miR-582-5p靶向DNMT1对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－７３８６．２０２１．０９．００４
·论著·
ｍｉＲ ５８２ ５ｐ靶向ＤＮＭＴ１对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响
高栋梁　高东东　白翠翠　杨波　杨喜明
作者单位：７１６０００　陕西省延安市，延安大学附属医院烧伤整形手外科
通讯作者：白翠翠，７１６０００　陕西省延安市，延安大学附属医院烧伤整形手外科；
Ｅ ｍａｉｌ：ｍｊｆｂｇｐｃ＠１６３．ｃｏｍ
【摘要】　目的　探讨微小ＲＮＡ ５８２ ５ｐ（ｍｉＲ ５８２ ５ｐ）对ＤＮＡ甲基转移酶１（ＤＮＭＴ１）的靶向作用及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响。

方法　实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）和蛋白质印迹法（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）检测瘢痕疙瘩成纤维细胞（ＫＦＢ）和正常皮肤成纤维细胞（ＮＦＢ）ｍｉＲ ５８２ ５ｐ、ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡ、ＤＮＭＴ１蛋白表达。

ｓｔａｒＢａｓｅ网站与双荧光素酶报告实验分析ｍｉＲ ５８２ ５ｐ与ＤＮＭＴ１的靶向关系。

瘢痕疙瘩成纤维细胞中转染ｍｉＲ ５８２ ５ｐ或ｓｉ ＤＮＭＴ１，噻唑蓝（ＭＴＴ）检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测ＤＮＭＴ１、细胞周期蛋白Ｄ１（ＣｙｃｌｉｎＤ１）、ｐ２１、Ｂ细胞淋巴瘤／白血病 ２（Ｂｃｌ ２）、Ｂｃｌ ２相关Ｘ蛋白（Ｂａｘ）蛋白表达。

ｍｉＲ ５８２ ５ｐ和ｐｃＤＮＡ ＤＮＭＴ１共转染，观察ＤＮＭＴ１过表达对ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响。

结果　与ＮＦＢ组比较，ＫＦＢ中ｍｉＲ ５８２ ５ｐ表达量明显减少（Ｐ＜０．０５），ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡ和ＤＮＭＴ１蛋白表达量显著增加（Ｐ＜０．０５）。

ｍｉＲ ５８２ ５ｐ靶向调控ＤＮＭＴ１的表达。

ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达或抑制ＤＮＭＴ１表达明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白表达（Ｐ＜０．０５），显著促进细胞凋亡、ｐ２１蛋白、Ｂａｘ蛋白表达（Ｐ＜０．０５）。

ＤＮＭＴ１过表达逆转ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达
对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、
ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白表达的抑制作用，以及对细胞凋亡、ｐ２１蛋白、Ｂａｘ蛋白表达的促进作用。

结论　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ通过靶向调控ＤＮＭＴ１的表达抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，并诱导其凋亡。

