灵芝多糖的含量测定方法探讨及改进_杨瑞瑞
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表 1 不同硫酸浓度对蒽酮的溶解情况
硫酸浓度 (%) 80
85
90
95
98
蒽酮溶解情况
稍有混浊 , 溶解 , 溶解 , 溶解 ,
混浊
及测定结果
不稳定 较稳定 较稳定 稳定
对照品溶液中加入不同浓度蒽酮溶液后 , 未加
热前 , 从 80 %到 98 %浓 度反应 程度 逐渐 加强 , 80 %硫酸配制的蒽酮 溶液反应后溶液稍有发热 , 颜色为淡黄色 , 98 %硫酸配制的蒽酮溶液反应后 溶液产热剧烈 , 溶液颜色为淡绿色 。原标准中显色 后在 625 nm测定亦为淡绿色 , 因此比较了不同浓 度硫酸配制的蒽酮溶液在水浴加热和不加热情况 下与葡萄糖的反应情况 。 2.2 加热条件对测定的影响 按标准中方法 , 取 对照品溶液 0.5 mL, 90 %硫酸蒽酮溶液水浴加热 显色后测定吸 收度 ;另取 对照品溶 液 0.5 mL, 加 98 %硫酸蒽酮溶液显色 5 min, 立即在冰水中冷却 5 min, 测定吸收度值 , 结果见表 2。
含量测定过程中 , 发现按 《中国药典 》2005年版一 部灵芝多糖含量测定方法中规定的硫酸蒽酮溶液
配制方法配制的硫酸蒽酮溶液为一混浊液 , 几乎无 法显色测定 , 试验偏差很大 , 故本文进行了探讨及 改进 。
1 仪器及试剂 岛津 UV-2100型可见 -紫外分光光度计 ;蒽
酮 (分析纯 , 国药集团化学试剂有限公司生产 );硫 酸 (分析纯 , 西安化学试剂厂生产 );无水葡萄糖对 照品 (批号 110833 -200302, 中国药品生物制品检 定所提供 );灵芝为巿售药材 。 2 实验方法
[ 4] 杨素玲 , 杜文 孝 , 等 .紫外 分光光 度法 测定 通便 灵胶 囊 番泻苷 B的 含 量 [ J] .现 代 中 医 药 , 2004, 24(1):65 -6 6. (收稿日期 :2009 -02 -18)
关键词 :灵芝多糖 ;蒽 酮 ;紫外 -可见分光光度法 ;含量测定 中图分类号 :R 284.1 文献标识码 :A 文章编号 :1002 -168X(2009)05 -0062 -02
灵芝收载于 《中国药典 》2005年版一部[ 1] , 在 我国已有千年的药用历史 , 具有抗肿瘤 、免疫调节 、 降血糖 、抗衰老等广泛药理活性 。在对灵芝多糖的
参考文献
[ 1] 中华人民共和国 药典 2005年版 [ S] .一部 .北京 :化 学 工业出版社 , 130.
[ 2] 李利 军 .蒽 酮 -硫 酸 法快 速 测 定 蔗糖 的 研 究 及 应 用 [ J] .食品工业科技 , 2003, 24(10):145 -149.
[ 3] 陈云侠 , 武 希桃 , 等 .薄层 色谱 -分光 光度 法测 定疏 肝 益脾胶囊 黄 芪 甲苷 的 含 量 [ J] .陕 西 中 医 学 院 学报 , 2006, 29(5):64 -65.
