白藜芦醇对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用

白藜芦醇对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用
代阅;曹念
【摘要】Objective:To investigate the protective effect and mechanism of resveratrol on lung ischemia-reperfusion injury in rats.Method:Thirty SD rats were randomly divided into sham operation group (Sham),ischemia reperfusion injury group (IRI) and resveratrol (RSV) group.The model of lung IRI was established by ligating the right hilum in IRI group and RSV group.RSV group was given intraperitoneal injection of resveratrol at 30 min before operation,Sham and IRI groups were injected intraperitoneally with normal saline at the same time.Arterial blood was taken to detect the partial pressure of carbon dioxide (PaCO2) and oxygen partial (PaO2) after 6 h of ischemia and reperfusion.The physical method was used to detect lung wet to dry ratio (W/D);PAS staining was used to detect the pathological morphology of lung tissue;In addition,TUNEL method was used to detect the apoptosis of lung cells and Western blotting was used to detect the expression of silent information regulator 1 (SIRT1),p53,acetyl p53,p21,Bax and BCL-2.Results:Compared with IRI group,resveratrol could significantly increase PaO2 and the expression of SIRT1,BCL-2,but significantly reduced PaCO2,W/D ratio of lung tissue and the expression of Acetyl p53,p21,Bax,and alleviated pathological injury of lung tissue and apoptosis.In addition,no influence was detected on the expression of
p53.Conclusion:Resveratrol can attenuate lung ischemia-reperfusion injury by anti-apoptosis,and its mechanism is related to regulating SIRT1/p53
signaling pathway.%目的:探讨白藜芦醇(RSV)对大鼠肺缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用及机制.方法:将30只SD大鼠随机均分为假手术组(Sham组)、IRI组和RSV组,IRI组和RSV组大鼠通过结扎大鼠右侧肺门建立大鼠IRI模型,Sham组大鼠仅做手术、不结扎右侧肺门,RSV组造模前30 min给予RSV腹腔注射、Sham 和IRI组同时给予等量生理盐水腹腔注射;IRI组和RSV组大鼠于缺血再灌注6h后(Sham组于相应时间)取动脉血检测二氧化碳分压(PaCO2)和氧分压(PaO2),同时取肺组织,利用物理法检测肺组织湿干质量之比(W/D),过碘酸雪夫染色(PAS)检测肺组织病理形态,TUNEL法检测肺脏细胞凋亡,Western blotting检测肺组织沉默信息调节因子1(SIRT1)、p53、乙酰化p53(Acetyl 53)、p21、Bax和BCL-2的表达.结果:与IRI组相比,RSV可降低肺组织W/D,上调PaO2、下调PaCO2,减轻肺组织病理损伤及细胞凋亡,显著增加肺组织SIRT1和BCL-2的表达,但明显减少Acetyl p53、p21及Bax表达,对p53表达无影响.结论:RSV可通过抗凋亡作用减轻肺IRI,其作用机制与调节SIRT1/p53信号通路相关.
【期刊名称】《贵阳医学院学报》
【年(卷),期】2018(043)002
【总页数】5页(P174-178)
【关键词】白藜芦醇;肺;缺血再灌注;凋亡;信号转导;大鼠,Sprague-Dawley
【作者】代阅;曹念
【作者单位】三峡大学第三临床医学院葛洲坝集团中心医院呼吸科,湖北宜昌443000;三峡大学第三临床医学院葛洲坝集团中心医院呼吸科,湖北宜昌443000【正文语种】中文
【中图分类】R563
白藜芦醇(resveratrol，RSV)是从葡萄、花生和虎杖等植物中提取的一种非黄酮酚类化合物，具有抗凋亡、抗肿瘤、降血糖以及调节氧化应激等生物学作用，亦是迄今为止发现的最强的沉默信息调节因子1(SIRT1)激动剂［1－3］。

既往研究提示
激活SIRT1可通过抗凋亡等作用减轻脑及肝脏等器官缺血再灌注损伤［4－5］，
但对肺缺血再灌注损伤(Lung ischemia reperfusion injury，IRI)的研究报道甚少，本研究探讨SIRT1激动剂白藜芦醇对IRI的保护作用及其与凋亡信号通路的关系。

1 材料与方法
1.1 试剂仪器
RSV(Sigma，USA)、水合氯醛(武汉谷歌)、TUNEL试剂盒(武汉谷歌生物)，Acetylp53(CST，USA)，p53(CST，USA)，Bax(CST，USA)，BCL-2(CST，USA)，SIRT1(CST，USA)，HE 试剂由三峡大学病理实验室配制。