【关键词】　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ；ＤＮＭＴ１；人瘢痕疙瘩成纤维细胞；增殖；凋亡【中图分类号】　Ｒ６１９．６ 【文献标识码】　Ａ 【文章编号】　１００２－７３８６（２０２１）０９－１３０２－０６ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍｉＲ ５８２ ５ｐｔａｒｇｅｔｉｎｇＤＮＭＴ１ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ＧＡＯＤｏｎｇｌｉａｎｇ，ＧＡＯＤｏｎｇｄｏｎｇ，ＢＡＩＣｕｉｃｕｉ，ｅｔａｌ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｕｒｎＰｌａｓｔｉｃＨａｎｄＳｕｒｇｅｒｙ，ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＹａｎ’ａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｙａｎ’ａｎ７１６０００，Ｃｈｉｎａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｉＲ ５８２ ５ｐｔａｒｇｅｔｉｎｇＤＮＭＴ１ｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆ
ｈｕｍａｎｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｈｅｑＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｍｉＲ ５８２ ５ｐ，ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡａｎｄＤＮＭＴ１ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＫＦＢ）ａｎｄｎｏｒｍａｌｓｋｉｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＮＦＢ）．ＴｈｅｓｔａｒＢａｓｅｗｅｂｓｉｔｅａｎｄｔｈｅｄｕａｌｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒａｓｓａｙｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｔａｒｇｅｔｉｎｇｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲ ５８２ ５ｐａｎｄＤＮＭＴ１．Ｔｈｅ
ｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｍｉＲ ５８２ ５ｐｏｒｓｉ ＤＮＭＴ１
，ｔｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＭＴＴ，ａｎｄｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＭｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＤＮＭＴ１，ＣｙｃｌｉｎＤ１，ｐ２１，Ｂｃｌ ２ａｎｄＢａｘｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ．ＴｈｅｍｉＲ ５８２ ５ｐａｎｄｐｃＤＮＡ ＤＮＭＴ１ｗｅｒｅｃｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＤＮＭＴ１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｍｉＲ ５８２ ５ｐｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＡｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅｉｎＮＦＢｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｍｉＲ ５８２ ５ｐｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎＫＦＢｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５），ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＤＮＭＴ１ｍＲＮＡａｎｄＤＮＭＴ１ｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｍｉＲ ５８２ ５ｐｔａｒｇｅｔｅｄｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＮＭＴ１，ａｎｄｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ ５８２ ５ｐｏｒｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＤＮＭＴ１
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ
，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣｙｃｌｉｎＤ１ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＢｃｌ ２ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｐｒｏｍｏｔｅｄｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐ２１ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＢａｘｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ＜０．０５）．ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＮＭＴ１ｒｅｖｅｒｓｅｄｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｉＲ ５８２ ５ｐｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ
ｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣｙｃｌｉｎＤ１ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＢｃｌ ２ｐｒｏｔｅｉｎ
，ｗｈｉｃｈｒｅｖｅｒｓｅｄｔｈｅｐｒｏｍｏｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｐ２１ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＢａｘｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｍｉＲ ５８２ ５ｐｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓａｎｄｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｂｙｔａｒｇｅｔｅｄｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅＤＮＭＴ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ；ＤＮＭＴ１；ｈｕｍａｎｋｅｌｏｉｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
瘢痕疙瘩是皮肤纤维增生性疾病，是皮肤科和外科最常见的问题之一。

瘢痕疙瘩常伴有疼痛、瘙痒、畸
形甚至严重的功能损害，对患者危害极大［１］。

由于对
其发病机制认识不足，瘢痕疙瘩的治疗仍存在许多问题亟待解决。

微小ＲＮＡ（ＭｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲ）是短的非编码ＲＮＡ，在许多重要的生物学过程中起关键作用，包括细胞增殖、分化和凋亡。

有研究已经通过
ｍｉＲＮＡ微阵列在瘢痕疙瘩和正常皮肤（组织或细胞）之间识别了差异表达的ｍｉＲＮＡ［２］。

然而，ｍｉＲＮＡ在瘢痕疙瘩中的功能和具体作用尚未阐明。

越来越多的证据表明，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ是一种肿瘤抑制因子，与各种癌症（子宫内膜癌、非小细胞肺癌、胃癌）的细胞增殖、凋亡和侵袭有关［３－５］。

在哺乳动物细胞中，ＤＮＡ甲基转移酶１（ＤＮＡＭｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１，ＤＮＭＴ１）是最丰富的ＤＮＡ甲基转移酶［６］。

ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡ和蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达较正常皮肤细胞升高，干扰其表达后细胞的增殖能力减弱，凋亡增强［７］。

但ｍｉＲ ５８２ ５ｐ在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响，且ｍｉＲ ５８２ ５ｐ是否通过靶向调控ＤＮＭＴ１的表达影响瘢痕疙瘩成纤维的增殖和凋亡目前还尚未可知。

因此，本研究观察ｍｉＲ ５８２ ５ｐ在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达，以及其在瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡中的作用，并结合ＤＮＭＴ１，对其潜在的作用机制进行探讨，为瘢痕疙瘩发病机制的深入研究奠定基础。

