一种大豆发酵代谢物及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810660040.7
(22)申请日 2018.06.22
(71)申请人 广州市仙婷贸易有限公司
地址 510000 广东省广州市越秀区环市东
路371-375号南塔2509、2512、2513房
(72)发明人 让-伊夫 布鲁克瑟　周雯　付毅敏　
(74)专利代理机构 广州三环专利商标代理有限
公司 44202
代理人 宋静娜　郝传鑫
(51)Int.Cl.
C12P 1/04(2006.01)
A61K 8/9789(2017.01)
A61Q 19/00(2006.01)
C12R 1/225(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
C12R 1/46(2006.01)
(54)发明名称
一种大豆发酵代谢物及其应用
(57)摘要
本发明公开了一种大豆发酵代谢物，该代谢
物的组分包括氨基酸及其衍生物、胺、磷酸糖、核
苷、核苷衍生物、有机酸和脂肪酸；同时，还公开
了大豆发酵代谢物的制备方法和应用。

本发明的大豆发酵代谢产物对于改善皮肤菌群的多样性
及质量、皮肤含水量和皮肤酸罩都有显著的作
用；同时避免皮肤有益物质的流失，维持皮肤菌
群的平衡；还可以增强非特异性免疫的应答，防
止皮肤的感染及炎症，并预防皮肤相关疾病，如
瘙痒、痤疮、皮屑、
发红和干燥等。

权利要求书1页 说明书11页 附图2页CN 108866103 A 2018.11.23
C N 108866103
A
1.一种大豆发酵代谢物，其特征在于，所述代谢物的组分包括氨基酸及其衍生物、胺、磷酸糖、核苷、核苷衍生物、有机酸和脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的大豆发酵代谢物，其特征在于，所述氨基酸为丙氨酸、苏氨酸、L -天冬酰胺、L -瓜氨酸、氧化谷胱甘肽、色氨酸和精氨酸中的至少一种，所述氨基酸衍生物为D -丙氨酰-D -丙氨酸、羟甲基赖氨酸、茶氨酸、硫代脯氨酸、氨基甲酰-DL -天冬氨酸、N -乙酰谷氨酸、2-甲基丝氨酸和O -乙酰-L -丝氨酸中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的大豆发酵代谢物，其特征在于，所述胺为乙酰葡糖胺、三甲胺、N -乙酰胺、二乙甲苯酰胺、酰胆碱、腐胺和环己胺中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的大豆发酵代谢物，其特征在于，所述磷酸糖为D -葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的大豆发酵代谢物，其特征在于，所述核苷为腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷中的至少一种，所述核苷衍生物为单磷酸胞苷、环腺苷酸、单磷酸腺苷、鸟苷单磷酸、5-甲基硫代腺中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的大豆发酵代谢物，其特征在于，所述有机酸为苯甲酸、乙醇酸、琥珀酸、L -乳酸、酒石酸、莽草酸、高香草酸和半乳糖醛酸中的至少一种，所述脂肪酸为棕榈油酸、亚麻酸、亚油酸、蓖麻油酸、肉豆蔻酸、芥酸和戊烯二酸中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的大豆发酵代谢物，其特征在于，所述大豆发酵代谢物中还含有维他命的代谢物，所述维他命为维他命B1、B2、B3、B5、B6、E和H中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的大豆发酵代谢物，其特征在于，所述大豆发酵代谢物中还含有十六酰胺乙醇、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、山柰酚和橡精。

9.一种护肤品，其特征在于，所述护肤品含有权利要求1～8任一项所述的大豆发酵代谢物。

10.权利要求1～8任一项所述的大豆发酵代谢物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用日本黑豆，经过磨碎、加热、压榨得到豆奶；
(2)对所述豆奶杀菌消毒后，接种多种细菌，在37℃下发酵120小时，消毒杀菌后获得未稀释的发酵液，即所述大豆发酵代谢物。

权　利　要　求　书1/1页CN 108866103 A
一种大豆发酵代谢物及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及大豆发酵技术领域，尤其是一种大豆发酵代谢物及其应用。

