双向电泳蛋白样品的制备
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〔3〕参加与酚一样体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一 次，总共6次，4℃，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的 15mL离心管中。重复一次苯酚抽提。
〔4〕参加最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进展沉淀，充分 振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20℃沉淀过夜。
双向电泳样本制备
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双向电泳样品制备：
一、蛋白质提取原那么：
二、样本裂解方式：
三、2D蛋白裂解液组成及作用： 1：裂解液组成及作用 2：常见裂解液
四、蛋白质提取步骤：
五、蛋白质样本制备实例： 1：动物组织样本制备 2：植物组织样本制备
醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanol
用甲醇配制0.1M的醋酸铵
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以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使溶解度降低而重新沉 淀下来。使用浓度范围10~100 mmol/L.
b: 采用非离子复原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶 解性，并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳 定性和不溶性，使其在第一向IEF中维持蛋白质复原状态是相对无效的。 因此在IEF时建议最好使用巯基复原剂。
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
2、去垢剂： (1) 作用：破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。
(2) 种类： a: 非离子去垢剂：triton X-100, NP-40 b: 两性离子去垢剂： CHAPS,CHAPSO SB3-10(不溶于浓度高于5mol/L的脲中〕 ASB(具有比CHAPS更强的膜蛋白溶解力〕 c: 阴离子去垢剂：SDS〔小于0.25%，同时确保其他去垢剂与
五、双向电泳样本制备实例——植物样本
〔1〕植物样本置于研钵中，迅速参加液氮进展研磨，直至组织变成粉末，均 匀而没有明显颗粒即可，在研钵中参加一小勺PVPP〔用于吸附植物组织破 碎后释放出的酚类物质〕，用药勺将粉末转移至50mL离心管中。
〔2〕在50mL离心管中参加8mL提取液混匀，再参加8mLTris饱和酚，充分振荡 后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4℃5000r/min，离30min， 此时溶液会分层，下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL 离心管中。
脲、硫脲、两者的混合物
破坏氢键等次级键，使肽 链链伸展，暴露疏水中心
去垢剂
非离子去垢剂、两性离子去垢剂、阴 破坏蛋白质分子间的疏水相
离子去垢剂
互作用。
还原剂
β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）,
TBP
断裂蛋白质中的二硫键， 以利于肽链的分离
蛋白酶抑制 PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制剂，
Benzamidine
抑制丝氨酸蛋白酶。
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三、双向电泳样本制备简要实验步骤
1、 提取前准备： 〔1〕: 提取总蛋白，亚细胞蛋白； 〔2〕: 裂解细胞的方式选择； 〔3〕: 裂解液的选择。
，收集上清蛋白。
4、 用于二维电泳时，考虑是否有必要除去干扰物质，如核酸， 脂类，盐等。
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五、双向电泳样本制备实例——动物样本
〔1〕将组织切细后置于研钵中，迅速参加液氮进展研磨，直至组织变成粉 末，均匀而没有明显颗粒即可。
〔2〕在研钵中参加800μLB〔使用前参加1× PMSF〕，充分溶解〔收集〕 粉末后转移至1.5mLEP管中，4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液。
(5)在枯燥后的蛋白质团块中参加相应量的RB〔具体参加量视蛋白团块大小 而定〕，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太 过枯燥的蛋白质团块〔呈透明状〕，可用50μL移液器调至10μL刻度处，吸 上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至 看不到明显的蛋白质团块为止。4℃，12000r/min，离心20min，吸出上清液， 转移至新的EP管中。
〔5〕对沉淀过夜的蛋白质4℃，5000r/min，离心30min，倒掉上清液，参加 5mL甲醇对蛋白进展洗涤，反复吹打均匀后，4℃，5000r/min，离心30min。 重复一次。
五、双向电泳样本制备实例：
〔6〕参加4mL丙酮对蛋白进展洗涤，反复吹打均匀后，4℃，5000r/min， 离心30min。重复一次操作。参加3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3 支1.5mLEP管中，4℃，12000r/min，离心20min。倒去上清液后，平放于干 净的纸巾上自然枯燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80℃保存备用。
六、样本制备试剂：
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一、双向电泳样本制备原那么
1: 蛋白质制备主要目的： (1)：细胞，组织的破碎裂解 (2)：蛋白质溶解以及破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与 非蛋白质之间的共价与非共价相互作用