１　材料与方法
１．１　主要试剂　ＤＭＥＭ培养基（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）购自美国Ｇｉｂｃｏ公司，实时荧光定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＰＣＲ）相关检测试剂盒购自日本ＴａＫａＲａ公司，异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ／碘化丙啶（ＡｎｎｅｘｉｎⅤ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ／ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＡｎｎｅｘｉｎⅤ ＦＩＴＣ／ＰＩ）细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司，二喹啉甲酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ，ＢＣＡ）、甘油醛 ３ 磷酸脱氢酶（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３ ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＡＰＤＨ）、ＤＮＭＴ１、细胞周期蛋白Ｄ１（ＣｙｃｌｉｎＤ１）、ｐ２１蛋白、Ｂ细胞淋巴瘤／白血病 ２（Ｂｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｗｋｍｉａ２，Ｂｃｌ ２）、Ｂｃｌ ２相关Ｘ蛋白（Ｂｃｌ ２ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＸｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂａｘ）抗体购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥生物公司，ｍｉＲ ＮＣ、ｍｉＲ ５８２ ５ｐ、ｓｉ ＮＣ、ｓｉ ＤＮＭＴ１、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ ＤＮＭＴ１购自上海吉玛生物公司。

１．２　细胞分离培养　瘢痕疙瘩成纤维细胞（ＫＦＢ）和正常皮肤成纤维细胞（ＮＦＢ）的分离培养参考杨力等［８］的方法操作。

收集我院患者术后瘢痕疙瘩和正常皮肤标本，加入０．５％洗必泰浸泡５ｍｉｎ，之后用０．９％氯化钠溶液充分漂洗，将标本剪成约１ｍｍ３的碎片，加入２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基培养。

待细胞融合度达约８０％时，进行接种传代。

１．３　ｑＰＣＲ检测ｍｉＲ ５８２ ５ｐ和ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡ表达　选取生长状态良好的第４～８代瘢痕疙瘩成纤维细胞（ＫＦＢ）和正常皮肤成纤维细胞（ＮＦＢ），加入ＴＲＩｚｏｌ试剂提取细胞中总ＲＮＡ，通过逆转录试剂盒合成ｃＤＮＡ，按照试剂盒检测说明书进行ｑＰＣＲ反应。

ｍｉＲ ５８２ ５ｐ正向引物序列为５’ ＧＣＧＧＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＴＣＡＡＣＣ ３’，反向引物序列为５’ ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡ ３’，ＤＮＭＴ１正向引物序列为５’ ＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧ ３’，反向引物序列为５’ ＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＴＣＴＣ ３’，内参ＧＡＰＤＨ正向引物序列为５’ ＧＧＡＧＣＧＡＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＡＡＴ ３’，反向引物序列为５’ ＧＧＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧ ３’。

根据计算２ ΔΔＣｔ法计算ｍｉＲ ５８２ ５ｐ和ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡ表达。

１．４　ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测ＤＮＭＴ１表达　ＫＦＢ和ＮＦＢ细胞中加入ＲＩＰＡ裂解液充分提取细胞总蛋白，蛋白经ＢＣＡ法定量后，吸取３０μｇ蛋白进行十二烷基硫酸钠（Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ） 聚丙烯酰胺凝胶（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＡＧＥ）电泳，电泳结束后转膜，用５％脱脂奶粉封闭１ｈ，分别加入ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ ２蛋白一抗（稀释度为１∶１０００），４℃孵育过夜，之后经Ｔｒｉｓ ＨＣｌ Ｔｗｅｅｎ缓冲盐溶液（ｔｒｉｓｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅｗｉｔｈｔｗｅｅｎ，ＴＢＳＴ）漂洗８ｍｉｎ，重复３次，加入二抗（稀释度为１∶５０００），室温孵育１ｈ，ＴＢＳＴ漂洗８ｍｉｎ，重复３次，置化学发光液显色，以ＧＡＰＤＨ为参照，分析ＤＮＭＴ１蛋白表达量。

１．５　生物信息学预测与双荧光素酶报告实验　ｓｔａｒＢａｓｅ网站预测ｍｉＲ ５８２ ５ｐ的靶基因，发现ＤＮＭＴ１的３’非编码区（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ，３’ＵＴＲ）中含有与ｍｉＲ ５８２ ５ｐ互补的核苷酸序列。