背景技术
[0002]皮肤由各种各样的生态位组成，包括大范围变动的pH值、温度、湿度和皮脂含量的区域。

皮肤表面角质层的pH值和水分含量测定值对于客观评价一些治疗过敏性皮炎的非入侵性技术以及皮肤屏障的物理参数十分有用。

此外，皮肤结构也与其特有的微生物群有关，例如毛囊、皮脂腺、外分泌腺和大汗腺等均为微生物次级栖息地。

皮肤屏障可以防止水分的蒸发、防止感染物或有毒物质侵入，这对于生存至关重要。

皮肤对于不同种群的微生物群来说也是一个复杂的栖息地。

在生育过程中以及在出生后的环境中，皮肤被大量的微生物所占据，其中许多微生物是共生的或共栖的。

皮肤上的微生物群体的潜在作用包括抑制病原物种入侵及进一步加工皮肤蛋白质、游离脂肪酸和皮脂。

[0003]发酵是人类较早接触的一种生物化学反应，早期的发酵仅涉及到食品，如酱油、米酒的酿制，奶酪、豆腐乳、泡菜的制作等。

指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。

如今发酵的食品和饮料正在经历一场“文化复兴”，因为这被公认为是非常有益于健康的。

与此同时，在化妆品美容行业内，发酵产品近5年一直呈现上升的趋势。

越来越多的公司采用发酵技术，使天然活性分子的益处得以发挥。

目前业内普遍的行业共识是，发酵后大分子活性物被分解成更小的分子，有利于提高皮肤渗透性。

[0004]干酪乳杆菌发酵大米制备发酵产物滤液的方法及其应用(CN104586735A)，公开了发酵大米滤液添加到化妆品组合物中具有促进其他成分的渗透作用，同时减少皮肤皱纹，降低皮肤黑色素，涉及对大米发酵产物的功效测试。

一种含植物发酵产物的组合物及其制备方法和应用(CN106619379B)，公开了植物发酵组合物对保湿效果及感官评价方面的基础测试，其中，涉及植物发酵产物可以增加肌肤水合度及减少经皮水分流流失层面。

黑豆蛋白酵及其制备方法(CN102972527 B)公开了一种黑豆发酵制品—黑豆蛋白酵及其制备方法，其中未涉及到发酵产品对人体的好处。

[0005]众所周知，大豆本身富含丰富的大豆异黄酮这种植物雌激素，以及植物蛋白质等，这两种成分有助于提高机体内雌激素的水平，帮助肌肤保持弹性，其提取物的应用吸引了大量化妆品研究开发者的关注。

而常规的大豆发酵的代谢产物，包括甘油，氨基酸和有机酸等，从理论上而言，应用到皮肤上后可以改善皮肤的保水性，维持皮肤表面的低酸性状态，改善粗糙的皮肤纹理等。

但是，并未见将大豆发酵物和皮肤屏障相关联的报道。

[0006]另一方面，表皮葡萄球菌存在于皮肤表面，其比例占到90％，是构成皮肤微生物屏障的有益菌之一；其极少危害表皮的角质细胞，但它产生的多肽能够毒害其他生物体，如金黄色葡萄球菌。

因此，表皮葡萄球菌可能增加对某些常见的病原体的防御水平，所以宿主的表皮能够允许其生长，形成共生关系。

不同个体的皮肤呈现特性差异，随着基础化妆品中的活性物质逐渐被皮肤微生物消耗，这些基础化妆品对表皮葡萄球菌生长的刺激作用往往不
足。

同时，当金黄色葡萄球菌定居增多时，表皮会逐渐干燥出现裂纹，并导致皮肤炎症。

发明内容
[0007]基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种大豆发酵代谢产物，其能改善皮肤的保水性，维持皮肤表面的低酸性状态，改善粗糙的皮肤纹理，同时，能抑制金黄色葡萄球菌等病原菌的入侵，以及促进表皮葡萄球菌的生长。

