉米
玉米，人们称它是含金的植物。如今培育 出转基因玉米，品质更好，产量更高。
转基因烟草
时间：1983
受体：烟草
供体：抗生素药类抗体 意义：世界上 第一种基因移 植作物
8.2 高等植物的三大类基因转移系统
• 质粒整合：Ti质粒※
• 病毒感染：花椰菜花斑病毒 （CaMV)
• 物理转移：ＤＮＡ显微注射、 激光微束穿刺法等