泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用

Vol. 49 No. 4
Apr. 2021
第49卷第4期2021年4月西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of Northwest A&F University(Nat. Sci. Ed.)网络出版时间：2020-11-04 11：25 DOI ：10. ）3207/j. cnki. jnwafu. 2021 04 003网络出版地址：https ://Ins . cnki. net/kcms/detai//61. 1390. S. 20201103. 0943. 003. html
泛素结合酶UBE
2T 基因在布鲁氏菌
感染过程中的作用
印双红1a ,张俊波lb!c ,易萌"，蔡春连"，张红"，王丽蓉"，陆安法2,陈创夫3 （1铜仁学院a 大健康学院，b 贵州省梵8山地区生物多样性保护与利用重点实验室（农林工程与规划学院，贵州铜仁554300；
2铜仁市动物疫病预防控制中心，贵州铜仁554300；石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000）
［摘要］【目的】探讨泛素结合酶E2TCUBE2T ）在布鲁氏菌感染过程中的功能。

【方法】构建UBE 2T 基因过
表达载体 吐V X-puro-UBE2T ,对其进行PCR 和E c o R I /Ba+H I 双酶切验证，并将其转染小鼠巨噬细胞
RAW264.7,利用实时荧光定量PCR （qRT-PCR ）检测UBE 2T 基因过表达效果）设计并合成3条UBE 2T 基因沉默
表达的 siRNA （UBE 2T -379-siRNA,UBE 2T -599-siRNA 和 UBE 2T -661-siRNA ），将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7, 利用qRT-PCR 检测UBE 2T 基因沉默表达效果。

采用四甲基偶氮哩盐（MTT ）试验，检测UBE 2T 沉默或过表达对
RAW264. 7细胞活性的影响）利用qRT-PCR ，检测M5-90感染对RAW264. 7细胞UBE 2T 基因相对表达量的影响，
以及对过表达或沉默表达UBE 2T 基因的RAW264. 7细胞中含pyrin 结构域NOD 样受体家族3CNLRP3）和半胱氨 酸天冬氨酸蛋白水解酶KCaspase-1）基因相对表达量的影响。

用布鲁氏菌M5-90菌株感染过表达和沉默UBE 2T 基
因的RAW264. 7细胞，用活菌计数法检测UBE 2T 沉默或过表达对RAW264. 7细胞内布鲁氏菌增殖的影响，利用相 应的试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶（LDH ）水平、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase -3）活性及白细胞介素6（IL-
6） JL-18JL-1&和'-干扰素（IFN-）等细胞因子的水平）【结果】成功构建了 UBE 2T 基因过表达载体pLVX-puro-
UBE2T,过表达效果良好。

3条siRNA 中,UBE 2T -661-siRNA 的干扰效果最佳，其对UBE 2T 基因的沉默效率为 84%）UBE 2T 沉默或过表达对RAW264. 7细胞活性无影响）M5-90感染可提高RAW264. 7细胞UBE 2T 的表达
量；沉默UBE 2T 可提高M5-90介导的NLRP 3 Caspas@1的表达，而过表达UBE 2T 会抑制M5-90介导的NLRP 3
表达，提高M5-90介导的Caspa%1表达）沉默表达UBE 2T 可抑制胞内M5-90的增殖，而过表达UBE 2T 可促进胞 内M5-90的增殖）沉默表达UBE 2T 可抑制M5-90介导的LDH 水平，提高Caspas@3活性及IFN-'JL-6和IL1&水
平；而过表达UBE 2T 可提高M5-90介导的LDH 水平，抑制Caspas@3的活性及IFN-'JL-邛水平）【结论+泛素结 合酶UBE2T 对胞内布鲁氏菌增殖具有正调控作用）
［关键词］布鲁氏菌；泛素结合酶E 2T 基因；RNA 干扰；真核表达;胞内增殖
［中图分类号］S855.99；Q78 ［文献标志码］A ［文章编号］1671-9387（2021）04-0019-10
Role of ubiquiti nase-bi nding en zyme UBE
2T gene in Brucella in feet io n
YIN Shuanghong" , ZHANG Junbo l b ，c , YI Meng" , CAI Chunlian" , ZHANG Hong"，
WANG Lirong" ,LU Anfa 2 ,CHEN Chuangfu 3
(1 a College o' One Health ，b Guizhou Provincial Key laboratory o' Biodiversity Conservation and Utilization in the
Fanjing Mountain Region , c College o' Agro'oresiry Engineering and Planning ，Tongren University ，Tongren ，Guizhou 554300，China ；2 Tongren Animal Disease Prevention and Control Center ，Tongren ，Guizhou 554300 , China ； 3 College o' Animal Science and Technology ，
Shihezi University ，Shihezi ，Xinjiang 832000 , China )
［收稿日期& 2020-04-19
［基金项目&贵州省教育厅青年科技人才成长项目（黔教合KY 字：2017］312）；贵州省高层次创新人才培养项目（2018-（2016）022）
国家自然科学基金项目（1502067）铜仁学院贵州省梵净山地区生物多样性保护与利用重点实验室项目（黔科合平台 人才 %020］2003）
［作者简介&印双红（1986-），女，贵州松桃人，副教授，硕士，主要从事病原微生物的感染与免疫研究。