2: 蛋白质制备主要遵循的原那么： (1)：尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的共价结合，使 蛋白质以别离的多肽形式存在。 (2)：防止蛋白质的修饰作用与蛋白质的降解作用。 (3)：防止脂类、核酸、盐等物质的干扰作用。 (4): 去除高丰度蛋白对低分度蛋白的掩盖作用。 (5): 防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。 (6)：蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
(7)在枯燥后的蛋白质团块中参加相应量的RB〔具体参加量视蛋白团块大 小而定〕，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对 于太过枯燥的蛋白质团块〔呈透明状〕，可用50μL移液器调至10μL刻度 处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处 理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4℃，12000r/min，离心20min， 吸出上清液，转移至新的EP管中。
2%(W/V)
Phenol extraction buffer
Reagent Sucrose (FM 342.30）
KCl（FM 74.55） EDTA（FM 292.25） Tris（FM 121.14）
HCl
Final concentration 0.7M 0.1M 50mM 0.5M
To pH7.5
剂
磷酸酶酶抑制剂
抑制蛋白酶活性
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
1、变性剂：
(1) 作用：改变或破坏氢键等次级键的构造，使蛋白质的肽链伸展 开来，充分暴露疏水中心。
(2) 分类：脲，硫脲，或两者的混合物可以增加蛋白质的溶解性，特 别是膜蛋白。必须防止将含有尿素的溶液加热到30度以上， 因为这样会使其水解为氰酸盐，修饰蛋白质，改变蛋白质的 电荷。
机械匀桨法： 固体组织
可用手动匀浆器或电动匀浆器能来破碎细胞悬浮液或较柔 软的组织。
滚珠粉碎法：
细胞悬浮液 微生物
旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内含物 。
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
组成
种类
作用
变性剂
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六、双向电泳样本制备试剂
Alklysis buffer(LB) Reagent Tris
Thiourea (FW 76.12) Urea (FW 60.06) CHAPs (FW 64.89)
Final concentration 20mM 2M 7M
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
4、蛋白酶抑制剂的种类及作用：
种类
作用
PMSF
不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶
EDTA，EGTA
多肽蛋白酶抑 制剂
磷酸酶抑制剂
可逆的蛋白酶抑制剂（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂） 逆的蛋白酶抑制剂（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂） 抑制磷酸酶活性
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二、双向电泳样本裂解方式——温和裂解方式
破碎的方法 渗透裂解 冻融裂解
去垢剂裂解
酶裂解
适用材料
血细胞 组织培养细 胞
细菌细胞 组织培养细 胞
原理 将细胞悬浮在低渗透液中裂解细胞。
利用液氮将细胞迅速冻结后再融化。如果需要， 可反复进行。
〔3〕超声处理，破碎核酸。每个EP管超声3次，每次5～8下，然后进展离心， 4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液。
〔4〕将上清液分装成3管，每管约250μL，每管再参加1mL丙酮-20℃沉淀过 夜。沉淀完的蛋白质于4℃，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放 于干净的纸巾上自然枯燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80℃保存备用。
SDS的比例至少为8：1〕
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
3、复原剂： (1) 作用：断裂蛋白质中的二硫键，以利于肽链的别离。
(2) 分类: β-巯基乙醇，二硫苏糖醇〔DTT〕,二硫赤藓糖〔DTE〕 a: 其中DTT带有电荷，在等点聚焦时，常常会迁移到PH范围
组织培养细 胞
去污剂能溶解细胞的细胞膜从而破坏细胞。注： 如果使用了诸如SDS这样的离子型去污剂，为了确 保不干扰IEF，可将裂解的样品在含有过量的非离 子或兼性去污剂的溶液中稀释或利用沉淀法, 除去 SDS。
植物组织 细菌细胞 真菌细胞
在等渗透液溶液中用酶处理细胞。如溶菌酶用于 细菌细胞；纤维素酶和果胶酶用于植物细胞）。
二、双向电泳样本裂解方式——剧烈裂解方式
破碎方法 适用材料 超声波法： 细胞悬浮液
原理
通过超声波发生器产生的超声波剪切力将细胞破碎，但必 须注意减少热量的产生和泡沫的形成。
高压法：
带细胞壁的 在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切力破碎细
微生物
胞
研磨法：
固体组织 微生物
利用研杵手工将它们破碎
〔4〕参加最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进展沉淀，充分 振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20℃沉淀过夜。
双向电泳样本制备
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双向电泳样品制备：
一、蛋白质提取原那么：
二、样本裂解方式：
三、2D蛋白裂解液组成及作用： 1：裂解液组成及作用 2：常见裂解液
四、蛋白质提取步骤：
五、蛋白质样本制备实例： 1：动物组织样本制备 2：植物组织样本制备
醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanol
用甲醇配制0.1M的醋酸铵
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以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对，使溶解度降低而重新沉 淀下来。使用浓度范围10~100 mmol/L.