分别构建含有ｍｉＲ ５８２ ５ｐ结合位点的野生型ＤＮＭＴ１（ＷＴ ＤＮＭＴ１）和突变型ＤＮＭＴ１（ＭＵＴ ＤＮＭＴ１）荧光素酶报告载体，按照Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００试剂说明书，分别与ｍｉＲ ＮＣ、ｍｉＲ ５８２ ５ｐ共转染，转染４８ｈ，检测双荧光素酶活性。

１．６　细胞转染　在６孔板中接种５×１０５个／ｍｌ的瘢痕疙瘩成纤维细胞，待细胞融合至７０％时，依照Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００试剂说明书的指示，将ｍｉＲ ＮＣ、ｍｉＲ ５８２ ５ｐ、ｓｉ ＮＣ、ｓｉ ＤＮＭＴ１、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ ＤＮＭＴ１转染到瘢痕疙瘩成纤维细胞，４８ｈ后参照１．３和１．４所述方法分别检测ｍｉＲ ５８２ ５ｐ、ＤＮＭＴ１、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ｐ２１、Ｂｃｌ ２、Ｂａｘ蛋白表达。

１．７　ＭＴＴ检测细胞增殖　将瘢痕疙瘩成纤维细胞密度调整为１×１０５个／ｍｌ，接种于９６孔板，分别培养２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ后，加入２０μｌ的ＭＴＴ溶液，孵育４ｈ，加入１５０μｌ二甲基亚砜，摇床震荡反应１０ｍｉｎ，置酶标仪检测４９０ｎｍ处的吸光度（ＯＤ）值。

１．８　流式细胞术检测细胞凋亡　收集转染后的瘢痕
疙瘩成纤维细胞，按照细胞凋亡检测试剂盒说明书，将
细胞密度调整为１×１０６个／ｍｌ，使用５００μｌ缓冲液重
悬细胞，加入５μｌＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ，轻摇混匀，加入５μｌＰＩ染色液，轻摇混匀，避光孵育１５ｍｉｎ，置流式细胞仪检测细胞凋亡。

１．９　统计学分析　应用ＳＰＳＳ２２．０统计软件，计量资料以珋ｘ±ｓ表示，采用ｔ检验，多组间采用单因素方差分析，组间多重比较采用ＳＮＫ ｑ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２　结果
２．１　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ和ＤＮＭＴ１在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达　ｑＰＣＲ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测结果发现，与正常皮肤成纤维细胞ＮＦＢ组比较，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ在瘢痕疙瘩成纤维细胞ＫＦＢ中表达量明显减少，ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡ和ＤＮＭＴ１蛋白表达量显著增加（Ｐ＜０．０５）。

见图１，表１。

图１　ＤＮＭＴ１蛋白表达
表１　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ和ＤＮＭＴ１在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达
ｎ＝９，珋
ｘ±ｓ组别ｍｉＲ ５８２ ５ｐＤＮＭＴ１ｍＲＮＡＤＮＭＴ１蛋白ＮＦＢ组１．００±０．０９１．００±０．０７０．２２±０．０３ＫＦＢ组０．５３±０．０５２．７４±０．２６０．６１±０．０６ｔ值１３．６９５１９．３８６１７．４４１Ｐ值
０．０００
０．０００
０．０００
２．２　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ靶向调控ＤＮＭＴ１的表达　ｓｔａｒＢａｓｅ预测结果显示，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ与ＤＮＭＴ１的３’ＵＴＲ中部分碱基可形成互补配对。

双荧光素酶报告实验结果表明，与ｍｉＲ ＮＣ组比较，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ明显降低ＷＴ ＤＮＭＴ１荧光素酶相对活性（Ｐ＜０．０５），对ＭＵＴ ＤＮＭＴ１荧光素酶相对活性无显著影响。

ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ
检测结果发现，与ｍｉＲ ＮＣ组比较，转染ｍｉＲ ５８２ ５ｐ明显减少ＤＮＭＴ１蛋白表达量，转染ａｎｔｉ ｍｉＲ ５８２ ５ｐ较ａｎｔｉ ｍｉＲ ＮＣ组显著提高ＤＮＭＴ１蛋白水平（Ｐ＜０．０５
）。