E-mail :y S h _hong2006@163. com ［通信作者&张俊波（1984-），男，河南西华人，教授，博士，主要从事动物传染病研究。

E-mail ：zhangjunbo666@126. com
20西北农林科技大学学报(自然科学版)第49卷
Abstract:[Objective!This study aimed to investigate functions of ubiquitin binding enzyme E2T (UBE2T)during Brucella infection.【Method】The pLVX-puro-UBE2T vector of overexpression of UBE2T gene was constructed and verified by PCR and EcoK%/BamR%double enzyme before being transfected into mouse macrophage RAW264.7cells.The effects of overexpression of UBE2T gene were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR).Three silence siRNAs of UBE2T gene (UBE2T-661-siRNA,UBE2T-379-siRNA and UBE2T-599-siRNA)were designed and synthesized,and transfected into mouse macrophage RAW264.7cells.The effects of silence of UBE2T gene were also detec­ted by qRT-PCR.The effects of overexpression and silence of UBE2T gene on activity of RAW264.7cells were measured by MTT assay.The effects of M5-90infection on the relative expression of pyrin domain NOD-like receptor family3(NLRP3)and cysteine aspartic proteolytic enzyme1(Caspase-1)in RAW264.7cells of overexpression and silence of UBE2T gene and on the relative expression of UBE2T in normalRAW264.7ce l s were then determ8ned.After RAW264.7ce l sofoverexpress8onandslenceof UBE2T gene were infected with Brucella M5—90,the effects of overexpression or silence of UBE2T gene on intracellular proliferation of M5-90were measured by living bacteria counting method.The levels of lactate dehydrogenase(LDH)and activity of cysteine aspartic acid proteolytic enzyme3(Caspase-3)and levels of interleukin6(IL-6)and IL-1L,IL-1&,and'-gamma interferon(IFN-')were measured by corresponding kits.[Result!The pLVX-puro-UBE2T vector of overexpression of UBE2T gene was successfully construc­ted with good overexpression.Among the3siRNAs,UBE2@661-siRNA had the best interference effect and its silence efficiency of UBE2T gene was84%.The overexpression or silence of UBE2T gene had no e f ect on activity of RAW264.7ce l3.The expre33ion of UBE2T in RAW264.7ce l3with infection of M5­90was increased.The expression of M5-90-mediated NLRP3and Caspase1was increased by silence of UBE2T gene,while the expression of M5-90-mediated NLRP3was inhibited and that of M5-90-mediated Caspas@1was increased by overexpression of UBE2T gene.The intracellular proliferation of M5-90was inhibited by silence of UBE2T gene,while that was promoted by overexpression of UBE2T gene.The level of M5-90-mediated LDH was inhibited and M5-90-mediated activity of Caspase3and levels of IFN-',IL-6 and IL-1&were increased by silence of UBE2T gene.The level of M5-90-mediated LDH were increased and activity of Caspas@3and levels of IFN-'and IL1&were inhibited by overexpression of UBE2T gene. [Conclusion!Ubiquitin binding enzyme UBE2T had positive regulatory effects on intracellular proliferation of Brucella.
Key words:Br-eUa；UBE2T gene；RNA interference；eukaryotic expression；intracellular proliferation
布鲁氏菌病是一种在全世界范围内广泛分布的人畜共患传染病［1］，家畜患病可引起生殖系统疾病,常引起流产、不孕、空怀等；人感染布鲁氏菌后可引发关节炎、脑膜炎、心肌膜炎等，表现为持续性感染)目前，人们对布鲁氏菌的致病机制还不清楚)泛素(ubiquitin,Ub)是一种蛋白质，广泛存在于真核细胞中，由76个氨基酸构成，分子质量较小，而且氨基酸序列高度保守，从酵母细胞到人类只相差3个氨基酸泛素化修饰是蛋白质翻译后修饰的重要形式，泛素化过程需要泛素激活酶(ubiquitin activation enzyme,E1)、泛素结合酶(ubiquitin con­jugation enzyme,E2)和泛素连接酶(ubiquitin pro­tein ligase,E3)3种酶的参与，其中泛素结合酶E2T (ubiquitin-conjugating enzyme e2t,UBE2T)是E2家族成员之一，其有一个16〜18ku的保守结构域(泛素结合结构域)，延伸序列在C末端，属泛素家族中的第二类结合酶。