b: 采用非离子复原剂三丁基膦TBP可以大大增加蛋白质的溶 解性，并利于蛋白从第一向转移到第二向。但是TBP在水溶液中的不稳 定性和不溶性，使其在第一向IEF中维持蛋白质复原状态是相对无效的。 因此在IEF时建议最好使用巯基复原剂。
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
2、去垢剂： (1) 作用：破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。
(2) 种类： a: 非离子去垢剂：triton X-100, NP-40 b: 两性离子去垢剂： CHAPS,CHAPSO SB3-10(不溶于浓度高于5mol/L的脲中〕 ASB(具有比CHAPS更强的膜蛋白溶解力〕 c: 阴离子去垢剂：SDS〔小于0.25%，同时确保其他去垢剂与
五、双向电泳样本制备实例——植物样本
〔1〕植物样本置于研钵中，迅速参加液氮进展研磨，直至组织变成粉末，均 匀而没有明显颗粒即可，在研钵中参加一小勺PVPP〔用于吸附植物组织破 碎后释放出的酚类物质〕，用药勺将粉末转移至50mL离心管中。
〔2〕在50mL离心管中参加8mL提取液混匀，再参加8mLTris饱和酚，充分振荡 后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4℃5000r/min，离30min， 此时溶液会分层，下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL 离心管中。
脲、硫脲、两者的混合物
破坏氢键等次级键，使肽 链链伸展，暴露疏水中心
去垢剂
非离子去垢剂、两性离子去垢剂、阴 破坏蛋白质分子间的疏水相
离子去垢剂
互作用。
还原剂
β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT）,
TBP
断裂蛋白质中的二硫键， 以利于肽链的分离
蛋白酶抑制 PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制剂，
Benzamidine
抑制丝氨酸蛋白酶。
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三、双向电泳样本制备简要实验步骤
1、 提取前准备： 〔1〕: 提取总蛋白，亚细胞蛋白； 〔2〕: 裂解细胞的方式选择； 〔3〕: 裂解液的选择。
，收集上清蛋白。
4、 用于二维电泳时，考虑是否有必要除去干扰物质，如核酸， 脂类，盐等。
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五、双向电泳样本制备实例——动物样本
〔1〕将组织切细后置于研钵中，迅速参加液氮进展研磨，直至组织变成粉 末，均匀而没有明显颗粒即可。
〔2〕在研钵中参加800μLB〔使用前参加1× PMSF〕，充分溶解〔收集〕 粉末后转移至1.5mLEP管中，4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液。
(5)在枯燥后的蛋白质团块中参加相应量的RB〔具体参加量视蛋白团块大小 而定〕，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对于太 过枯燥的蛋白质团块〔呈透明状〕，可用50μL移液器调至10μL刻度处，吸 上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至 看不到明显的蛋白质团块为止。4℃，12000r/min，离心20min，吸出上清液， 转移至新的EP管中。
〔5〕对沉淀过夜的蛋白质4℃，5000r/min，离心30min，倒掉上清液，参加 5mL甲醇对蛋白进展洗涤，反复吹打均匀后，4℃，5000r/min，离心30min。 重复一次。
五、双向电泳样本制备实例：
〔6〕参加4mL丙酮对蛋白进展洗涤，反复吹打均匀后，4℃，5000r/min， 离心30min。重复一次操作。参加3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3 支1.5mLEP管中，4℃，12000r/min，离心20min。倒去上清液后，平放于干 净的纸巾上自然枯燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80℃保存备用。
六、样本制备试剂：
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一、双向电泳样本制备原那么
1: 蛋白质制备主要目的： (1)：细胞，组织的破碎裂解 (2)：蛋白质溶解以及破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与 非蛋白质之间的共价与非共价相互作用
2: 蛋白质制备主要遵循的原那么： (1)：尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的共价结合，使 蛋白质以别离的多肽形式存在。 (2)：防止蛋白质的修饰作用与蛋白质的降解作用。 (3)：防止脂类、核酸、盐等物质的干扰作用。 (4): 去除高丰度蛋白对低分度蛋白的掩盖作用。 (5): 防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀。 (6)：蛋白质样品与第一向电泳的相容性。