超速离心机(上
海弗鲁克流体机械制造有限公司)，751G-可见紫外分光光度计(上海分析仪器厂)，IX71光学显微镜(日本奥林巴斯光学工业株式会社)，RT-PCR仪(上海伯乐生命有
限公司)。

1.2 方法
雄性SD大鼠30只，体质量(220±20)g，合格证号SCXK(京)2013－2017，由华福康实验动物中心提供，适应性喂养1周后按体质量随机均分为假手术组(Sham 组)、IRI组和RSV组。

IRI组和RSV组行IRI手术:腹腔注射10%水合氯醛(4
mL/kg)麻醉后大鼠仰卧位固定，行气管插管、接动物呼吸机行机械通气，经胸骨
右缘第3～5肋间开胸，分离剪断右肺下韧带;右侧肺门下穿手术线，于呼气末结扎右侧肺门(右主支气管，右肺动、静脉)、45 min后开放，再灌注6 h后收集动脉
血用于血气分析，并参考文献［6］取肺组织用于后续研究;Sham组仅穿手术线，
不结扎肺门;RSV组术前30 min给予RSV(10mg/kg)［7］，Sham 组和 IRI 组术前 30 min给予等量生理盐水腹腔注射。

1.3 观察指标
1．3．1 血气分析将收集到的动脉血立即送医院检验科利用全自动血气分析仪检测二氧化碳分压(PaCO2)和氧分压(PaO2)。

1．3．2 肺组织组织学观察和湿干重比例(W/D)IRI组和RSV组大鼠于缺血再灌注6 h后(Sham组于相应时间)取肺组织，肉眼观察肺脏颜色，有无出血点及肺组织弹性等;取部分右肺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋、切片，PAS染色，光镜下观察肺组织组织学变化，形态评分标准参考文献［8］;取1 g右肺于分析天平称重为湿质量(W)，放置于70℃恒温干燥箱中烤48 h后称重为干质量(D)，计算 W/D。

1．3．3 肺组织凋亡细胞采用TUNEL法检测肺组织凋亡细胞。

取出肺组织后常规固定脱水包埋切片，染色步按照试剂盒说明书进行操作。

光学显微镜摄片，以细胞核出现明亮的绿色为阳性，随机选取5个视野计数TUNEL染色阳性细胞数。

1．3．4 肺组织 SIRT1、p53、Acetyl 53、p21、Bax 和BCL-2蛋白表达取肺组织匀浆离心处理后取上清液，使用BCA方法测定蛋白量，取约75 μg进行
12%SDS-PAGE 电泳，转膜，加入SIRT1(1∶1 000)、Acetylp53(1∶500)、
p53(1∶500)、Bax(1∶400)、BCL-2(1∶500)和β-actin(1∶4 000)一抗后孵育过夜，洗膜，加入HRP标记的二抗进行反应，洗膜，用化学发光法进行显色，分析灰度值，计算各目标蛋白与β-actin的灰度比值。

1.4 统计学方法
采用SPSS 12．0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析，多个样本之间的两两比较采用t检验。

P ＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 肺组织学观察
Sham组肺泡结构清晰，上皮结构完整，间质和肺泡腔内未见明显液体渗出和炎症细胞侵润;IRI组肺组织严重受损，肺泡结构紊乱、变形，上皮细胞变性、坏死、脱落，间质水肿，肺泡内有大量的液体渗出，有较多的炎症细胞浸润，肺泡内可见较多的红细胞;RSV组与IRI组相比，肺泡结构相对完整，间质轻度水肿，肺泡内的
液体、炎症细胞、红细胞明显减少;各组大鼠肺组织学结果及损伤评分如图1所示，提示RSV预处理可减轻肺组织病理损伤。

图1 各组大鼠肺组织学表现及损伤评分(PAS，×200)Fig．1 Lung histology and injury score in rats of each group
2.2 动脉血气分析
与Sham组相比，IRI组PaCO2明显增高(p＜0．05)，而PaO2明显降低(P ＜0．05);RSV 组与IRI组相比，PaCO2明显降低(P ＜0．05)，而 PaO2明显增高(P ＜0．05) ，见图2。

2.3 肺组织凋亡细胞
与Sham组相比，IRI组细胞凋亡明显增加，差异具有统计学意义(p＜0．05);RSV 组与IRI组相比，细胞凋亡明显减少，差异具有统计学意义(p＜0．05)，见图3。

