尼罗红-荧光光谱法测定亚心形扁藻油脂含量

尼罗红-荧光光谱法测定亚心形扁藻油脂含量
宋琪;李泉;邴欣;刘双;于道永
【摘要】尼罗红-荧光光谱法能够快速地对微藻细胞中的油脂含量进行检测,但是该方法对所测微藻物种具有一定依赖性,在分析不同微藻细胞油脂含量前需要对测试条件进行优化.优化后的亚心形扁藻油脂含量分析条件为:藻液800×g离心5 min 去除培养基,用体积分数4％的二甲基亚砜(DMSO)水溶液重悬至OD750=0.3,尼罗红质量浓度0.8 μg/mL,避光40℃水浴恒温10 min,激发波长520 nm.发现亚心形扁藻在培养的对数生长后期油脂开始积累,稳定期后期油脂含量趋于恒定,优化后的尼罗红-荧光光谱法能够准确地检测亚心形扁藻生长过程中的油脂含量变化.
【期刊名称】《中国油脂》
【年(卷),期】2016(041)010
【总页数】4页(P98-101)
【关键词】亚心形扁藻;尼罗红;荧光光谱法;油脂含量
【作者】宋琪;李泉;邴欣;刘双;于道永
【作者单位】中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580;中国石油大学(华东)生物工程与技术中心,山东青岛266580
【正文语种】中文
【中图分类】TS222;TQ646
随着全球能源消耗量的不断增加，不可再生的化石能源日渐短缺，而使用化石燃料还会产生大量的CO2及硫、氮氧化物等有害气体危害环境。

生物柴油是一种通过甘油三酯或游离脂肪酸与短链醇的酯基转移反应或酯化作用形成的单烷基酯，它经过稍微改性或不改性就可以在传统的柴油机中使用[1]。

生物柴油由于环境友好及可再生性，成为较理想的替代能源之一。

微藻具有光合效率高、生长周期短、含油量高等优点，是生产生物柴油的理想原料[2]。

提高微藻油脂含量是降低生物柴油成本的重要途径，是微藻生物柴油产业化亟待解决的关键问题之一。

因此，建立一种简便、快速的微藻油脂含量检测方法，对于调控生产过程提高微藻油脂产量具有十分重要的意义。

尼罗红是一种亲脂性的荧光染料，与细胞中的脂质结合可以发出特异性荧光信号，用于定量检测细胞中的油脂含量[3-6]。

尼罗红-荧光光谱法早期曾用于寇氏隐甲藻[7]、球等鞭金藻[8]、微拟球藻[4]等微藻中油脂的测定，但由于藻类具有较坚厚的细胞壁，阻碍尼罗红进入细胞[9]，所以许多研究者提出使用甘油[10]、二甲基亚砜[3]、乙醇[11]或微波处理[12]来辅助染料通过细胞壁。

尼罗红-荧光光谱法的操作条件与藻种有关[13]，所以在使用该方法测定不同种类微藻之前，需先对其染色条件进行优化。

亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)是一种海洋微藻，属绿藻门、绿藻纲、团藻目、衣藻科、扁藻属[14]。

由于其油脂和淀粉含量高，在胁迫条件下可利用太阳能光解海水制氢[15]，受到了微藻生物能源领域研究者的广泛关注。

本文采用尼罗红-荧光光谱法测定亚心形扁藻的油脂含量，优化了藻细胞浓度、二甲基亚砜体积分数、尼罗红质量浓度等条件，找出适用于亚心形扁藻的油脂含量测定条件，并考察了亚心形扁藻生长过程中的油脂积累情况，为微藻油脂合成机制的研究奠定了相关基础。

1.1 试验材料
1.1.1 藻种与试剂
亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)购于中科院水生生物研究所。