见图２，表２、３。

图２　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ靶向调控ＤＮＭＴ１的表达；ＡＤＮＭＴ１的３’ＵＴＲ中含
有与ｍ
ｉＲ ５８２ ５ｐ互补的核苷酸序列；ＢＤＮＭＴ１蛋白表达表２　双荧光素酶报告实验
ｎ＝９，珋ｘ±ｓ组别ＷＴ ＤＮＭＴ１ＭＵＴ ＤＮＭＴ１ｍｉＲ ＮＣ组　１．００±０．０７０．９９±０．０９ｍｉＲ ５８２ ５ｐ组
０．４２±０．０４１．０１±０．０９ｔ值２１．５８２０．４７１Ｐ值
０．０００
０．６４３
表３　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ调控ＤＮＭＴ１蛋白的表达　ｎ＝９，珋
ｘ±ｓ　组别
ＤＮＭＴ１蛋白ｍｉＲ ＮＣ组０．５８±０．０５
ｍｉＲ ５８２ ５ｐ组０．２２±０．０３
ａｎｔｉ ｍｉＲ ＮＣ组０．５６±０．０５
ａｎｔｉ ｍｉＲ ５８２ ５ｐ组０．９４±０．０８
＃　Ｆ值２５３．１７０　Ｐ值
０．０００
注：
与ｍｉＲ ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０５；与ａｎｔｉ ｍｉＲ ＮＣ组比较，＃Ｐ＜０．０５２．３　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响　与ｍｉＲ ＮＣ组比较，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达明显增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中ｍｉＲ ５８２ ５ｐ表达量，显著降低细胞２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ的吸光度值，并明显增加凋亡率，显著降低ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白水平，明显增加ｐ２１蛋白、Ｂａｘ蛋白表达量（Ｐ＜０．０５）。

见图３，表４。

图３　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响；Ａ增殖、凋亡相关蛋白表达；Ｂ细胞凋亡流式图
表４　ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响
ｎ＝９，珋ｘ±ｓ组别ｍｉＲ ５８２ ５ｐＯＤ值（４９０ｎｍ）
２４ｈ４８ｈ７２ｈ凋亡率（％）ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白ｐ２１蛋白Ｂｃｌ ２蛋白Ｂａｘ蛋白ｍｉＲ ＮＣ组　１．００±０．０９０．４７±０．０４０．７３±０．０７１．０４±０．０９７．１２±０．７２０．７２±０．０７０．２５±０．０３０．６４±０．０６０．３３±０．０３ｍｉＲ ５８２ ５ｐ组
２．４３±０．２４０．４３±０．０４０．５５±０．０５０．６７±０．０６２４．６３±２．５１０．３１±０．０３０．６７±０．０６０．２３±０．０３０．７９±０．０７ｔ值１６．７３６２．１２１６．２７７１０．２６２２０．１１７１６．１５０１８．７８３１８．３３５１８．１２０Ｐ值
０．０００
０．０４９
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
２．４　抑制ＤＮＭＴ１表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响　与ｓｉ ＮＣ组比较，抑制ＤＮＭＴ１表达明显减少瘢痕疙瘩成纤维细胞中ＤＮＭＴ１蛋白表达量、４８ｈ、７２ｈ的吸光度值（Ｐ＜０．０５），对２４ｈ的吸光度影
响不明显，以及显著增加细胞凋亡率，明显降低ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白水平，并显著提高ｐ２１蛋白、Ｂａｘ蛋白表达量（Ｐ＜０．０５）。