[0008]为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
[0009]在第一个方面，本发明提供了一种大豆发酵代谢物，所述代谢物的组分包括氨基酸及其衍生物、胺、磷酸糖、核苷、核苷衍生物、有机酸和脂肪酸。

优选地，所述大豆为日本黑豆。

[0010]优选地，所述氨基酸为丙氨酸、苏氨酸、L-天冬酰胺、L-瓜氨酸、氧化谷胱甘肽、色氨酸和精氨酸中的至少一种，所述氨基酸衍生物为D-丙氨酰-D-丙氨酸、羟甲基赖氨酸、茶氨酸、硫代脯氨酸、氨基甲酰-DL-天冬氨酸、N-乙酰谷氨酸、2-甲基丝氨酸和O-乙酰-L-丝氨酸中的至少一种。

其中，D-丙氨酰-D-丙氨酸的抗菌性正在被研究中。

[0011]其中，丙氨基酸是一种抗生素；苏氨酸可对胸腺免疫赋活；精氨酸具有一定的免疫机能；
[0012]优选地，所述胺为乙酰葡糖胺、三甲胺、N-乙酰胺、二乙甲苯酰胺、酰胆碱、腐胺和环己胺中的至少一种。

其中，乙酰葡糖胺被建议用于自身免疫性疾病的治疗。

[0013]优选地，所述磷酸糖为D-葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸中的至少一种。

[0014]优选地，所述核苷为腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷中的至少一种，所述核苷衍生物为单磷酸胞苷、环腺苷酸、单磷酸腺苷、鸟苷单磷酸、5-甲基硫代腺中的至少一种。

[0015]优选地，所述有机酸为苯甲酸、乙醇酸、琥珀酸、L-乳酸、酒石酸、莽草酸、高香草酸和半乳糖醛酸中的至少一种，所述脂肪酸为棕榈油酸、亚麻酸、亚油酸、蓖麻油酸、肉豆蔻酸、芥酸和戊烯二酸中的至少一种。

其中，蓖麻油酸具有镇痛和抗炎的作用；苯甲酸具有抑菌作用。

[0016]优选地，所述大豆发酵代谢物中还含有维他命的代谢物，所述维他命为维他命B1、B2、B3、B5、B6、E和H中的至少一种。

[0017]优选地，所述大豆发酵代谢物中还含有十六酰胺乙醇、5-氨基乙酰丙酸、白藜芦醇、山柰酚和橡精。

其中，十六酰胺乙醇是一种抗炎剂；白藜芦醇是一种抗炎症剂；橡精具有抗菌的作用。

[0018]在第二个方面，本发明提供了一种护肤品，所述护肤品含有上述的大豆发酵代谢物。

优选地，所述护肤品中添加有丁二醇或/和戊二醇；其中，丁二醇的主要作用在于防腐，而戊二醇的主要作用在于弱保湿。

[0019]在第三个方面，本发明提供了上述的大豆发酵代谢物的制备方法，包括如下步骤：[0020](1)采用日本黑豆，经过磨碎、加热、压榨得到豆奶；
[0021](2)对所述豆奶杀菌消毒后，接种多种细菌，在37℃下发酵120小时，消毒杀菌后获得未稀释的发酵液，即所述大豆发酵代谢物。

[0022]优选地，步骤(2)中多种细菌优选接种乳酸杆菌、双歧杆菌，以及乳酸肠球菌和嗜
热链球菌；其中，双歧杆菌为长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌中的至少一种；乳酸杆菌为嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、詹氏乳杆菌、类干酪乳杆菌类干酪亚种、加氏乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种、瑞士乳杆菌、乳酸乳球菌、干酪乳乳酸杆菌、鼠李糖乳杆菌和德式乳杆菌中的至少一种。