尼罗红(Nile red)，Sigma公司；维生素B1、维生素B12、生物素均为分析纯，索莱宝公司；丙酮、二甲基亚砜(DMSO)等均为分析纯。

尼罗红母液的配制：将尼罗红溶解于丙酮中，质量浓度为0.24 mg/mL，避光4℃保存，使用时根据需要取不同体积母液加入体系中即可。

1.1.2 仪器与设备
5810R台式冷冻离心机，FluoroMax-4荧光光谱仪，UV-1700紫外-可见分光光度计，GXZ光照培养箱，AL204电子分析天平，DK-S24电热恒温水浴锅，211型pH计，SW-OJ-2F超净工作台，YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器。

1.2 试验方法
1.2.1 藻株培养
亚心形扁藻采用f/2培养基培养(配方参考CCAP)，培养基所用海水取自青岛市金沙滩。

培养温度25℃，光照强度100 μmol/(m2·s)，通入含2%CO2的空气，持续光照培养，振荡器转速100 r/min，培养30 d左右扁藻可以达到稳定期。

1.2.2 OD750与细胞干重相关性的探究
取不同OD750的亚心形扁藻藻液100 mL，抽滤到已知干重的纤维素膜上，然后将膜转移到铝箔上，真空干燥3 h。

取出冷却后称重，进而确定每个样品藻细胞干重。

1.2.3 尼罗红染色条件的探究
结合Chen等[3]的成果和本实验室经验[5]，染色初始条件选定：扁藻藻液离心(800×g，5 min)后藻细胞重悬于DMSO水溶液中，调整藻细胞浓度使悬液吸光度OD750=0.16，加入尼罗红母液，使悬液中尼罗红质量浓度为1.2 μg/mL，避光40℃水浴恒温10 min染色。

采用单因素变量法，分别对各参数进行优化。

1.2.4 荧光光谱检测
取3 mL染色后的藻细胞悬液，加至10 mm×10 mm 荧光比色皿中，放入荧光光谱仪，设置参数：激发波长520 nm，发射波长范围540～700 nm。

取580 nm 处的荧光强度表征微藻油脂的相对含量。

荧光强度越大，油脂含量越高。

1.2.5 亚心形扁藻生长和油脂积累曲线的测定
以OD750表征藻细胞浓度，定期取样测定藻液的OD750以及油脂含量，并做出其随时间变化曲线。

2.1 OD750与细胞干重的相关性
藻细胞在波长750 nm没有明显的吸收，因此可以用此波长下藻液散射的OD750表征藻液中细胞的浓度。

通过测定不同浓度藻液的干重，探索OD750与细胞干重的相关性。

结果发现，在考察的范围内OD750与细胞干重呈线性相关(见图1)，
因此可以用OD750间接表征藻细胞浓度。

2.2 DMSO体积分数对荧光强度的影响
离心收集藻细胞，用不同体积分数的DMSO水溶液重悬，调整藻细胞浓度使藻液的OD750=0.16，尼罗红质量浓度为1.2 μg/mL，40℃避光水浴10 min。

染色
后分别测定荧光强度，结果见图2。

由图2可知，体积分数为2%～4%的DMSO
水溶液体系中尼罗红染色油脂的荧光峰较强。

多次试验发现，DMSO体积分数为4%时，平行测定的偏差最小，说明体积分数为4%的DMSO水溶液对尼罗红进入亚心形扁藻细胞有较好的辅助效果。

2.3 藻细胞浓度对荧光强度的影响
藻液离心去除上清液后，用4%DMSO水溶液重悬细胞，调整藻细胞浓度，加入
尼罗红按1.2.3染色，考察藻细胞浓度与荧光强度之间的关系，结果见图3、图4。

由图3可知，在OD750<0.3时，荧光强度与OD750呈线性相关。

当藻细胞浓度较低(OD750=0.15)时，油脂荧光峰中尼罗红的自发荧光峰占比较大(见图4e)；随
着藻细胞浓度增大，油脂荧光峰逐渐增强；当OD750=0.3时，尼罗红的自发荧光峰在谱图中的占比很少(见图4b)，平行测定时油脂荧光信号的偏差已经很小。

