1.2基因工程的本操作程序

❖ PCR的特点
引物1
55-60℃
PCR的基本原理
❖ PCR反应条件
❖ PCR过程 70-75℃
❖ PCR的特点
Taq酶 引物1
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
❖ ❖
PPCCRR反过应程条件70-75℃
❖ PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理
Taq
Taq
❖
Taq❖
PPCCRR反过应程条9件0-95℃
非编码区 启动子
编码区 转录
剪接
思考
翻译
如何让真核细胞的基因
在原核细胞中表达呢？
非编码区 终止子
mRNA前体 区 启动子
不含非编 码系列。 即不含非 编码区和
内含子
编码区
转录 剪接 逆转录
非编码区 终止子
mRNA前体 成熟的mRNA
1.2 基因工程的基本操作程序
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
1、目的基因主要是指_能__够__编__码__蛋__白__质__的__结__构__基_因
2、获取目的基因的方法 （1）从基因中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成
1.目的 A. 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代 B.同时使目的基因能表达和发挥作用
2.基因表达载体的组成： a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 e、复制原点
3.基因表达载体的构建过程
质粒
重组DNA 限制酶
目的基因
DNA连接酶
（1）用__限__制__酶___切割质粒， 使其出现切口露出 ___黏__性__末__端___。
②原理：_D_N_A_复__制____
dATP dGTP dCTP dTTP(统称dNTP)
③条件：_模__板__D_N_A____、_四__种__脱__氧__核__苷__酸__、 __2_种__引__物____ 、 _热__稳__定__D_N_A_聚_合酶（Taq酶）
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_
（3）人工合成法： 化学合成法 、 反转录法
根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
蛋白质氨 基酸序列
mRNA
DNA
DNA
推测
推测
DNA合成仪合成
反转录法
mRNA
逆转录酶
cDNA单链
DNA聚合酶
cDNA分子
与直接提取的DNA相比cDNA不含有_非_编__码_区 和内__含__子_等结构。
二、基因表达载体的构建（核心步骤）
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是 _连_续___的
编码区是间隔的、 _不_连_区__和具 相同点 有调控作用的__非_编__码_区组成的
原核细胞基因的表达过程
非编码区
编码区
非编码区
启动子
转录 翻译
终止子
mRNA 蛋白质
真核细胞基因的表达过程
某种生物的全部DNA
限制酶
DNA片段
DNA片段与载体连接
重组DNA导入受体菌中储存基因组原核细胞的基因结构(补充内容）
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区 编码区下游
终止子
与RNA聚合酶结合位点 、启动转录
终止转录
原核 编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断
细胞
的
①不编码蛋白质。
基因 结构
非编码区 ②调控遗传信息表达,上
游有启动子，下游有终止子
真核细胞的基因结构（补充内容）
非编码区
编码区上游
编码区
非编码区
编码区下游
启动子
终止子
与RNA聚合酶
结合位点
外显子 内含子
真核 细胞
的
编码区 外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列
基因
结构 非编码区 ：有调控作用,上游有启动子，下
游有终止子
非编码序列： 包括非编码大小 基因中启动子 基因中内含子 基因多少 物种间的基因交流cDNA 小基因组 大无
无
某种生物的 部分基因
可以
有 有
某种生物的 全部基因
部分基因可以
（2）利用PCR技术扩增目的基因
①概念：PCR全称为_聚__合__酶__链__式__反__应__，是一项 在生物_体__外_复制特__定__D_N_A_片__段__的核酸合成技术
（2）用同__种__限__制__酶___切割目 的基因，使其产生相__同___ 的_黏__性__末__端_____。
（3）将目的基因插入质粒的_切__口___处，加入 __D_N_A_连__接__酶__，形成了一个重组DNA分子
三、将目的基因导入受体细胞 ------转化
目的基因进入_受__体__细__胞__内，并且在 受体细胞内维持_稳__定__和有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入
到受体菌的群体中，各个受体段核苷酸__序__列__，_以__便__合__成_引_ 物
⑤结果：使___目____的___基___因___的____片___段___在___短___时____间___内___大___量___扩____增___
背景知识梳理
引物
模板DNA
PCR的基本原理
引物2
❖ ❖
PPCCRR反过应程条件90-95℃
1、将目的基因导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
特点: a.能感染双子叶植物和祼子植物, 对单子叶植物无感染能力 b.Ti质粒的T—DNA可转移至 受体细胞并整合到其染色体上
Ti质粒
构建
表 达
转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物 细 胞
整合 植物细胞染 表达 色体DNA
新 性 状
（2）基因枪法------单子叶植物
（3）花粉通道法
我国转 基因抗 虫棉就 是用这 种方法
获得
❖ PCR的特点
55-60℃
Taq
70-75℃
PCR的基本原理
❖ ❖
PPCCRR反过应程条件72℃
❖ PCR的特点
第2轮结束
③过程：变性 退火 延伸
变性
退火
延伸
PCR技术扩增与DNA复制的比较
DNA复制
PCR技术
场所
主要在细胞核内
体外复制
解旋方式
解旋酶
高温
酶
细胞内的DNA聚合酶 热稳定的DNA聚合酶