大量研究证明，细胞内UBE2T表达增高在肿瘤的发生、发展中起重要作用,与乳腺癌4、肝癌％&、骨髓癌及肺癌等的发生发展关系密切。

泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasomesys-tem,UPS)被有些病毒利用，参与病毒感染、增殖、释放与免疫逃逸等各个阶段％9,例如羊口疮病毒可利用某种机制干预UPS的信号调控途径，有效抑制胞内信号传导和CD8+T细胞活化，以庇护病毒粒子成熟和释放［10］)
第4期印双红，等：泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用21
E2在胞内菌李氏特菌的增殖中起着重要的调节作用［11］，本课题组前期研究表明，类泛素SUM0-1影响胞内布鲁氏菌的增殖［12］,由于E2在类泛素SUM0-1修饰中发挥重要作用，因此笔者推测E2在布鲁氏菌增殖过程中也发挥着重要作用。

本研究以UBE2T为研究对象，对其进行沉默和过表达，研究UBE2T在布鲁氏菌感染过程中的作用，旨在为布鲁氏菌的致病机制研究提供参考。

1材料与方法
1.1材料
胎牛血清和0p8MEM细胞培养液，购自GIB-C0公司；酵母提取物和蛋白％，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；曲拉通X-100(TritonX-100)细胞裂解液、小鼠白细胞介素K(I［-K),白细胞介素18(IL18)、'-干扰素(IFN-7)和白细胞介素-邛(IL1&)ELISA试剂盒，均购自上海依科赛生物制品有限公司；SYBRGreen I荧光染料，购于罗氏公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性检测试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒，购自碧云天生物技术公司；小鼠巨噬细胞RAW264.7,购于北纳生物科技有限公司；转染试剂Lipofectamine RNAiMAX、Lipofectamine2000和总RNA提取试剂Trizol，购自Invitrogen公司。

羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90,由新疆地方与民族高发病教育部重点实验室提供;pLVX-puro载体和大肠杆菌DH5a,由梵净山特色动植物资源重点实验室保存。

1.2UBE2T基因过表达RAW264.7细胞的构建1.
2.1过表达载体pLVX-puro-UBE2T的构建
通过NCBI获得小鼠UBE2T基因序列(GenBank 登录号:NM_026024.3)，引入EcoR I/BamH I酶切位点，送通用生物系统(安徽)有限公司合成基因片段。

将合成的UBE2T基因片段与pLVX-puro 载体进行连接(16°C连接过夜)，构建UBE2T基因过表达质粒pLVX-puro-UBE2T。

将pLVX-puro-UBE2T转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，37 C摇床培养1〜2h,8000r/min离心2min,弃上清,沉淀均匀涂布于氨节青霉素(Amp「)抗性平板(Amp含量100g/mL),于37°C培养过夜。

提取质粒p LVX-p uro-UBE2T,进行PCR和E c o R I/ B a m H I双酶切验证。

设计pLVX-puro载体和p LVX-p uro-UBE2T 的共同检测引物：F.5^CACGCTGTTTTGAC-CTCCAT-3',R.5Z-GGATGTGGAATGTGTGCG-AG-3\质粒pLVX-puro和pLVX-puro-UBE2T PCR验证反应体系为20$L：2XES Ta?Master­Mix10.0$L,pLVX-puro-UBE2T或pLVX-puro 1.0$［，上下游引物各 1.0$L,ddH207.0$L。

PCR反应条件：94C5min；95C30s,55C40s, 72C40s,循环30次；72C7min。

反应结束后，取二者PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

质粒p LVX-p uro-UBE2T EcoR I/BamH I双酶切验证体系为40$L：E c o R I限制性内切酶2.0 $L,BamH I限制性内切酶2.0$［，重组质粒pLVX-puro-UBE2T20.0$L,10XH Buffer4.0$L 和ddH2012.0$L0反应结束后，取酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.2过表达效果的检测用6孔板培养小鼠巨噬细胞RAW264.7(培养基为含体积分数10%胎牛血清的0piMEM),1mL/孔，待密度为1X106 mL Q1时，更换培养基为不含血清的0piMEM培养基(1mL/孔)，将细胞分为PBS对照组、pLVX-puro空质粒组和pLVX-puro-UBE2T过表达质粒组。

取2支灭菌的EP管，一管加入10$L Lipo­fectamine2000和240$L0pti-MEM；另一管加入15$L质粒(pLVX-puro或 p LVX-p uro-UBE2T)或PBS(PBS对照组)和235$L0pti-MEM，混匀后室温孵育5min。