[0023]综上所述，本发明的有益效果为：
[0024]本发明的大豆发酵代谢产物对于改善皮肤菌群的多样性及质量、皮肤含水量和皮肤酸罩都有显著的作用；还可以避免皮肤有益物质的流失，维持皮肤菌群的平衡；还可以增强非特异性免疫的应答，防止皮肤的感染及炎症，并预防皮肤相关疾病，如瘙痒、痤疮、皮屑、发红和干燥等。

附图说明
[0025]图1为供试品冲洗皮肤对皮肤pH值的影响结果图；
[0026]图2为供试品对皮肤含水量的影响结果图；
[0027]图3为供试品对皮肤菌群多样性的影响结果图；
[0028]图4为供试品对表皮葡萄球菌丰度的影响结果图。

具体实施方式
[0029]本发明涉及植物发酵物技术领域，具体涉及大豆发酵代谢物在皮肤微生物群多样性方面的应用。

本发明的大豆发酵代谢物经乳酸杆菌及双歧杆菌发酵而得，很多效果优于常规大豆提取物，例如，可以调节皮肤微生物群多样性和相关皮肤参数的影响，尤其是：皮肤pH值、皮肤含水量、皮肤微生物多样性和皮肤表皮葡萄球菌的数量。

[0030]本发明大豆发酵的代谢产物，是由日本黑豆经过磨碎、加热、压榨得到的豆奶，杀菌消毒后接种多种乳酸杆菌菌株及双歧杆菌后，在37℃下发酵120小时，消毒杀菌后获得未稀释的发酵液，即本发明的大豆发酵代谢物，再通过过滤，得到的液体形式的代谢产物滤液，然后与水，丁二醇和戊二醇混合，得到可用于护肤的护肤品；其中含有多种代谢物，例如氨基酸及其衍生物，胺类，磷酸糖类，核苷，核苷化合物，有机酸以及脂肪酸等大类的化合物。

[0031]为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

如无特别说明，本申请中试剂、供试品的浓度均为质量浓度。

[0032]实施例1
[0033]本发明的大豆发酵代谢物的一种实施例，包括氨基酸及其衍生物、胺、磷酸糖、核苷、核苷衍生物、维他命代谢物、有机酸和脂肪酸；大豆发酵代谢物中还含有十六酰胺乙醇(1.526)、5-氨基乙酰丙酸(0.127)、白藜芦醇(0.002)、山柰酚(0.157)和橡精(0.007)。

[0034]其中，氨基酸为丙氨酸(15.212)、苏氨酸(2.03)、L-天冬酰胺(4.752)、L-瓜氨酸(0.576)、氧化谷胱甘肽(0.017)、色氨酸和精氨酸(0.19)，氨基酸衍生物为D-丙氨酰-D-丙氨酸(1.25)、羟甲基赖氨酸(0.024)、茶氨酸(4.752)、硫代脯氨酸(0.492)、氨基甲酰-DL-天冬氨酸(0.096)、N-乙酰谷氨酸(0.820)、2-甲基丝氨酸(0.528)和O-乙酰-L-丝氨酸(0.549)；胺为乙酰葡糖胺(0.826)、三甲胺(0.057)、N-乙酰胺(0.027)、二乙甲苯酰胺(0.273)、酰胆碱(0.124)、腐胺(0.025)和环己胺(0.831)；磷酸糖为D-葡萄糖-1-磷酸
(1.165)、葡萄糖-6-磷酸(0.673)和果糖-6-磷酸(1.59)；
[0035]核苷为腺苷(0.159)、鸟苷(0.544)、胞苷(0.218)和尿苷(0.121)；核苷衍生物为单磷酸胞苷(0.016)、环腺苷酸(0.287)、单磷酸腺苷(1.567)、鸟苷单磷酸(0.011)、5-甲基硫代腺(0.182)；有机酸为苯甲酸(0.566)、乙醇酸(0.324)、琥珀酸(8.81)、L-乳酸(1527.267)、酒石酸(0.649)、莽草酸(0.517)、高香草酸(0.556)和半乳糖醛酸(0.117)；脂肪酸为棕榈油酸(0.007)、亚麻酸(4.641)、亚油酸(7.239)、蓖麻油酸(0.027)、肉豆蔻酸(0.018)、芥酸(0.27)和戊烯二酸(0.547)；维他命包括维他命B1、其代谢物硫胺(0.396)，B2、其代谢物核黄素(0.235)，B3、其代谢物烟碱酸(1.712)，B5、其代谢物泛酸(0.09)，B6、其代谢物吡哆醇(0.254)，E、其代谢物生育酚(0.013)和H、其代谢物生物素(0.258)。