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陕 西 中 医 学 院 学 报 JournalofShaanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine
2009年 09月第 32卷第 5期 Sep.2 009 Vol.32 No.5
灵芝多糖的含量测定方法探讨及改进
杨瑞瑞 1 李国华2 樊宝娟1
表 2 加热条 件对测定的影响
显色剂 吸收度
90 %硫酸蒽酮溶液水浴加热
1 0.315
0.315
2 0.317
0.316
3 0.317
0.317
98 %硫酸蒽酮溶液
0.326
0.327
0.325
0.325
0.326
0.325
由以上结果可以看出 , 98 %硫酸蒽酮溶液与 葡萄糖的反应 , 利用浓硫酸与水反应产生的热量 , 足以使反应完全 , 省去了水浴加热的繁琐 , 使实验 更简化 。 2.3 反应时间对吸收度值影响的考察 取对照品 溶液 0.5 mL, 加 98 %硫 酸蒽 酮溶 液 , 分别 进行 1 min、2 min、5 min、10 min、15 min的显色反应 , 立 即在冰水中冷却 5 min, 测定吸收度值 , 结果显色反 应 2 ～ 15 min吸收度值无明显变化 , 故确定反应时 间为 5 min。 冰水浴中冷却 2 min即可 , 考虑到做标 准曲线及样品时的方便 , 冷却时间亦确定为 5 min (表 3及图 1)。
按 《中国药典 》一部灵芝多糖含量测定方法中 规定的硫 酸蒽 酮 溶液 配 制方 法 (精 密称 取蒽 酮 0.1 g, 加 80 %的硫酸溶液 100 mL使溶解 , 摇匀 ) 配制的硫酸蒽酮溶液实际为一混浊液 , 无法显色测 定 。改为按硫酸体积比配制硫酸蒽酮溶液 , 蒽酮的 溶解性明显改善 , 但显色后空白溶液 、对照品溶液 、 样品溶液均仍有不同程度的混浊 , 因此 , 对硫酸蒽 酮的配制方法进行了优化 。 2.1 硫酸浓度的优化 取浓硫酸 , 按体积比分别 配制 80 %、85 %、90 %、95 %、98 %的硫酸溶液 , 精 密称取蒽酮 0.1 g, 分 别用 不同浓 度的 硫酸 溶液 100 mL使溶解 , 摇匀 。按标准中方法 , 取对照品溶 液 0.5 mL, 显色后测定吸收度 , 每份同时做空白 , 结果见表 1。
表 4 测定时间对吸收度值的影响
时间 (min)
0
5
1
15
20
30
吸收度
0.326 0.328 0.328 0.327 0.326 0.325
图 2 测定时间对吸收度值的关系
3 改进后灵芝多糖含量测定方法 3.1 对照品溶液的制备 精密称取 105 ℃干燥至 恒重的葡萄 糖对 照品 适量 , 加 水制成 每 1 mL含 0.1 mg的溶液 , 作为对照品溶液 。 3.2 标准曲线的制备 分别精密吸取对照品溶液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL, 置具塞试管中 , 加水至 2.0 mL, 精密加入硫酸蒽酮 溶液 [精密称取蒽酮 0.1 g, 加 98 %(V/V)的硫酸 溶液 100 mL使溶解 , 摇匀 ] 6 mL, 摇匀 , 反应 5 min, 取出 , 立即放入冰水浴中冷却 5 min, 以相应的试剂 为空白 , 照紫外 -可见分光光度法 , 在 625 nm波长 处测定吸光度 , 以吸光度为纵坐标 , 浓度为横坐标 ,
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图 1 反应时间对吸收度值的关系
2.4 测定时间对吸收度值的影响 取对照品溶液 0.5 mL, 加 98 %硫酸蒽酮溶液 , 摇匀 , 反应 5 min, 立即在冰水中冷却 5 min, 分别在 0 ～ 30 min内测定 吸收度值 , 结果在 30 min内测定吸收度值基本是 稳定的 , 见表 4及图 2。
(1.陕西省食品药品 检验所 , 陕西 西安 710061;2.陕西省人民医院 , 陕西 西安方法 , 通过考察配制硫酸蒽酮溶液时硫酸的浓 度 , 确 定合理的反 应条件 , 使 反应系统自行升 温 , 用紫外 -可见分光光度法测定 。 改进后的灵芝多糖含量测 定方法操作简单 , 结果可靠 。
23反应时间对吸收度值影响的考察取对照品溶液05ml98硫酸蒽酮溶液分别进行min2min5min10min15min的显色反应min测定吸收度值结果显色反15min吸收度值无明显变化故确定反应时min即可考虑到做标准曲线及样品时的方便冷却时间亦确定为3反应时间对吸收度值的影响结果时间min1015吸收度028603130315031403152009年09月第32卷第sep2009vol32no5journalofshaanxicollegeoftraditionalchinesemedicine1反应时间对吸收度值的关系24测定时间对吸收度值的影响取对照品溶液05ml98硫酸蒽酮溶液摇匀反应min立即在冰水中冷却min分别在30min内测定吸收度值结果在30min内测定吸收度值基本是稳定的见表4测定时间对吸收度值的影响时间min152030吸收度0326032803280327032603252测定时间对吸收度值的关系3改进后灵芝多糖含量测定方法31对照品溶液的制备精密称取105干燥至恒重的葡萄糖对照品适量加水制成每ml含01mg的溶液作为对照品溶液