见图４，表５。

图４　抑制ＤＮＭＴ１表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响；ＡＤＮＭＴ１和增殖、凋亡相关蛋白表达；Ｂ细胞凋亡流式图
表５　抑制ＤＮＭＴ１表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响
ｎ＝９，珋ｘ±ｓ组别ＤＮＭＴ１蛋白ＯＤ值（４９０ｎｍ）
２４ｈ４８ｈ７２ｈ凋亡率（％）ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白ｐ２１蛋白Ｂｃｌ－２蛋白Ｂａｘ蛋白ｓｉ ＮＣ组 ０．６３±０．０６０．４９±０．０４０．７６±０．０７１．０７±０．０９６．２５±０．６３０．７１±０．０７０．２２±０．０３０．６６±０．０６０．３２±０．０３ｓｉ ＤＮＭＴ１组
０．２５±０．０３０．４８±０．０４０．５９±０．０５０．７１±０．０６２０．１１±２．１４０．３５±０．０３０．６１±０．０６０．２９±０．０３０．７４±０．０７ｔ值１６．９９４０．５３０５．９２８９．９８４１８．６３９１４．１８１１７．４４１１６．５４６１５．５４４Ｐ值
０．０００
０．６０３
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
２．５　ＤＮＭＴ１过表达逆转ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的作用　与ｍｉＲ ＮＣ组比较，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达明显减少瘢痕疙瘩成纤维细胞中ＤＮＭＴ１蛋白表达量、４８ｈ、７２ｈ的吸光度值、ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白表达量（Ｐ＜０．０５）；对２４ｈ吸光度值无明显影响，显著提高细胞凋亡率、ｐ２１蛋
白、
Ｂａｘ蛋白水平（Ｐ＜０．０５）。

与ｍｉＲ ５８２ ５ｐ和ｐｃＤＮＡ共转染比较，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ和ｐｃＤＮＡ ＤＮＭＴ１共转染明显提高ＤＮＭＴ１蛋白表达量、４８ｈ、７２ｈ吸光度值、ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白表达量（Ｐ＜０．０５），对２４ｈ吸光度值无显著影响，并且显著降低细胞凋亡率、ｐ２１蛋白、Ｂａｘ蛋白水平（Ｐ＜０．０５）。

见图５，表６。

　图５　ＤＮＭＴ１过表达逆转了ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的作用；ＡＤＮＭＴ１和增殖、凋亡相关蛋白表达；Ｂ细胞凋亡流
式图
表６　ＤＮＭＴ１过表达逆转了ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的作用
ｎ＝９，珋
ｘ±ｓ　组别ＤＮＭＴ１蛋白ＯＤ值（４９０ｎｍ）
２４ｈ４８ｈ
７２ｈ
凋亡率（％）ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白
ｐ２１蛋白Ｂｃｌ ２蛋白Ｂａｘ蛋白ｍｉＲ ＮＣ组０．６２±０．０６
０．４８±０．０４０．７５±０．０７１．０５±０．０９７．７４±０．７５
０．７０±０．０６
０．２４±０．０３
０．６５±０．０６
０．３１±０．０３
ｍｉＲ ５８２ ５ｐ组０．２３±０．０３
０．４４±０．０４０．５６±０．０５ ０．６９±０．０６ ２３．５４±２．３１ ０．３２±０．０３
０．６８±０．０６
０．２６±０．０３
０．７７±０．０６
ｍｉＲ ５８２ ５ｐ＋ｐｃＤＮＡ组０．２１±０．０３
０．４３±０．０３０．５３±０．０４０．６４±０．０５２５．１８±２．２５
０．３１±０．０３
０．６９±０．０６
０．２５±０．０３
０．７８±０．０７ｍｉＲ ５８２ ５ｐ＋ｐｃＤＮＡ ＤＮＭＴ１组０．５１±０．０５
＃０．４７±０．０４０．６６±０．０５
＃０．８７±０．０８＃１３．６９±１．３３
＃０．５９±０．０５
＃０．３５±０．０３
＃０．５４±０．０５
＃０．４２±０．０４＃　ｔ值１９０．２９１３．５７８３１．４０８６０．８５９１９３．４６３１７４．６８３２１０．９３３１８４．８６０
１９０．０３６
　Ｐ值
０．０００
０．０２４
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
０．０００
０．００００．０００
注：与ｍｉＲ ＮＣ组比较， Ｐ＜０．０５；与ｍｉＲ ５８２ ５ｐ＋ｐｃＤＮＡ组比较，＃Ｐ＜０．０５
３　讨论
瘢痕疙瘩又称瘢痕疙瘩病，是一种局部侵袭性的良性肿瘤，它超出了原来伤口的范围，侵入周围的健康皮肤［９］。