其中，化合物后括号内数字是指每100克大豆发酵代谢物中含有的该化合物的毫克数。

[0036]上述大豆发酵代谢物的制备方法，包括如下步骤：
[0037](1)采用日本黑豆，经过磨碎、加热、压榨得到豆奶；
[0038](2)对所述豆奶杀菌消毒后，接种乳酸杆菌、双歧杆菌、乳酸肠球菌和嗜热链球菌，在37℃下发酵120小时，消毒杀菌后获得未稀释的发酵液，即所述大豆发酵代谢物。

[0039]实施例2
[0040]本发明的大豆发酵代谢物的一种实施例，包括氨基酸及其衍生物、胺、磷酸糖、核苷、核苷衍生物、维他命代谢物、有机酸和脂肪酸；大豆发酵代谢物中还含有十六酰胺乙醇(2.002)、5-氨基乙酰丙酸(0.273)、白藜芦醇(0.007)、山柰酚(0.095)和橡精(0.018)。

[0041]其中，氨基酸为丙氨酸(13.608)、苏氨酸(2.26)、L-天冬酰胺(3.801)、L-瓜氨酸(0.881)、氧化谷胱甘肽(0.033)、色氨酸和精氨酸(0.33)，氨基酸衍生物为D-丙氨酰-D-丙氨酸(1.047)、羟甲基赖氨酸(0.074)、茶氨酸(4.246)、硫代脯氨酸(0.214)、氨基甲酰-DL-天冬氨酸(0.243)、N-乙酰谷氨酸(0.668)、2-甲基丝氨酸(0.153)和O-乙酰-L-丝氨酸(0.173)；胺为乙酰葡糖胺(0.201)、三甲胺(0.233)、N-乙酰胺(0.144)、二乙甲苯酰胺(0.064)、酰胆碱(0.366)、腐胺(0.140)和环己胺(0.288)；磷酸糖为D-葡萄糖-1-磷酸(0.637)、葡萄糖-6-磷酸(1.13)和果糖-6-磷酸(0.43)；
[0042]核苷为腺苷(0.046)、鸟苷(0.174)、胞苷(0.031)和尿苷(0.297)；核苷衍生物为单磷酸胞苷(0.202)、环腺苷酸(0.113)、单磷酸腺苷(1.104)、鸟苷单磷酸(0.204)、5-甲基硫代腺(0.027)；有机酸为苯甲酸(0.237)、乙醇酸(0.528)、琥珀酸(10.372)、L-乳酸(1962.986)、酒石酸(0.203)、莽草酸(0.154)、高香草酸(0.729)和半乳糖醛酸(0.073)；脂肪酸为棕榈油酸(0.021)、亚麻酸(5.241)、亚油酸(5.256)、蓖麻油酸(0.005)、肉豆蔻酸(0.043)、芥酸(0.03)和戊烯二酸(0.820)；维他命包括维他命B1、其代谢物硫胺(0.138)，B2、其代谢物核黄素(0.051)，B3、其代谢物烟碱酸(1.042)，B5、其代谢物泛酸(0.055)，B6、其代谢物吡哆醇(0.078)，E、其代谢物生育酚(0.001)和H、其代谢物生物素(0.102)。

其中，化合物后括号内数字是指每100克大豆发酵代谢物中含有的该化合物的毫克数。

[0043]上述大豆发酵代谢物的制备方法，包括如下步骤：
[0044](1)采用日本黑豆，经过磨碎、加热、压榨得到豆奶；
[0045](2)对所述豆奶杀菌消毒后，接种乳酸杆菌、双歧杆菌、乳酸肠球菌和嗜热链球菌，在37℃下发酵120小时，消毒杀菌后获得未稀释的发酵液，即所述大豆发酵代谢物。