将上述2个EP管中的液体混合并混匀，室温孵育15min。

将上述混合液全部加入各组细胞的6孔板内，放回培养箱培养；4h后在6孔板中加入含体积分数20%胎牛血清的0piMEM 培养基(2mL/孔)，继续培养48h后收集细胞，用Trizol—步法提取细胞总RNA,反转录合成cD-NA,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测UBE2T基因过表达效果。

从NCBI网站GenBank 上查找UBE2T和内参甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因序列(GenBank登录号分别为NM_ 0260243NM_0080843)，PrimerPremier 50设性(1)，由生工生物工程技术服务有限公司合成。

以GAPDH为内参，在罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR，反应体系为：2X SYBR Green Master Mix10$L,cDNA模板2$L，上、下游引物各1$L,双蒸水6$L。

PCR反应条件：95C5min；95C15s,58C(UBE2T)或60C(GAPDH)30 s,2C30s,40个循环；72C7min。

试验设以PBS处理的RAW264.7细胞为对照。

每组细胞3
22西北农林科技大学学报（自然科学版）第49卷
个重复，采用2-))t 法进行相对表达量分析。

表 1 UBE 2T ^n GAPDH 的 qRT-PCR 引物
Table 1 Primers of qRT-PCR of UBE 2T and GAPDH
基因
Gene
UBE 2T
GAPDH 引物序列
Primer sequence
F : 5 '-CCTCCACAGGTCCGATTTC3 , R ： 5 '-CTCTTCATCAGCCTTTTGTTTC3F : 5 -AAGAAGGTGGTGAAGCAGG3\R :5 '-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT3
扩增片段长度/bp
Product length
288
111
1. 3 UBE2T 沉默表达RAW264. 7细胞的构建1.3.1 小干扰RNA （siRNA ）的设计 依据siRNA
的设计原则，由上海吉玛制药技术有限公司针对 表 2 UBE 2T siRNA 序列
UBE2T 基因序列设计3对阳性siRNA 片段 (UBE 2T 379siRNA 、UBE 2T 599-siRNA 、UBE 2T-
661-siRNA )和1对阴性siRNA 片段(表2))
Table2 Sequence3of UBE 2T 3iRNA
siRNA 片段名称Name
序列Sequence
UBE 2T -379-siRNA F : 5/-GCUGAUUUGCGAGCUCAAATT-3\ R : 5/-UUUGAGCUCGCAAAUCAGCTT-3/UBE 2T -599-siRNA F : 5/-CCACUGUAUUGACCUCUAUTT-3\ R : 5/-AUAGAGGUCAAUACAGUGGTT-3/UBE 2T -661-siRNA
F : 5 ^GCUGACAUUUCUUCA
G A A UTT-3 \ R : 5 -A UUCUG A A G A A A UGUCAGCTT-3z 阴—siRNA Negative siRNA
F ： 5‘-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ,R ： 5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3
1.3.2
沉默表达效果的检测 用六孔板培养小鼠 巨噬细胞RAW264. 7（培养基为含体积分数10%胎 牛血清的0piMEM ）,1 mL/孔，待密度为1 f 106 mL -1时，更换培养基为不含血清的OpiMEM 培
养基（1 mL/孔），将细胞分为PBS 对照组、阴性siR- NA 组、UBE 2 — 379-siRNA 干扰组、UBE2T-599-
siRNA 干扰组和UBE 2T -661-siRNA 干扰组。

取2 支灭菌的EP 管，每管分别加125 $L OpiMEM ，然 后一管加入 7 $L Lipofectamine RNAiMAX,另一 管加入 12. 5 $L siRNA （UBE 2 — 379-siRNA 、
UBE 2T -5 9 9-siRNA UBE 2 —661-siRNA 或阴性
siRNA ）或PBS （PBS 对照组），混匀后室温孵育5 min 。

将上述2个EP 管中的液体混合并混匀，室温
孵育15 min 。

将上述混合液全部加入各组细胞的 六孔板内，放回培养箱培养，4 h 后在6孔板中加入 含体积分数20%胎牛血清的OpiMEM 培养基（2 mL /孔）；继续培养48h 后，以GAPDH 为内参，利
用qRT-PCR 检测UBE2T 基因沉默表达效果，具体 试验方法同1. 2. 2节。

1.4 UBE2T 沉默或过表达对RAW264. 7细胞活
性的影响
基 （ MTT ） 验 ，UBE 2 —661-siRNA 和 pLVX-puro-UBE2T 质粒分 别转染RAW264. 7细胞，培养细胞至对数生长期，
表3 NLRP 3 和 Cas P ase 1 的 qRT-PCR 引物
用2. 5 g/L 胰蛋白酶消化细胞，用含体积分数10%
胎牛血清的OpiMEM 培养基配成单个细胞悬液, 以每孔103〜104个细胞的量接种于96孔培养板
中，每孔总体积为200 $L ，边缘孔用无菌的PBS 填
充。