表 3 反应时间对 吸收度值的影响结果
时间 (min) 吸收度
1 0.286
2 0.313
5 0.315
10 0.314
15 0.315
2009年 09月第 32卷第 5期 Sep.200 9 Vol.32 No.5
陕 西 中 医 学 院 学 报 JournalofShaanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine
绘制标准曲线 。 3.3 供试品溶液的制备 取样品粉末 2 g, 精密称 定 , 置索氏提取器中 , 加水 90mL, 加热回流提取至 提取液无色 , 提取液转移至 100 mL量瓶中 , 加水稀 释至 刻 度 , 摇 匀 , 精 密 量 取 10 mL, 加 入 乙 醇 150 mL, 摇匀 , 4 ℃放置 12 h, 取出 , 离心 , 倾去上清 液 , 沉淀加水溶解并转移至 50 mL量瓶中 , 加水稀 释到刻度 , 摇匀 , 作为供试品溶液 。 3.4 测定方法 精密量取供 试品溶液 2 mL, 置 10 mL具塞试管中 , 照标准曲线制备项下的方法 , 自 “精密加入硫酸蒽酮溶液 6 mL”起 , 依法测定吸光 度 , 从标准曲线上读出 含葡萄糖 的重量 (mg), 计 算 , 即得 。 4 讨论 4.1 硫酸蒽酮法测定多糖含量为常用的方法[ 2] , 其 原理是糖 (包括寡糖类和多糖类及淀粉 、纤维素等 ) 在浓硫酸作用下 , 经脱水反应 (同时反应液中的浓硫 酸可把多糖水解成单糖 )生成的糠醛或羟甲基糠醛 与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物 , 在一定范围内 , 颜色深浅与糖含量成正比 , 以葡萄糖作为对照品用 分光光度法[ 3 -4] 测定总糖的定量 , 因此硫酸的浓度 和反应的温度能影响试验结果的准确性 。 4.2 蒽酮不溶于水 , 在实际操作中 , 蒽酮 0.1 g, 加 80 %的硫酸溶液 100 ml使溶解即使在加热的条件 下也得到的是浑浊溶液 , 无法测到 稳定的吸收度 值 。 98 %硫酸溶液 (V/V)能完全溶解蒽酮 , 并且 利用硫酸与水反应时产生的热量 , 使反应系统自行 升温 , 达到充分显色 , 从而简化了实验操作 。
硫酸浓度 (%) 80
85
90
95
98
蒽酮溶解情况
稍有混浊 , 溶解 , 溶解 , 溶解 ,
混浊
及测定结果
不稳定 较稳定 较稳定 稳定
对照品溶液中加入不同浓度蒽酮溶液后 , 未加
热前 , 从 80 %到 98 %浓 度反应 程度 逐渐 加强 , 80 %硫酸配制的蒽酮 溶液反应后溶液稍有发热 , 颜色为淡黄色 , 98 %硫酸配制的蒽酮溶液反应后 溶液产热剧烈 , 溶液颜色为淡绿色 。原标准中显色 后在 625 nm测定亦为淡绿色 , 因此比较了不同浓 度硫酸配制的蒽酮溶液在水浴加热和不加热情况 下与葡萄糖的反应情况 。 2.2 加热条件对测定的影响 按标准中方法 , 取 对照品溶液 0.5 mL, 90 %硫酸蒽酮溶液水浴加热 显色后测定吸 收度 ;另取 对照品溶 液 0.5 mL, 加 98 %硫酸蒽酮溶液显色 5 min, 立即在冰水中冷却 5 min, 测定吸收度值 , 结果见表 2。
含量测定过程中 , 发现按 《中国药典 》2005年版一 部灵芝多糖含量测定方法中规定的硫酸蒽酮溶液
配制方法配制的硫酸蒽酮溶液为一混浊液 , 几乎无 法显色测定 , 试验偏差很大 , 故本文进行了探讨及 改进 。
1 仪器及试剂 岛津 UV-2100型可见 -紫外分光光度计 ;蒽
酮 (分析纯 , 国药集团化学试剂有限公司生产 );硫 酸 (分析纯 , 西安化学试剂厂生产 );无水葡萄糖对 照品 (批号 110833 -200302, 中国药品生物制品检 定所提供 );灵芝为巿售药材 。 2 实验方法
[ 4] 杨素玲 , 杜文 孝 , 等 .紫外 分光光 度法 测定 通便 灵胶 囊 番泻苷 B的 含 量 [ J] .现 代 中 医 药 , 2004, 24(1):65 -6 6. (收稿日期 :2009 -02 -18)
关键词 :灵芝多糖 ;蒽 酮 ;紫外 -可见分光光度法 ;含量测定 中图分类号 :R 284.1 文献标识码 :A 文章编号 :1002 -168X(2009)05 -0062 -02
灵芝收载于 《中国药典 》2005年版一部[ 1] , 在 我国已有千年的药用历史 , 具有抗肿瘤 、免疫调节 、 降血糖 、抗衰老等广泛药理活性 。在对灵芝多糖的
参考文献
[ 1] 中华人民共和国 药典 2005年版 [ S] .一部 .北京 :化 学 工业出版社 , 130.