[0046]实施例3
[0047]本发明的大豆发酵代谢物的一种实施例，包括氨基酸及其衍生物、胺、磷酸糖、核苷、核苷衍生物、维他命代谢物、有机酸和脂肪酸；大豆发酵代谢物中还含有十六酰胺乙醇(3.154)、5-氨基乙酰丙酸(0.416)、白藜芦醇(0.013)、山柰酚(0.055)和橡精(0.026)。

[0048]其中，氨基酸为丙氨酸(11.008)、苏氨酸(2.65)、L-天冬酰胺(2.553)、L-瓜氨酸(1014)、氧化谷胱甘肽(0.057)、色氨酸和精氨酸(0.65)，氨基酸衍生物为D-丙氨酰-D-丙氨酸(2.211)、羟甲基赖氨酸(0.519)、茶氨酸(2.369)、硫代脯氨酸(0.568)、氨基甲酰-DL-天冬氨酸(0.119)、N-乙酰谷氨酸(0.961)、2-甲基丝氨酸(0.438)和O-乙酰-L-丝氨酸(0.654)；胺为乙酰葡糖胺(0.875)、三甲胺(0.171)、N-乙酰胺(0.745)、二乙甲苯酰胺(0.256)、酰胆碱(0.885)、腐胺(0.082)和环己胺(0.941)；磷酸糖为D-葡萄糖-1-磷酸(0.355)、葡萄糖-6-磷酸(3.59)和果糖-6-磷酸(1.37)；
[0049]核苷为腺苷(0.157)、鸟苷(0.655)、胞苷(0.123)和尿苷(0.669)；核苷衍生物为单磷酸胞苷(0.851)、环腺苷酸(0.548)、单磷酸腺苷(3.578)、鸟苷单磷酸(0.991)、5-甲基硫代腺(0.011)；有机酸为苯甲酸(0.849)、乙醇酸(0.144)、琥珀酸(15.367)、L-乳酸(2234.681)、酒石酸(0.883)、莽草酸(0.679)、高香草酸(0.158)和半乳糖醛酸(0.254)；脂肪酸为棕榈油酸(0.155)、亚麻酸(12.336)、亚油酸(1.459)、蓖麻油酸(0.029)、肉豆蔻酸(0.355)、芥酸(0.08)和戊烯二酸(1.96)；维他命包括维他命B1、其代谢物硫胺(0.022)，B2、其代谢物核黄素(0.561)，B3、其代谢物烟碱酸(3.882)，B5、其代谢物泛酸(0.549)，B6、其代谢物吡哆醇(0.753)，E、其代谢物生育酚(0.029)和H、其代谢物生物素(0.755)。

其中，化合物后括号内数字是指每100克大豆发酵代谢物中含有的该化合物的毫克数。

[0050]上述大豆发酵代谢物的制备方法，包括如下步骤：
[0051](1)采用日本黑豆，经过磨碎、加热、压榨得到豆奶；
[0052](2)对所述豆奶杀菌消毒后，接种乳酸杆菌、双歧杆菌、乳酸肠球菌和嗜热链球菌，在37℃下发酵120小时，消毒杀菌后获得未稀释的发酵液，即所述大豆发酵代谢物。

[0053]实施例4
[0054]本发明中的护肤品的一种实施例，其中，含有实施例1、2或3的大豆发酵代谢物；将实施例1、2或3的大豆发酵代谢物过滤得到滤液，然后与水和戊二醇、丁二醇混合均匀，得到本实施例的护肤品。

