两种高效RNA干涉载体系统的构建及应用

2005；32(4) 生物化学与生物物理进展Pmg．B i∞hem．B i叩hy s．·377·
两种高效RNA干涉载体系统的构建及应用
串
杨明付汉江铁轶朱捷江红郑晓飞”
(军事医学科学院放射医学研究所，北京100850)
摘要在真核细胞基因功能研究中，RNA干涉(IiNA i)已成为一种强有力的选择性沉默基因表达的实验工具．建立
一套可在哺乳动物培养细胞中高效、经济地表达s iRN A的载体系统是RN A干涉研究的必要前提之一．从H印
G2 细胞基因组DNA中克隆得到H1全长启动子(374 bp)，以之为基础构建了两套RNA干涉载体系统，p sL
和带有绿色荧光蛋白(EG FP)标签的pEsL，并对p53基因进行了相应的RNA干涉研究．干涉质粒瞬时转染
H印G2细胞后，分别利用半定量I盯．PCR和蛋白质印迹检测p53表达水平．与商品化载体pS如，lce，蹦3．1-Hl
h)嘿即相比，psL 和pES L对p53基因表达具有更高的干涉效率．结果显示：干涉载体ps L和p Es L能高效特
异地下调目的基因表达，可作为哺乳动物中基因功能分析的有效工具．
关键词m叮A干涉，H1启动子，p53
基因学科分类号Q782
基因组计划的完成使人类深入理解自身生理和述限制．因此，相比之下，H1启动子更适于RN A 病理分子基础的梦想成为可能．但是直到目前，仍干涉载体的构建．本实验正是基于以上考虑，利用有至少15 000个到35 000个已知人类基因的功能全长374 bp的H1启动子序列构建了两种IⅢA
干还不清楚[1】．为了加强人类对自身生物学过程的了涉载体pSL和带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的解，以及为制药工业提供更多新的药物靶点，对这pESL．以对呛干涉p53基因为例，并以只包含H1 些未知功能基因进行功能研究已显得越来越重要．启动子末端100 bp序列的商品化载体pS泷聊e，M RNA干涉方法的应用已经极大地影响了基因功能3．1．H1 hy掣。