这些瘢痕不仅影响美观，而且造成疼痛和功能障碍，给患者带来严重的生理和心理上的痛苦。

瘢痕疙瘩属于良性的真皮肿瘤，但瘢痕疙瘩的复发率高，术后畸形发生率高，单纯手术切除难以治愈［１０］。

虽然最终导致瘢痕疙瘩形成的病理生理机制仍未完全阐明，但人们普遍认为瘢痕疙瘩是由成纤维细胞过度增殖和成纤维细胞凋亡不足导致的细胞动力学失衡的结果［１１］。

因此，研究与瘢痕疙瘩成纤维细胞有关的细胞和分子机制对改善瘢痕疙瘩的临床治疗意义重大。

迄今为止，在各种病变组织中发现了数百种ｍｉＲＮＡ的失调；然而，只有一小部分ｍｉＲＮＡ的生物学功能得到研究。

已知ｍｉＲＮＡ可调节皮肤发育和基因表达的改变，并与皮肤病理相关，包括炎症性疾病和恶性病变［１２］。

ｍｉＲＮＡ在皮肤纤维化中的主要功能是调节参与其发病机制和维持基因的表达［１３］。

然而，ｍｉＲＮＡ在瘢痕疙瘩发病机制中的功能作用仍不清楚。

研究表明，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ在子宫内膜癌组织中表达降低，过表达ｍｉＲ ５８２ ５ｐ抑制子宫内膜癌细胞增殖，促进细胞凋亡［３］。

ＭｉＲ ５８２ ５ｐ在涎腺腺样囊性癌或非小细胞肺癌中低表达，上调其表达显著抑制细胞的迁移、侵袭和增殖能力［１４］。

ＭｉＲ ５８２ ５ｐ在胃癌组织中表达下调，过表达ｍｉＲ ５８２ ５ｐ抑制胃癌细胞的活性，促进细胞凋亡［５］。

本研究中，ｑＰＣＲ检测结果发现，与正常皮肤成纤维细胞ＮＦＢ比较，瘢痕疙瘩成纤维细胞ＫＦＢ中ｍｉＲ ５８２ ５ｐ表达明显下调，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白表达，显著促进细胞凋亡、ｐ２１蛋白、Ｂａｘ蛋白表达。

说明ｍｉＲ ５８２ ５ｐ在瘢痕疙瘩中同样扮演着抑制因子的角色，其过表达可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖并诱导其凋亡。

已有证据表明，ＤＮＭＴ１参与宫颈癌［１５，１６］、非小细胞肺癌［１７］等肿瘤的发生发展过程。

与正常细胞相比，前列腺癌细胞中ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平均显著升高，沉默其表达可明显抑制前列腺癌细胞的增殖并促进细胞凋亡［１８，１９］。

膀胱癌组织与膀胱癌细胞中存在ＤＮＭＴ１蛋白过表达的现象，抑制ＤＮＭＴ１表达能有效抑制肿瘤细胞的增殖和促进凋亡。

本实验中，瘢痕疙瘩成纤维细胞中的ＤＮＭＴ１ｍＲＮＡ和ＤＮＭＴ１蛋白表达明显上调，抑制ＤＮＭＴ１表达明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白表达，显著促进细胞凋亡、ｐ２１蛋白、Ｂａｘ蛋白表达，与前述报道［１８］一致，ＤＮＭＴ１的抑制会使瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖能力下降，细胞凋亡增加。

并且，本研究发现，ＤＮＭＴ１是ｍｉＲ ５８２ ５ｐ的功能靶基因，上调或下调ｍｉＲ ５８２ ５ｐ表达明显调控ＤＮＭＴ１的蛋白水平，进一步证实ｍｉＲ ５８２ ５ｐ可以靶向调控ＤＮＭＴ１。

另外，ＤＮＭＴ１过表达逆转了ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白、Ｂｃｌ ２蛋白表达的作用，以及逆转了ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达促进细胞凋亡、ｐ２１蛋白、Ｂａｘ蛋白表达的作用，这些结果表明，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ过表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖并诱导细胞凋亡的作用可能是通过靶向调控ＤＮＭＴ１的表达来实现的。