[0055]实施例5大豆发酵代谢物的效果测试
[0056]为了测试大豆发酵的代谢产物应用到皮肤上的效果，例如可以改善皮肤的保水性，维持皮肤表面的低酸性状态，改善粗糙的皮肤纹理的机理，结合健康皮肤微生物群综合表征的价值，以了解其在皮肤病发病机理中的作用，本申请的发明人进行了相关的实验，设计了下述双盲、平行、安慰剂对照的单中心随机临床试验，来评估大豆发酵的代谢产物是否能有效改善皮肤微生物的多样性，维持皮肤健康，即大豆发酵的代谢产物是否能抑制金黄色葡萄球菌等病原菌的入侵，同时能够促进表皮葡萄球菌的生长。

下面对实验对象、供试品、实验过程、统计学考量和实验结果进行相应的说明。

[0057]1、实验对象
[0058]招募了20名年龄在25岁至50岁之间，健康状况良好的男性/女性；然后被随机地分配给两个治疗组(组2和组3)中的一个：其中，组1：安慰剂；组2：大豆提取物；组3：实施例2的大豆发酵代谢物。

[0059]在每个实验小组中，有10名参与者被录取，所有的研究对象都完成了这项研究。

30个实验对象的样本量足以证明实施例2的大豆发酵代谢物在普通受试者中能有效改善皮肤微生物的多样性，维持皮肤健康。

[0060]2、供试品
[0061] 2.1供试品说明
[0062]供试品为含有2％的实施例2的大豆发酵代谢物，或2％的大豆提取物，或一种安慰剂的身体乳。

[0063] 2.2包装
[0064]供试品包含供4周用的身体乳，管状包装。

[0065]供试品贴以数字编号。

安慰剂对照组中仅发放空白身体乳供试品，实验组分发两盒供试品，一盒为含2％大豆发酵代谢产物的身体乳，另一盒为含2％大豆提取物的身体乳。

[0066] 2.3盲法设计
[0067]所有供试品由发明人设盲。

每个受试者设一个编号，随机分入各组(配置比例为1: 1)。

所有受试者、后勤及研究员均无法得知特定供试品的信息。

只有发明人及独立的审计团队知晓受试者编号及供试品编号。

[0068] 2.4受试者的监察
[0069]每位受试者均发有一张包含日期与时间的记录卡，用于记录每日涂抹身体乳。

要求受试者记录每天使用身体乳的详细日期与时间。

受试者应记录在研究过程中观察到的任何症状或反应。

[0070]研究团队每天打电话和发电子邮件提醒、追踪受试者的服从情况，并询问他们的反应和问题。

该研究协调员在亲自打电话和与志愿者交谈后，在供试品应用合规性表单上签注。

[0071]3、实验过程
[0072]所有的受试者都被要求每天使用一次身体乳直到4周完成实验，所有的参数在开始时采集作为基线，同时在实验结束时采集。

通过对健康受试者皮肤细菌的16S小亚基核糖体RNA基因进行测序，完成了对皮肤中微生物的复杂性和同一性的评估。

为了对所有层次的皮肤进行调查，采集样本使用了三种方法：拭子、刮伤和穿刺活检。

实验共进行两次评估，分别在使用含大豆发酵代谢产物的身体乳之前以及实验结束后。

与实验开始时相比，在实验结束时，皮肤微生物的多样性得到了提高，皮肤状况也得到了改善。

[0073] 3.1皮肤pH值测定
[0074]所有的测量都是在恒定的温度和湿度(23℃，相对湿度30％)的情况下，在两个正常男性受试者(A和B)的左前臂的同一区域进行的。

受试者被要求休息15分钟，前臂暴露在外，手腕接地，以减少噪音。

[0075]皮肤表面的pH值由一个皮肤pH计(PH900,Courage+Khazaka Electronic GmbH, Germany)测定。

玻璃探针有一个平面的表面膜，带有一个参比接触点，并使用了pH值为4.01和6.86的缓冲溶液进行校准。

在每一次测量时，电极都用乙醇和去离子水冲洗干净。

共测定5次，去除最大值和最小值，取剩下3次的平均值。

[0076] 3.2皮肤含水量
[0077]皮肤含水量是通过皮肤水分测试仪(CM825,Courage+Khazaka Electronic GmbH,
Germany)测定。