弃去上清，每孔加入150 $L DMSO 溶液，置摇 床上低速振荡10 min,使结晶充分溶解，在酶联免
疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值，具体操作见 说明书。

试验设正常培养的RAW264. 7细胞为对
照，重复3次。

1. 5羊种布鲁氏菌M5-90感染对相关基因表达的
影响
qRT-PCR ， M5-90 对
RAW264. 7细胞UBE2T 基因相对表达量的影响，
以及对过表达或沉默表达UBE2T 基因的 RAW264. 7细胞中含pyrin 结构域NOD 样受体家 族3（NBRP3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1 （Caspase-1）基因相对表达量的影响。

从NCBI 网
站GenBank 上查找NLRP3 Cas P ase1基因序列 （GenBank 登录号分别为 NM _145827. 4 和 NM _
009807. 2），采用 Primer Premier 5. 0 软件设计特异 性引物（表3）,UBE2T 和GAPDH 的引物相关信
息见表1,引物由上海生工生物工程技术服务有限 公司合成。

Table 3 Primers of qRT-PCR of NLRP 3 and Caspas —1
基因
引物序列
Gene
Primersequence
NLRP 3
F : 5 d-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3\R : 5/-CGCAGCAAAGATCCACACAG-3/Caspase 1 F :5-ACAAGGCACGGGACCTATG3\R : 5-TCCCAGTCAGTCCTGGAAATG-3'
扩增片段长度/bp
Product length
140
237
第4期印双红，等：泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用23
取RAW264.7细胞，用羊种布鲁氏菌M5-90感染（感染复数（MOI）为100"于4,8,12和24h后收，用Trizol一
RNA,反转录合成cDNA。

以GAPDH为内参，在罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR仪上对各时间点UBE2T的表达水平进行qRT-PCR检测，具体 1. 2.2节。

试验设以PBS处理的RAW264.7细胞为对照）
取转染p LVX-p uro-UBE2T和UBE2@661-siR-NA的RAW2647（种鲁菌M5-90（MOI为100），于感染后24h收集细胞，用Trizol一步法提取细胞总RNA,反转录合成cDNA。

以GAPDH为内参，在罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR仪上对NLRP3和Caspase1表达水平进行qRT-PCR检测，具体方法同1.2.2节。

同时设正常RAW264.7细胞及转染pLVX-puro空质粒、阴性siRNA、PBS处理的RAW264.7细胞为对照）1.6UBE2T沉默或过表达对细胞内布鲁氏菌增
的
取1.5中M5-90感染的5组细胞,37°C共孵育1.5h后，PBS洗除的菌，添加含有50 $g/mL庆大霉素的DMEM培养基以杀死胞外菌, PBS漂洗，更换无抗生素的养液，孵育4,8, 12和24h时用体积分数0.2%的TritonX-100裂解细胞，室温放置12min以释放胞内菌，对裂解液倍稀释，涂体平板，进行活菌计数，结果以活菌数的常用对数。

试验重复3次。

1.7UBE2T沉默或过表达对LDH、Ca s p a s e-3活
性及相关因子的影响
取1.5中M5-90感染24h的5组细胞，按照试
LDH水平、Caspase-活性，利用ELISA方法检测IL-6、IL-18、IL-邛和IFN-'等细胞因子的水平。

试验重复3次。

1.8数据统计分析
验所得数据均利用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），结果以“平均值（Means）士标准差!D'"表示。

2结果与分析
2.1过表达载体pLVX-puro-UBE2T构建及表达
的验证
2.1.1pLVX-puro-UBE2T的构建由图1可知，PCR254bp的pLVX-puro881bp的pLVX-puro-UBE2T，与预期结果相符）由图2可知,pLVX-puro-UBE2T经EoR%/BamH%双酶627bp的目的基因条带，片段长度与预期结果相符）PCR和EoR%/BamH%双酶切结果表明，pLVX-puro-UBE2T构建成功）
2000bp
1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp M12
881bp
254bp
M1
15000bp
10000bp
7500bp
5000bp
3000bp
1500bp
1000bp
500bp
8071bp
627bp
M.DL2000DNA Marker'.pLVX-puro PCR产物；
2.pLVX-puro-UBE2T PCR产物
M.DL2000DNA Marker；1.Products of pLVX-puro by PCR；
2.Products of pLVX-puro-UBE2T by PCR
图1重组载体pLVX-puro-UBE2T的PCR验证
Fig.1PCR verification of recombinant plasmid
pLVX-puro-UBE2T
2.1.2过表达效果的检测由图3可知,pLVX-puro-UBE2T质粒转染组UBE2T的表达量极显著高于PBS对照组（P<0.01）；UBE2T在空质粒组pLVX-puro中的表达量与PBS对照组相似。