(7)在枯燥后的蛋白质团块中参加相应量的RB〔具体参加量视蛋白团块大 小而定〕，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。对 于太过枯燥的蛋白质团块〔呈透明状〕，可用50μL移液器调至10μL刻度 处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处 理，直至看不到明显的蛋白质团块为止。4℃，12000r/min，离心20min， 吸出上清液，转移至新的EP管中。
2%(W/V)
Phenol extraction buffer
Reagent Sucrose (FM 342.30）
KCl（FM 74.55） EDTA（FM 292.25） Tris（FM 121.14）
HCl
Final concentration 0.7M 0.1M 50mM 0.5M
To pH7.5
剂
磷酸酶酶抑制剂
抑制蛋白酶活性
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
1、变性剂：
(1) 作用：改变或破坏氢键等次级键的构造，使蛋白质的肽链伸展 开来，充分暴露疏水中心。
(2) 分类：脲，硫脲，或两者的混合物可以增加蛋白质的溶解性，特 别是膜蛋白。必须防止将含有尿素的溶液加热到30度以上， 因为这样会使其水解为氰酸盐，修饰蛋白质，改变蛋白质的 电荷。
机械匀桨法： 固体组织
可用手动匀浆器或电动匀浆器能来破碎细胞悬浮液或较柔 软的组织。
滚珠粉碎法：
细胞悬浮液 微生物
旋转玻璃球的摩擦作用能破坏细胞壁，并释放细胞的内含物 。
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
组成
种类
作用
变性剂
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六、双向电泳样本制备试剂
Alklysis buffer(LB) Reagent Tris
Thiourea (FW 76.12) Urea (FW 60.06) CHAPs (FW 64.89)
Final concentration 20mM 2M 7M
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
4、蛋白酶抑制剂的种类及作用：
种类
作用
PMSF
不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶
EDTA，EGTA
多肽蛋白酶抑 制剂
磷酸酶抑制剂
可逆的蛋白酶抑制剂（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂） 逆的蛋白酶抑制剂（如亮抑蛋白酶肽，胃蛋白酶抑制剂） 抑制磷酸酶活性
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二、双向电泳样本裂解方式——温和裂解方式
破碎的方法 渗透裂解 冻融裂解
去垢剂裂解
酶裂解
适用材料
血细胞 组织培养细 胞
细菌细胞 组织培养细 胞
原理 将细胞悬浮在低渗透液中裂解细胞。
利用液氮将细胞迅速冻结后再融化。如果需要， 可反复进行。
〔3〕超声处理，破碎核酸。每个EP管超声3次，每次5～8下，然后进展离心， 4℃，12000r/min，离心20min，收集上清液。
〔4〕将上清液分装成3管，每管约250μL，每管再参加1mL丙酮-20℃沉淀过 夜。沉淀完的蛋白质于4℃，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放 于干净的纸巾上自然枯燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80℃保存备用。
SDS的比例至少为8：1〕
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
3、复原剂： (1) 作用：断裂蛋白质中的二硫键，以利于肽链的别离。
(2) 分类: β-巯基乙醇，二硫苏糖醇〔DTT〕,二硫赤藓糖〔DTE〕 a: 其中DTT带有电荷，在等点聚焦时，常常会迁移到PH范围
组织培养细 胞
去污剂能溶解细胞的细胞膜从而破坏细胞。注： 如果使用了诸如SDS这样的离子型去污剂，为了确 保不干扰IEF，可将裂解的样品在含有过量的非离 子或兼性去污剂的溶液中稀释或利用沉淀法, 除去 SDS。
植物组织 细菌细胞 真菌细胞
在等渗透液溶液中用酶处理细胞。如溶菌酶用于 细菌细胞；纤维素酶和果胶酶用于植物细胞）。
二、双向电泳样本裂解方式——剧烈裂解方式
破碎方法 适用材料 超声波法： 细胞悬浮液
原理
通过超声波发生器产生的超声波剪切力将细胞破碎，但必 须注意减少热量的产生和泡沫的形成。
高压法：
带细胞壁的 在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切力破碎细
微生物
胞
研磨法：
固体组织 微生物
利用研杵手工将它们破碎