综合考虑，推荐亚心形扁藻油脂测定的OD750=0.3。

2.4 尼罗红质量浓度对荧光强度的影响
藻液离心后用4%DMSO水溶液重悬至OD750=0.3，加入尼罗红母液调节尼罗红质量浓度，按1.2.3染色后测定荧光强度，结果见图5。

由图5可知，尼罗红质量浓度增高，体现油脂含量的580 nm荧光强度逐渐增大，尼罗红质量浓度高于0.7 μg/mL后趋于稳定，说明油脂完全染色的尼罗红最低质量浓度为0.7 μg/mL。

分析时选用的尼罗红质量浓度应由藻细胞中的油脂含量决定，尼罗红质量浓度过低时不足以对细胞中的油脂进行完全的染色，而尼罗红质量浓度过高会使尼罗红自发荧光峰过强，同时浪费尼罗红染料。

若用该方法测定亚心形扁藻在胁迫条件下诱导产油时的油脂含量，应适当增大尼罗红质量浓度。

2.5 最佳DMSO体积分数的复验
优化后的染色条件为：扁藻800×g离心5 min去除培养基，用DMSO水溶液重悬至OD750=0.3，加入尼罗红母液，使悬液中尼罗红质量浓度为0.8 μg/mL 。

与最初选取的初始条件OD750=0.16有差异，故用OD750=0.3对DMSO体积分数重新进行优化，以确保结果的准确性，结果见图6。

由图6可知，体积分数为4%的DMSO水溶液对尼罗红的辅助效果最佳，DMSO体积分数过低时不足以辅助尼罗红进入细胞内进行完全染色，而DMSO体积分数过高时会将细胞中的色素萃取出来，内滤和再吸收效应增强[16]，导致体现油脂含量的荧光信号强度降低。

因此，应选取合适体积分数的DMSO水溶液。

验证结果表明，体积分数为4%的DMSO水溶液对亚心形扁藻细胞浓度OD750=0.3时的尼罗红染色有较好的辅助效果。

2.6 亚心形扁藻生长和油脂积累曲线
采用上述优化后的亚心形扁藻油脂含量测定参数(悬液中尼罗红质量浓度取0.8
μg/mL)，考察亚心形扁藻生长过程中的油脂积累曲线，结果见图7。

由图7可知，亚心形扁藻在30 d左右达到生长稳定期(见图7a)，生长初期细胞内的油脂含量较少，在对数生长期后期油脂含量逐渐增加，稳定期后期达到稳定值(见图7b)。

采
用尼罗红-荧光光谱法测定的生长过程中微藻油脂含量的变化规律与共聚焦荧光显
微镜观察到的实际微藻油脂含量变化规律是一致的，说明采用尼罗红-荧光光谱法
可以快速准确地评价微藻油脂的相对含量。

由于尼罗红-荧光光谱法测定微藻油脂含量具有物种依赖性，在使用该方法测定不
同种类微藻油脂含量之前，需先对尼罗红染色条件进行优化。

采用尼罗红-荧光光
谱法测定亚心形扁藻油脂含量的优化的染色条件为：取适量藻液800×g离心5 min去除培养基，用体积分数为4%的二甲基亚砜(DMSO)水溶液重悬至
OD750=0.3，尼罗红质量浓度为0.8 μg/mL，40℃避光水浴10 min。

染色后设
置激发光波长为520 nm，在540～700 nm范围内扫发射光谱。

尼罗红使用的质量浓度应由试验具体情况而定，胁迫条件可能会使细胞中油脂增加，故所需尼罗红的量相对更大，建议尼罗红质量浓度在0.7～1.2 μg/mL之间选取。

亚心形扁藻在试验考察的培养条件下在30 d左右到达稳定期，对数生长后期油脂开始积累，到稳定期后期油脂含量趋于稳定。

优化之后的尼罗红-荧光光谱法能够快速、准确地
检测亚心形扁藻油脂的相对含量，为亚心形扁藻产油条件的优化和产油机制的探讨奠定了相关基础。

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