结果
M.DL15000DNA Marker'.pLVX-puro-UBE2T的双酶切产物M.DL15000DNA Marker'.Products of recombinant plasmid pLVX-puro-UBE2T by E c o R%/Bam H%
图2重组载体pLVX-puro-UBE2T的
Eco R%IBam H%双酶切验证
Fig.2Identification of recombinant plasmid
pLVX-puro-UBE2T by Eo R%/Bam H%
表明,LVX-puro-UBE2T质粒可过表达UBE2T）2.2siRNA干扰UBE2T基因表达效果的验证
由图4可知，UBE2T-379-siRNA.UBE2T-599-siRNA和UBE2@661-siRNA干扰组UBE2T
mRNA
24西北农林科技大学学报（自然科学版）第49卷
的相对表达量均极 于PBS 对照组（P V0. 01）,效率分 58 % ,62 %和84%。

结果表明，
UBE2T 的
UBE 2T -661-siRNA o
V N H E J d p g b j o
u
.2
sso d x o
U A Q E O H
*故聚夜異
VNMnl
H
s s
4.03.0
2.0
1.0
1
2
3
组别Group
V N H E
J d p g b j o
u
.2s
s
u
」d x
u U A P E O H
嘲故來茯r
V N M
日H 1.21.00.8
0.6
0.40.20.0
12 3 4 5
组别Group
1. PBS 对照组；
2. pLVX-puro 空质粒组 3 pLVX-puro-UBE2T
过表达质粒组o 与PBS 对照组相比，图柱上标*表示差异显著
(P V 0.05),标% %表示差异极显著(P V 0.01),下图同1. PBS control group ；2. pLVX-puro empty plasmid group ；
3. pLVX-puro-UBE2T overexpression plasmid group. Compared with the PBS control group , % represents significant difference at
P #0. 05,and % % represents significant difference at
P #0. 01. The same below
图3 UBE 2T 过表达效果的检测
Fig. 3 Effects of overexpression of UBE 2T gene
2. 3 沉默和过表达UBE2T 基因对RAW264. 7细
性的
由图5可 知，UBE 2T -661-siRNA 干 扰组、
p LVX-p uro-UBE2T 过表达质粒组 RAW264. 7 细
与正常细胞相比活性 90%以上，表明沉默或过表达UBE2T 基因均不影响巨噬细胞的活性,可
以进行后续试验。

1. PBS 对照组；
2.阴性 siRNA 组UBE 2T-379-siRNA 干扰组；4. UBE 2T -599-siRNA 干扰组；5. UBE 2T -661-siRNA 干扰组
1. PBS control group ；
2. Negative siRNA group ；
3. UBE 2T -379-siRNA interference group ；
4. UBE 2T -599-siRNA interference group ；
5. UBE 2T -661-siRNA interference group
图4 UBE 2T 沉默表达效果的检测
Fig. 4 Effects of silence expression of UBE 2T gene
2. 4
对 UBE2T 、NLRP3 和 Caspase'基因相对表
的影响
由图6可知，在8,12和24 h,M5-90感染组
RAW264. 7细胞UBE2T mRNA 的相对表达量均
极显著高于对照组（P V0. 01）,表明M5-90感染可
UBE2T 的表达量。

B
三 q
E A I o o
100
80
60
40
20
1
2 3
组别Group
1•正常细胞对照组；2.UBE 2T -661-siRNA 干扰组；
□ PBS 对照组 PBS control group;□ M5-90感染组 M5-90 group
图6 布鲁氏菌M5-90 对RAW264. 7细胞中
3. pLVX-puro-UBE2T 过表达质粒组
UBE 2T mRNA 表达的影响
1. Normal cell control group ；. UBE 2T -661-siRNA interference group ；
Fi g.
6 Effects of Brucella M5-90 infection on expression
3. pLVX-puro-UBE2T overexpression plasmid group
图5沉默和过表达UBE 2T 对RAW264. 7细胞活性的影响
of UBE 2T mRNA of RAW264. 7 cells
Fig. 5 Effects of overexpression and silence of UBE 2T
gene on RAW264. 7 cell
activity
第4期印双红，等：泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用25
由图7可知，与PBS对照组细胞相比，pLVX-puro-UBE2T过表达组细胞NLRP3的表达量显著降低（P V0.05）,而Caspas—1的表达量显著升高（P#0.05）；UBE2—661-siRNA干扰组细胞的NLRP3表达量极显著升高（P#0.01）,Capae1表达量显著升高（P V0.05）。

pLVX-puro空质粒组与阴性siRNA对照组细胞的NLRP3^\Caspas—1达量均无。

，沉默UBE2T^高了M5-90介导的NLRP3Caspase-1的表达,而过表达UBE2T抑制M5-90介导的NLRP3表达，提高M5-90介导的Caspase-1表达。