为阳性对照，验证了ps L和pES L 的研究的方式㈣．目前，RNA干涉的具体应用策略主干涉效率．实验结果表明，psL和pEsL不但
能够
要有两种：其一，直接向细胞中转染s iR NA(化学高效地抑制目的基因的表达，而且与p＆fe聊e∥合成或体外转录)M；其二，通过向细胞中转入可3．1一Hl咖相比，具有更高的干涉效率．干涉载内源性表达siRNA或shRNA的载体系统(质粒或体psL和pEs L的成功构建为下一步其他基因的基病毒载体)，间接表达s i R N An u】．其中，前者因为因沉默及功能研究打下良好的基础．
si对叮A的高成本及干涉效率的瞬时性，其应用受到
1材料和方法
极大地限制．因此，载体策略已逐渐成为进行
砌蛆i研究的首选．1．1材料
与核酸和反义核酸表达载体的构建类似，1．1．1质粒和菌种．p E G F P—C1载体购自C10n t e ch
砌妊干涉载体的构建主要采用鼬蛆聚合酶Ⅲ公司．p＆如舵e严3．1一H1 hygro(Amb ion公司产品) (P o lⅢ)启动子．P01Ⅲ启动子共分为三类，其中第由本室钱俊杰博士馈赠．pGH—T载体由本室自制，
三类(T)，peⅢ)启动子(包括H1和U6启动子)，由详见文献[14]．大肠杆菌D H5仅由本室自存．于
可在人类细胞中高水平地表达目的对蛆分子，
以及其所有的顺式作用元件皆位于待转录物的5’
外侧区域【-轴]，因此非常适于RNA干涉载体的构·国家重点基础研究发展规划项目(973)(2002c B513103)和国家自建．但是，因为u6启动子要求待转录物的第一个然科学基金资助项目(30200073)．
+十通讯联系人．
核苷酸为鸟嘌呤核苷酸，所以在心舱干涉序列的
Tel：010一66931237，E-mail：吐en群题粗c．bIni．∞．cn
选择上就有了很大的局限性，尤其对于mRNA序
收稿日期：2004．11．12，接受日期：2004．12．31
列较短的基因局限更为明显．H1启动子则不存在上
．378．生物化学与生物物理进展Pmg．Biochem．Biophys．2005；32(4) 1．1．2细胞与主要试剂．H e p G2细胞系购自中国医ATA 3’．引物3和4(pr i me r 3和4)用于从质
粒学科学院细胞库．各种限制性内切酶，rTaq聊叮A聚pGH-T．H1中克隆H1启动子，并在H1启动子上合酶，T4 D NA连接酶及绿豆芽核酸酶均购自大连游增加一段T7引物序列，正向引物pri mer 3：5’
宝生物公司．pf叮aq DNA聚合酶和琼脂糖凝胶GA△鱼丛g!财A m C甜CZTCH C强烈GGGTTATAG
DNA回收试剂盒皆购自北京天为时代科技有限公G G A GC T G AA G G G AA G3’(下划线为瑰Z II位点；
司．质粒提取试剂盒和hnProm．Ⅱ附反转录酶均为斜体为T7引物序列)，反向引物p r i m e r4：5’
Promega公司产品．T riz01试剂及Lip ofec tami Ile 2000 AAAAg!鱼g△鱼g堡垦鱼!三鱼
AAAGAGTGGTCTCAT
转染试剂皆购白姗乜Dgen公司．硝酸纤维素膜为A C A G A A C T T A T A A G A 3 7(前后两下划线分别为
Amersh am phannacia公司产品．抗P53蛋白鼠单克体z I和S，凇I位点)．引物5和6(叫mer 5和6)用隆抗体及抗Actin蛋白山羊多克隆抗体皆购白于从pEG FP．C1质粒中克隆SV40-polyA，正向引
s an_ta Cmz公司．辣根过氧化物酶(Ⅷ心)标记的抗物priIIler 5：5’G丝坠!g!AGATAACTGATC
羊／鼠二抗为北京中山公司产品．E CL检测试剂盒T AAT CA GC CAT AC CA CA TTT G 3’任W II)，反向
购自Pierce公司．所有引物均为北京三博远志生物弓l物primer 6：5’CG鱼生丛至垦卫TTTACGcGTTAA 技术公司产品．序列测定由上海博亚生物技术公司GATA CAT TG A TG 3’(日indⅢ)．
完成．1．2．3干涉载体ps L和pE SL的构建．从H印G2基
1．2方法因组D N A中克隆H l启动子，P C R产物连入
1．2．1HepG2细胞基因组DNA的提取．收集10s个pGH．T载体得p GH—T—H1．以之为模板利用引物3 细胞，加入400斗l裂解液(10 n11110l／L Tris pH 8．0，和4进行PCR扩增，产物经喇II和风￡I 双酶切
0．1mo忱EDT’A，0．5％SDS)，充分混匀后加入蛋白后，与经曰∞m I和风}I双酶切的pEGFP．C1连
酶K至终浓度0．1班，37℃保温过夜．次日，等体接，构建成p EH．p EH先经Ase I和魄ZⅡ双酶
切，
积Tris饱和酚抽提2次后，等体积氯仿／异戊醇再利用绿豆芽核酸酶(MB nuclease)削平黏性末端，(24：1)抽提1次．上清加入等体积的异丙醇，于然后自身环化连接，构建成干涉载体p SL．同时，一20℃沉淀过夜．次日，12000 g离心10 min，70％以pEG即一C1为模板利用引物5和6扩增得
乙醇洗沉淀，离心后室温干燥．最后，加入50¨1 SV40_polyA序列片段，后者经魄ZⅡ和日i凡dⅢ双
含20 m班I斟ase的TE溶解沉淀，定量，并于酶切后连入pEH的上述酶切位点，构建成干涉载
一20℃保存备用．体
pESL．
1．2．2引物的设计．引物l和2(priInerl和2)用于 1．2．4针对p53基因的干涉质粒构建．合成针对p53 从№pG2基因组DNA中克隆H1启动子，正向引基因的siRNA模板DNA片段p53i和Ap53i【刀及与物pr im e r 1：5’T TA T AG GGA GCT G AA GGG之相对应的无关序列片段s c—p53i和sc—Ap53i(表
AAG G GG G TC AC A 3’，反向引物p r i m e r2：5 1)．将p53i及sc-p53i的正义和反义链退火后，连
2005；32(4) 生物化学与生物物理进展Pmg．Bioch哪．Biophys．·379·
成干涉质粒pSL-p53i和pESL-p53i及对照质粒pS泷Mer-sc_p53i．转染时，质粒与Lipo诧ctam：iIle pSL．sc—p53i和pESL—sc—p53i．将Ap53i及sc—Ap53i 2000的比例按1：2(斗∥肛1)进行．的正义和反
义链退火后，连入经曰讲棚I和倒砸Ⅲ1．2．6 p53基因m对叮A表达水平的检测．H印
G2细双酶切的p|siZe船e—1M 3．1一H1l聊乒。