[ 2] 李利 军 .蒽 酮 -硫 酸 法快 速 测 定 蔗糖 的 研 究 及 应 用 [ J] .食品工业科技 , 2003, 24(10):145 -149.
[ 3] 陈云侠 , 武 希桃 , 等 .薄层 色谱 -分光 光度 法测 定疏 肝 益脾胶囊 黄 芪 甲苷 的 含 量 [ J] .陕 西 中 医 学 院 学报 , 2006, 29(5):64 -65.
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陕 西 中 医 学 院 学 报 JournalofShaanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine
2009年 09月第 32卷第 5期 Sep.2 009 Vol.32 No.5
灵芝多糖的含量测定方法探讨及改进
杨瑞瑞 1 李国华2 樊宝娟1
表 2 加热条 件对测定的影响
显色剂 吸收度
90 %硫酸蒽酮溶液水浴加热
1 0.315
0.315
2 0.317
0.316
3 0.317
0.317
98 %硫酸蒽酮溶液
0.326
0.327
0.325
0.325
0.326
0.325
由以上结果可以看出 , 98 %硫酸蒽酮溶液与 葡萄糖的反应 , 利用浓硫酸与水反应产生的热量 , 足以使反应完全 , 省去了水浴加热的繁琐 , 使实验 更简化 。 2.3 反应时间对吸收度值影响的考察 取对照品 溶液 0.5 mL, 加 98 %硫 酸蒽 酮溶 液 , 分别 进行 1 min、2 min、5 min、10 min、15 min的显色反应 , 立 即在冰水中冷却 5 min, 测定吸收度值 , 结果显色反 应 2 ～ 15 min吸收度值无明显变化 , 故确定反应时 间为 5 min。 冰水浴中冷却 2 min即可 , 考虑到做标 准曲线及样品时的方便 , 冷却时间亦确定为 5 min (表 3及图 1)。
按 《中国药典 》一部灵芝多糖含量测定方法中 规定的硫 酸蒽 酮 溶液 配 制方 法 (精 密称 取蒽 酮 0.1 g, 加 80 %的硫酸溶液 100 mL使溶解 , 摇匀 ) 配制的硫酸蒽酮溶液实际为一混浊液 , 无法显色测 定 。改为按硫酸体积比配制硫酸蒽酮溶液 , 蒽酮的 溶解性明显改善 , 但显色后空白溶液 、对照品溶液 、 样品溶液均仍有不同程度的混浊 , 因此 , 对硫酸蒽 酮的配制方法进行了优化 。 2.1 硫酸浓度的优化 取浓硫酸 , 按体积比分别 配制 80 %、85 %、90 %、95 %、98 %的硫酸溶液 , 精 密称取蒽酮 0.1 g, 分 别用 不同浓 度的 硫酸 溶液 100 mL使溶解 , 摇匀 。按标准中方法 , 取对照品溶 液 0.5 mL, 显色后测定吸收度 , 每份同时做空白 , 结果见表 1。
表 4 测定时间对吸收度值的影响
时间 (min)
0
5
1
15
20
30
吸收度
0.326 0.328 0.328 0.327 0.326 0.325
图 2 测定时间对吸收度值的关系
3 改进后灵芝多糖含量测定方法 3.1 对照品溶液的制备 精密称取 105 ℃干燥至 恒重的葡萄 糖对 照品 适量 , 加 水制成 每 1 mL含 0.1 mg的溶液 , 作为对照品溶液 。 3.2 标准曲线的制备 分别精密吸取对照品溶液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL, 置具塞试管中 , 加水至 2.0 mL, 精密加入硫酸蒽酮 溶液 [精密称取蒽酮 0.1 g, 加 98 %(V/V)的硫酸 溶液 100 mL使溶解 , 摇匀 ] 6 mL, 摇匀 , 反应 5 min, 取出 , 立即放入冰水浴中冷却 5 min, 以相应的试剂 为空白 , 照紫外 -可见分光光度法 , 在 625 nm波长 处测定吸光度 , 以吸光度为纵坐标 , 浓度为横坐标 ,
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图 1 反应时间对吸收度值的关系