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组别Group
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1.正常细胞对照组；
2.PBS对照组pLVX-puro空质粒对照组；4.pLVX-puro-UBE2T过表达质粒组；
5.阴性siRNA对照组；
6.UBE2—661-siRNA干扰组
1.Normal cell group；
2.PBS control group；
3.pLVX-puro empty overexpression control plasmid group；
4.pLVX-puro-UBE2T
overexpression plasmid group；5.Negative siRNA control group；6.UBE2—661-siRNA interference group
图7M5-90感染对沉默或过表达UBE2T基因的RAW264.7细胞中NLRP3Caspas—1基因相对表达量的影响Fig.7Effects of overexpression and silence of UBE2T gene on relative expression levels of NLRP3and
Caspase-1genes of RAW264.7cells infected with M5-90
2.5沉默和过表达UBE2T基因对胞内布鲁氏菌
增殖的
由图8可知，在12和24h,转染UBE2T-661-siRNA片段的RAW264.7细胞内M5-90数量显著于PBS对照组（P V0.05）；在所有观察时间点，转 染p LVX-p uro-UBE2T质粒的RAW264.7细胞内M5-90数量显著高于PBS对照组（P V0.05）。

结果表明，沉默UBE2T可抑制胞内M5-90的增殖，而过表达UBE2T可促进胞内M5-90的增殖。

□PBS对照组PBS control;□pLVX-puro空质粒组pLVX-puro group;
日pLVX-puro-UBE2T过表达质粒组pLVX-puro-UBE2T group;0阴性siRNA组Negative siRNA group;
□L/BE2八661-siRNA干扰组E/BA2r-661-siRNA group
4
目
4812
感染时间/h
Post-infection time
24
图8沉默或过表达UBE2T对RAW264.7细胞内布鲁氏菌增殖的影响
Fig.8Effects of overexpression and silence of UBE2T gene on intracellular replication of Brucella in RAW264.7cells
2. 6沉默和过表达UBE2T基因对M5-90感染细胞
的LDHCaspase-3水平及IL细胞因子的影响2. 6.1LDH水平由图9可知，与PBS对照组相比,pLVX-puro-UBE2T质粒组RAW264.7细胞的LDH水平极显著升高(P#0.01),UBE2T-661-siRNA干扰组RAW264.7细胞的LDH水［
著
26西北农林科技大学学报（自然科学版）第49卷
降低（P<0.05）。

pLVX-puro空质粒组与阴性siR-NA组细胞的LDH水无。

：表明，沉默UBE2T可抑制M5-90介导的LDH水平，而 过表达UBE2T可提高M5-90介导的LDH水平。

pLVX-puro空质粒组与阴性siRNA组细胞的Caspase3活性均无。

，沉默UBE2T可提高M5-90介导的Caspase3活性，而过表达UBE2T可抑制M5-90介导的CaspaseZ活性。

*
*
T
M
12345
组别Group
1.PBS对照组；
2.pLVX-puro空质粒组；3pLVX-puro-UBE2T
过表达质粒组4阴性siRNA对照组；5.UBE2@66-siRNA
干扰组。

下图同
1.PBS control group；
2.pLVX-puro empty plasmid group；
3.pLVX-puro-UBE2T overexpression plasmid group；
4.Negative siRNA control group；
5.UBE2T-661-siRNA
interference group.The same below
图9沉默和过表达UBE2T对M5-90感染的
RAW264.7细胞LDH水平的影响
Fig.9Effects of overexpression and silence of UBE2T on LDH levels of RAW264.7cells infected with M5-90
2.6.2Caspase3活性由图10可知，与PBS对照组相比,pLVX-puro-UBE2T质粒组RAW264.7细胞的Caspase3活性显著降低（P<0.05）,UBE2/ 661-siRNA干扰组Caspae3活性显著升高（P<0.05）,
0_———__—_———___—_———_
12345
组别Group
10沉过达UBE2T对M5-90的RAW2647
细胞Caspase3活性的影响
Fig.10Effects of overexpression and silence of UBE2T on Caspase3activity of RAW264.7cells infected with M5-90 2.6.3IL细胞因子水平由图11可知，与PBS对照组相比,pLVX-puro-UBE2T质粒组RAW264.7细胞的IL-18水平无明显变化，而IL1&水平显著降低（P<0.05）；UBE2@661-siRNA干扰组IL-18水平无明显变化，而IL1&水平显著升高（P<0.05）；pLVX-puro空质粒组与阴性siRNA组细胞的IL-18和IL-邛水无。