综上所述，ｍｉＲ ５８２ ５ｐ在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达下调，其过表达可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和诱导细胞的凋亡，作用机制与靶向调控ＤＮＭＴ１表达有关，为瘢痕疙瘩的临床诊治提供了新参考。

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（下转１３１１页）
ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＭＭＰ２和ＭＭＰ９蛋白表达，研究表明ＣｙｃｌｉｎＤ１可正向调控细胞周期，并可与ＣＤＫ４结合形成复合物从而促进细胞增殖［１２］。

基质金属蛋白酶与肿瘤细胞迁移及侵袭密切相关，ＭＭＰ２、ＭＭＰ９属于基质金属蛋白酶类并可促进细胞迁移及侵袭［１３］。

本研究结果提示ｍｉＲ ２１４ ５ｐ过表达可抑制ＲＡ ＦＬＳｓ细胞增殖及侵袭，从而在ＲＡ ＦＬＳｓ中发挥重要调控作用。

此外，通过ｓｔａｒＢａｓｅ数据库预测发现，ＳＥＭＡ４Ｃ的３’ ＵＴＲ序列中含有与ｍｉＲ ２１４ ５ｐ互补的核苷酸序列，预示两者间存在结合位点。

本研究假设ｍｉＲ ２１４ ５ｐ可靶向ＳＥＭＡ４Ｃ调控ＲＡ ＦＬＳｓ的增殖和侵袭。

ＳＥＭＡ４Ｃ又叫信号素分子４Ｃ，ＳＥＭＡ４Ｃ在喉鳞状细胞癌组织、乳腺浸润性导管癌组织、宫颈癌和骨肉瘤中均表达上调，与癌细胞的ＥＭＴ、转移及预后有关，是多个ｍｉＲＮＡ的靶点，发挥癌基因的作用［１４－１７］。

ＳＥＭＡ４Ｃ在ＲＡ ＦＬＳｓ细胞中表达尚不清楚。

本研究证实，ＳＥＭＡ４Ｃ在ＲＡ ＦＬＳｓ中的表达量升高，低表达ＳＥＭＡ４Ｃ基因可显著抑制ＲＡ ＦＬＳｓ细胞增殖和侵袭。

双荧光素酶报告系统结果发现，ｍｉＲ ２１４ ５ｐ靶向负调控ＳＥＭＡ４Ｃ蛋白表达，提示ｍｉＲ ２１４ ５ｐ可能通过负向调控ＳＥＭＡ４Ｃ的表达从而影响ＲＡ ＦＬＳｓ细胞增殖及侵袭。

为探究ｍｉＲ ２１４ ５ｐ是否可通过调控ＳＥＭＡ４Ｃ的表达而发挥作用，本研究将ｍｉＲ ２１４ ５ｐｍｉｍｉｃｓ与ｐｃＤＮＡ ＳＥＭＡ４Ｃ共转染至ＲＡ ＦＬＳｓ细胞中，ＳＥＭＡ４Ｃ的表达水平增高，ＲＡ ＦＬＳｓ细胞增殖率和侵袭细胞数均增高，ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＭＭＰ ２和ＭＭＰ ９蛋白水升高，说明高表达ＳＥＭＡ４Ｃ逆转了上调ｍｉＲ ２１４ ５ｐ对ＲＡ ＦＬＳｓ细胞增殖和侵袭的抑制作用，两者在ＲＡ ＦＬＳｓ细胞中存在调控关系。

提示ｍｉＲ ２１４ ５ｐ可能通过调控ＳＥＭＡ４Ｃ表达从而影响ＲＡ ＦＬＳｓ细胞增殖及侵袭。

综上所述，在ＲＡ ＦＬＳｓ细胞中，ｍｉＲ ２１４ ５ｐ下调，ＳＥＭＡ４Ｃ基因上调，ｍｉＲ ２１４ ５ｐ通过靶向ＳＥＭＡ４Ｃ调控ＲＡ ＦＬＳｓ细胞增殖和侵袭。

ｍｉＲ ２１４ ５ｐ有望成为ＲＡ诊断和治疗新的靶标。

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