2.4 测定时间对吸收度值的影响 取对照品溶液 0.5 mL, 加 98 %硫酸蒽酮溶液 , 摇匀 , 反应 5 min, 立即在冰水中冷却 5 min, 分别在 0 ～ 30 min内测定 吸收度值 , 结果在 30 min内测定吸收度值基本是 稳定的 , 见表 4及图 2。
(1.陕西省食品药品 检验所 , 陕西 西安 710061;2.陕西省人民医院 , 陕西 西安方法 , 通过考察配制硫酸蒽酮溶液时硫酸的浓 度 , 确 定合理的反 应条件 , 使 反应系统自行升 温 , 用紫外 -可见分光光度法测定 。 改进后的灵芝多糖含量测 定方法操作简单 , 结果可靠 。
23反应时间对吸收度值影响的考察取对照品溶液05ml98硫酸蒽酮溶液分别进行min2min5min10min15min的显色反应min测定吸收度值结果显色反15min吸收度值无明显变化故确定反应时min即可考虑到做标准曲线及样品时的方便冷却时间亦确定为3反应时间对吸收度值的影响结果时间min1015吸收度028603130315031403152009年09月第32卷第sep2009vol32no5journalofshaanxicollegeoftraditionalchinesemedicine1反应时间对吸收度值的关系24测定时间对吸收度值的影响取对照品溶液05ml98硫酸蒽酮溶液摇匀反应min立即在冰水中冷却min分别在30min内测定吸收度值结果在30min内测定吸收度值基本是稳定的见表4测定时间对吸收度值的影响时间min152030吸收度0326032803280327032603252测定时间对吸收度值的关系3改进后灵芝多糖含量测定方法31对照品溶液的制备精密称取105干燥至恒重的葡萄糖对照品适量加水制成每ml含01mg的溶液作为对照品溶液
表 3 反应时间对 吸收度值的影响结果
时间 (min) 吸收度
1 0.286
2 0.313
5 0.315
10 0.314
15 0.315
2009年 09月第 32卷第 5期 Sep.200 9 Vol.32 No.5
陕 西 中 医 学 院 学 报 JournalofShaanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine
绘制标准曲线 。 3.3 供试品溶液的制备 取样品粉末 2 g, 精密称 定 , 置索氏提取器中 , 加水 90mL, 加热回流提取至 提取液无色 , 提取液转移至 100 mL量瓶中 , 加水稀 释至 刻 度 , 摇 匀 , 精 密 量 取 10 mL, 加 入 乙 醇 150 mL, 摇匀 , 4 ℃放置 12 h, 取出 , 离心 , 倾去上清 液 , 沉淀加水溶解并转移至 50 mL量瓶中 , 加水稀 释到刻度 , 摇匀 , 作为供试品溶液 。 3.4 测定方法 精密量取供 试品溶液 2 mL, 置 10 mL具塞试管中 , 照标准曲线制备项下的方法 , 自 “精密加入硫酸蒽酮溶液 6 mL”起 , 依法测定吸光 度 , 从标准曲线上读出 含葡萄糖 的重量 (mg), 计 算 , 即得 。 4 讨论 4.1 硫酸蒽酮法测定多糖含量为常用的方法[ 2] , 其 原理是糖 (包括寡糖类和多糖类及淀粉 、纤维素等 ) 在浓硫酸作用下 , 经脱水反应 (同时反应液中的浓硫 酸可把多糖水解成单糖 )生成的糠醛或羟甲基糠醛 与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物 , 在一定范围内 , 颜色深浅与糖含量成正比 , 以葡萄糖作为对照品用 分光光度法[ 3 -4] 测定总糖的定量 , 因此硫酸的浓度 和反应的温度能影响试验结果的准确性 。 4.2 蒽酮不溶于水 , 在实际操作中 , 蒽酮 0.1 g, 加 80 %的硫酸溶液 100 ml使溶解即使在加热的条件 下也得到的是浑浊溶液 , 无法测到 稳定的吸收度 值 。 98 %硫酸溶液 (V/V)能完全溶解蒽酮 , 并且 利用硫酸与水反应时产生的热量 , 使反应系统自行 升温 , 达到充分显色 , 从而简化了实验操作 。