，沉默UBE2T可M5-90介导的IL1&水平，而过表达UBE2T可抑制M5-90介导的IL-邛水平。

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图11沉默和过表达UBE2T对M5-90感染的RAW264.7细胞IL-18及IL1&水平的影响Fig.11Effects of overexpression and silence of UBE2T gene on levels of
IL-18and IL-1&of RAW264.7cells infected with M5-90
由图12可知，与PBS对照组相比,pLVX-puro-UBE2T质粒组RAW264.7细胞的IFN-'水平显著降低（P V0.05）,而IL-6水平无明显变化；UBE2T-661-siRNA干扰组IFN-'和IL-6水升高（P<0.05）；pLVX-puro空质粒组与阴性siRNA组 细胞的IFN-'和IL-6水平均无明显变化。

结果表明，沉默UBE2T可提高M5-90介导的IFN-'和IL-6水平，而过表达UBE2T可抑制M5-90
介导的
第4期印双红，等：泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用27 IFN-'水平o
图12沉默和过表达UBE2T对M5-90感染的RAW264.7细胞IFN-'及IL-6水平的影响
Fig.12Effects of overexpression and silence of UBE2T gene on levels of
IFN-'and IL-6of RAW264.7cells infected with M5-90
3讨论
非特异性免疫在抵御病原微生物早期感染过程中发挥着至关重要的作用，其中巨单核细能快速识别入侵的病原菌，进而释放大量的促炎因子，引发炎症，但布鲁氏菌可利用巨噬细胞面的特殊结构而逃避布鲁氏菌Toll样受体(Toll­like receptors,TLRs)的识别与补体第三组分(C3)的活化，因此不能激烈的非性免疫反13「15&o固有免疫系统模式识体4类，即TLR、N0D样受体(NLR)、凝集素样受体(CLR)和解旋酶样受体(RLR),其中TLR和NLR是识别病原微生物并诱导炎症的受体「16&。

NLRP3炎症小体是识别配体并诱发慢性炎症反应的关键，NLRP3主要表达于嗜中性粒细胞、单核巨噬细胞和一些初级免疫细胞中，主要分间质及细胞膜中「17&o 存在于的部分NLR激活成巨大的I复 合体“炎症小体.激活Caspase-1，进而对IL1&和IL-18等炎症因子的前体行，使其成熟并释放至胞外，引起炎症反应。

NLRP3炎性小体是迄今为止结构和功能最为明确的炎性小体，主要由NLRP3、ASC和Caspase-1共同组成口"。

本研究发现，沉默UBE2T表达可提高M5-90介导的IL1&水平及NLRP3Caspas-1基因的表达；过表达UBE2T可提高M5-90介导Cas P as-1基因的表达，抑制IL1&水平和NBRP3基因的表达。

该结果表明UBE2T可调控胞内布鲁氏菌介导的炎症反应。

目(病与酶体系(UPS)作用的相关研究较多，泛素能作为病毒的胞内目标，主要是由于其作翻译后修饰者匾参与细胞周期％0&、胞吞作用%21&和DNA修复％2&等复杂的过程。

针对猪鲁氏菌生存机制与UPS关系的研究表明，一方面猪源布鲁氏菌S2的
巨及酶体的表达；另一面，酶体系统功能的，显著降猪鲁氏菌S2的早期，但对于中后期作用不；期利酶体抑制(Lactacystin)抑制巨噬细胞蛋白酶体功能，却可显著降低猪鲁氏菌S2的能力「23&,这种可能是酶体功能的抑制在一定程度 巨自体系统的活化，从而增巨的杀菌能力「24&。

目前，关于UPS中E2的研究主要集中在肿瘤疾病方面，在病原方面的研究较少，本研究探讨了E2中的UBE2T在 RAW264.7细胞内布鲁氏菌增殖过程中的功能，发现布鲁氏菌M5-90在感染后8,12和24h可激活UBE2T的表达，沉默UBE2T表达可抑制胞内M5-90的增殖，过表达UBE2T可促进胞内M5-90的增殖。

UBE2T在布鲁氏菌挥重要作。

IFN-'是抗布鲁氏菌感染免疫反应中关键性的细胞因子％5&，主要由活化后的NK、CD4+和CD8] T产生，其作用主要是CD8+和CD4]T 的聚集，的抗原能力。

I[-6是一种多种效能的子，可诱导T细胞合成分IL-2诱导B分并抗体的
分泌％6&。

本研究，沉默UBE2T表达可b M5-90介导的IFN-'和IL-6水平；过表达UBE2T 可抑制IFN-'水平，因此可知UBE2T可调控布鲁氏菌介导的IFN-'和IL-6水平。

28西北农林科技大学学报（自然科学版）第49卷
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