测试仪测定的皮肤深度为10-20μm。

皮肤水分蒸发是通过保持探针与皮肤接触120秒，监测水含量来实现的。

[0078] 3.3人类皮肤微生物多样性评估
[0079](1)抽样
[0080]要求受试者在采样前8小时内不要用任何东西(包括水)来洗手。

研究人员在每个样本采集时均戴着无菌手套。

[0081]三个样本(拭子、刮擦、穿刺活检)都是在皮肤的不重叠区域收集的，没有对皮肤表面进行预先清洗或其他准备。

所有的样品都储存在-80℃条件中备用。

[0082](2)DNA提取和纯化
[0083]所有的生物标本首先在酶解缓冲液和溶菌酶，在37℃中孵育30分钟。

样品在56℃条件下，放入内源DNA提取试剂盒提供的AL缓冲液及K蛋白酶中孵育过夜。

所有步骤均按试剂盒标准程序操作。

纯化后的基因组DNA被重新悬浮在100μL的缓冲液AE中，并在-20℃条件下储存。

[0084](3)对样本中存在的总细菌数量进行定量
[0085]采用聚合酶链PCR扩增反应法，使用正向引物63F(5-GCAGGCCTAACACATGCAAGTC-3)和反向引物355R(5-CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3)扩增了细菌16S基因的一部分，产生一个292个碱基对的PCR片段。

通过连续稀释已知数量的大肠杆菌细胞来构建了一个标准曲线。

每25μL反应液包括12.5μL实时荧光定量PCR预混液(Invitrogen赛默飞世尔)，0.25μL MgCl2 (50mM)，0.5μL Rox Dye染料，0.25μL各个引物(20μM)，6.25μL水和5μL DNA。

采取循环条件，用于计算拷贝数的函数如下：Ct＝3.42x+34.06，R2＝0.99；Ct为阈值循环，x为log拷贝数。

样本拷贝数的计算被调整为与采样的表面积相对应。

[0086](4)16S rRNA基因的PCR扩增
[0087]利用引物8F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1391R(5-GACGGGCGGTGTGTRCA-3)从纯化的基因组DNA中扩增16S rRNA基因。

[0088]每50μL反应液含以下配方：5.0μL含MgCl2的10×缓冲液，1μL dNTP混合液(每种10毫摩尔)，1μL引物(20微摩尔)，3μL DMSO(二甲基亚砜)，4μL细菌基因组DNA，0.5μL罗氏热启动Taq DNA 高保真聚合酶。

对于每个DNA样本，都进行了3次复制扩增。

热循环如下：95℃初始变性5分钟，接着30秒95℃变性25-30个循环，在55℃退火30秒，在72℃延伸1.5分钟，最后在72℃延伸10分钟。

循环数是根据案例基础的一个案例来确定的，当停止时，扩增仍然在反应的线性范围内，但是已经克隆得到的足够多的PCR产物(通常是25-30个循环)。

PCR产物用琼脂糖凝胶分离后，用刀片取出与1.3kb对应的条带。

每次扩增均设置阴性对照组，每一组阴性对照组均无扩增产物。

PCR产物根据试剂盒说明，使用Qiaquick凝胶提取工具包(Qiagen)提取，并被重悬于30μl的EB缓冲液中，在-20摄氏度条件下储存。

[0089](5)克隆和测序16S rDNA PCR产物
[0090]PCR产物被克隆到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)上。

收集每个连结的菌落得总共192个，质粒DNA纯化，使用M13引物在ABI 3730x1测序仪上(Applied Biosystems Inc.)双向插入质粒片段进行测序。

谱图数据的质量和数量由phred Q20软件进行评估，交叉匹配筛选后剩余非载体序列数据。

使用phred从色谱图中提取序列，并组装双向碱基对。

通过交叉匹配检测到的矢量序列被修剪掉。

仅进一步研究大于1250bp的组装序列。

筛选组件的质量，。