中，构建成干涉胞转染后48h提取总鼢蛆，定量1¨g，
并利用质粒pIs池ncer_p53i及对照质粒pJs泷ncer—sc．p53i．O l i g o(d T)反转录得c D N A．利用p53和
p．a c t in特异
1．2．5干涉质粒及对照质粒的转染．将HepG2细胞引物(表21扩增cDNA条带，1％琼脂糖凝胶电泳
按3×10s个／孔种于六孔细胞培养板中，当细胞分析，并利用A1phaIIIlage一1220凝胶成像分析系80％融合时，参照Lipofect锄ine 2000转染试剂说统进行光密度扫描，比较转染不同质粒细胞的p53
明书分别转染质粒p SL．p53i，p SL—sc-p53i，基因在m对叮A水平上的表达差异．
p E S L．p53i，p E S L．s c．p53i及pJ si如n ce r．p53i和
TaMe 2Seq耻耻鹤of priIn ers fo r RT-P C R
1．2．7 p53基因蛋白质表达水平的检测．转染后48h 阳性克隆应得250bp的目的片段，测序正确后用
收集细胞，裂解，Braui f-ord法蛋白质定量后进行蛋于下步实验(图2和图3)．白质印迹实验．取
80斗g蛋白质，经10％聚丙烯酰
胺凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜．分别
用P53和A ct in一抗孵育1．5 h后，相应二抗孵育
2h，EC L检{贝0．
1．2．8统计分析．实验结果采用SAS8．0软件进行
统计学分析，用方差分析各实验组之间的差别．
2结果
2．1 Hl启动子的克隆从H e pG2基因组D N A中
克隆H l启动子全长
序列[埘，P C R产物连入p G H—T载体得p G H—
T．H1．曰鲫lH I和日i n dⅢ双酶切p G H．T—H1可
得与目的片
段大小相符的片段．测序后，证明序列无误(图1)．
2．2干涉载体pSL和pESL的构建
pEH经眈oR I和日indⅢ双酶切后，阳性克隆
应有250bD的目的片段，经测序正确后，用于下Fig．1 cl砌赡of H l promoter
步实验．pSL正确重组子经Ⅳco I酶切后，应得删：DL2000 m甜br；胧：入坷ndⅢdigest D N A ma rker；J：Pc R 1．8kb、1．6 kb和0．7 kb 3个片段，经测序无误后pr o du吐8 of H1 promoter；2：dige8‘。

d pmduc‘s of pGH-T-H1、Ⅳitll
用于下步实验．pESL经趔Ⅱ和日i凡dⅢ双酶切后，曰“HI and日i砌Ⅲ·
．3 80．生物化学与生物物理进展Prog．Biochem．Biophys．2005；32(4)
Fig．2 Con stru ctio n of p S L a n d p E S L
2．3针对p53基因的干涉质粒构建由于s iR NA
模板DN A片段连入pS L和pE SL
后，p S L和p E S L中的S m a I位点消失，因此利
用Hin dll及H1启动子中的E coR I位点进行
酶切鉴
定，阳性质粒应切出290 b p的目的片段．而连
入siR NA模板DNA片段的pSilencerTM 3．1．H1
hy gr o质粒，经Eco R I和Hin dm双酶切后，正确
重组子切出3．2 kb、1．2 kb和160bp的目的
片段．重组质粒pS L-p53i，pS L．sc-p53i，
pESL-p53i，pESL—SC．p53i及pSilencer—p53i和
pSilencer—SC．p53i
经测序分析无误后，用于下步实验(图4)．
2．4干涉质粒及对照质粒的转染效率检测在转
染细胞进行p53基因m R N A及蛋白质表
达水平的检测前，利用倒置荧光显微镜观察
pES L-p53i和pE SL—s c-p53i的转染效率f其余
4种
Fig．3 R est ric tion end onu cle ase ana lys is o f pEH，p SL and 质粒的转染效率可为参照)，有荧光标记的细胞阳p删L 性率可达80％，这说明干涉及对照质粒可大量有
～。