2.4 肺组织 SIRT1、Acetylp53、p53、p21、Bax 及BCL-2蛋白表达
与Sham组相比，IRI组 SIRT1、BCL-2蛋白达水平明显降低 (p＜
0．05);Acetylp53、p21及 Bax蛋白表达水平均明显增高 (p＜0．05)，但p53
蛋白表达差异无统计学意义(P＞0．05)。

RSV组与IRI组相比，SIRT1蛋白表达水平明显增高 (p＜0．05);而Acetylp53、p21及Bax蛋白表达水平均明显降低 (p
＜0．05)，但p53蛋白表达差异无统计学意义(P ＞0．05)，见图4、图5。

2.5 肺组织W/D
与Sham组相比，IRI组W/D明显增高，差异有统计学意义 (p＜0．05);RSV组
W/D较IRI组明显降低，差异有统计学意义 (p＜0．05)，见图6。

图2 各组大鼠PaCO2和PaO2Fig．2 PaCO2and PaO2of rats in each group 3 讨论
IRI的病理机制非常复杂，目前尚未完全阐明［9－13］。

最近大量研究显示凋亡在IRI中扮演重要角色。

在肺脏血供中断的早期，肺细胞凋亡反应已经开始启动，恢复肺脏血供可进一步加重肺脏细胞凋亡［14－15］。

因此抑制肺脏细胞凋亡可缓解肺脏损伤，减轻肺组织水肿和肺组织病理结构的改变，并可改善肺的呼吸功能和减缓呼吸衰竭的进展［16］。

白藜芦醇具有抗凋亡的活性，并可通过抗凋亡作用减轻肾和心脏等器官缺血再灌注损伤［16－17］，但对IRI的的作用及机制尚不清。

本研究结果显示IRI可引发肺组织严重病理损伤和水肿，还可导致动脉氧分压下降和二氧化碳潴留。

这与既往研究提示缺血性肺损伤可诱发急性肺水肿和呼吸功能受阻乃至衰竭相一致。

而SIRT1激动剂RSV干预可明显减少肺组织病理损伤和水肿，并可提高动脉氧分压和减少二氧化碳潴留，改善呼吸功能以及延缓呼吸衰竭的发生发展，但其保护作用的具体作用机制不明。

图3 各组大鼠肺组织细胞凋亡Fig．3 Apoptosis of lung tissue of rats in each group
图4 各组大鼠肺组织SIRT1，Acetylp53，p53和p21蛋白表达(Western blotting)Fig．4 SIRT1，Acetyl p53，p53 and p21 protein expression of lung tissue of rats in each group
图5 各组大鼠肺组织Bax和BCL-2蛋白表达(Western blotting)Fig．5 Bax and BCL-2 protein expression of lung tissue of rats in each group
图6 各组大鼠肺组织W/DFig．6 W/D of lung tissue of rats in each group
因肺细胞凋亡是缺血性肺损伤的重要致病机制［18－19］。

在本研究中，分别利用 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达和TUNEL法检测细胞凋亡。

TUNEL
是目前广泛应用的细胞凋亡检测方法，其表达的阳性细胞数广泛被视为凋亡细胞。

结果显示，在IRI组，促凋亡蛋白Bax表达水平和细胞凋亡均明显增加，而抗凋亡蛋白BCL-2表达水平明显下降，这与既往研究显示缺血性肺损伤可诱发肺细胞凋亡相一致［18－19］。

而 RSV干预可明显减少Bax表达和细胞凋亡，但可明显增加BCL-2的表达，上述实验结果提示RSV减轻IRI与抗凋亡作用相关，但其抗凋亡的途径尚不清楚。

RSV是目前所知的沉默信息调节因子1(SIRT1)的最强激动剂［5－6］。

而 SIRT1 可乙酰化修饰p65和p53等蛋白激酶［19－20］。

既往有多种显示p53可介导线粒体凋亡信号途径［11］。

p21是p53激活的定向靶向基因等［18－20］。

结果显示IRI可减少SIRT1的表达，增加acetylp53和p21的表达，但对p53表达无影响，这与既往研究提示IRI可激活p53介导的凋亡信号途径相关［19］。

而RSV干预可明显增加SIRT1的表达，减少acetylp53和p21的表达，但对p53表达依然无影响。

因此，实验结果提示RSV在IRI抑制凋亡信号途径的激活与调节SIRT1/p53信号途径相关。

综上所述。

RSV对IRI具有保护作用，其作用机制与激活SIRT1，抑制p53介导的线粒体凋亡信号途径相关，但是否还有其他途径，尚需进一步研究。

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