M J：D L2000D N A ma rke r；M2：k-Hin d III digest D N A marker；J：
效地进入H e p G2细胞(图5)．
digested p r o d u c t s o f p E H with E e o R I and HindⅢ：2：digested products
2005；32(4)生物化学与生物物理进展Prog．Bio chem．Bi ophy s．·381
p53基因mRN A表达的抑制率平均可达
81．53％，而与pS il en ce r—sc—p53i转染细胞相比
pS il en ce r—p53i转染细胞p53基因mRNA表达的
抑制率平均只有
69．86％．相同实验皆重复3次，结果取平均
值
(图6)．
F逛．6 Determination of p53mRNA expr ess ion u sin g semi-
qu an ti t at iv e RT-PC R in HepG2 cell tr ans fe cte d wit h R N A i
p l a m id s and thei r co ntr ol pl a r m d s
1-7：H e p G2c D N A ampl ificat ion b y s emi—qua nt ita ti ve RT-P CR usi ng Fig．4 Restri ct io n endon uc le ase an al ys is o f R N A i pasmids
p53 and 13-actin pf i me m．肘：D L2000 m a rk e r；J：f ro m n o r ma l H e p G2
MI：DL2000 D N A marke r；M2：k-Hi nd m
d i g
e st D N A marker；J～6 cells；2-7：from
H e p G2cells transfected、】l，im pSL-p53i，pSL—s c-p53i，
digested products ofrecombinant plasmids with E c o R I and H ind m；J pES L-p53i，p ES L—sc-p53i，pS il en cer-p53i and pS il enc er-sc—p53i pS L-p53i；2：p SL-s c—p53i；3：p ES L-p53i；4：p ES L—s c-p53i；5respectively．
pSi le nc er-p53i；6：pS il en ce r—SC-p53i．
2．6 p53基因蛋白质表达水平的检测实验结果显
示，细胞内源的A c t in条带亮度强
弱相近，证明蛋白质印迹实验中蛋白质上样量一
致．光密度扫描结果表明，空细胞与pSL—sc．p53i、
pES L—sc．p53i及pS ile nc er—s c．p53i转染细胞四者
的
P53表达量之间无显著性差异(P>0．05)．与
pSL—sc—p53i转染细胞相比pSL—p53i转染细胞
P53 表达的抑制率平均可达85．64％，与
pESL．sc．p53i 转染细胞相比，pE SL．p53i转染
细胞P53表达的抑
制率平均可达80．78％，而与p Si le nce r—sc．p53i转
染
ng·5 H。

pG2 ce l l s‘r a n s f e。

钯d wi‘h pES L-p531 and pEsL。

细胞相比，p S il e聊e r-p53i转染细胞P53表达的
抑
8。

p?‘48h a讹r‘m璐&。

‘1。

川．制率平均只有70．38％．与半定量RT．PCR分析所得(8)，@(Th。

88m。

n。

14。

‘Vi8i。

“)pE8L。

p53i‘m8f。

‘。

d；(。

)，(d)(T h。

的结论相同．相同实验皆重复3次，结果取平
均值
”。

，H u4。

H‘。

‘。

H’。

A71L口土灭一‘／、’
7。

、’n。

’’o雌
samefieldofvisi on)pESL—SC—p53itran sfected(x200)
(图7)．
2．5 p53基因mRNA表达水平的检测半定量
RT．P C R扩增出p53基因特异c D N A
条带，同时，以相同体系扩增B．a c t i n作为内对照
(引物序列参见表2)．细胞内源的B．actin基因片
段条带的亮度强弱相似，证明RT．PCR的模板
量一
致．光密度扫描结果表明，空细胞与pSL—sc—p53i、
pES L—sc—p53i及p Si le nce r—sc—p53i转染细胞四者的Fig．7 Deter mi na ti on of P53 exp re ss ion us ing Western
blo砌ng R N舢p lamid s
in a n d
2005；32(4) 生物化学与生物物理进展Prog．Biochem．Biophys．·383·Construction of Tw o Highly Efficient RNAi V e c t o r s a n d T h e i r Ap pli ca ti on‘
Y A N G Min g，FU Han—Jiang，TIE Yi，ZHU Jie，J I A N G Hong，ZHENG Xi ao-Fe i+’
(Ins tit ute ofRadiation M e dw i ne，A ca d em y ofMilitary Medical S c i en c e s，B e i j in g100850，C hina)
A b s t r a c t R N A interferen ce(R NAi)，w hich cou l d s i le n c e s p ec i f i c g en e e x pr e s s io n p o s t—t r a n s c ri p t i on a l l y，h a s become a p o we rf u l tool for ident ifying gene fun ction in eukaryotic cells．One important approach of RN A i n t er f e r e n c e is to construct a v e c t o r system which Can direct the synthesis of small int e rf e r in g RNAs(siRNA)in cult ure d mammalian cel ls．Th e H1R N A pr o m ot e r(374b p)w a s clon ed from Hep G2genome DNA．Two RNAi v e c t o r sys te ms，p SL and p ES L wh i c h h a s a n EG F P g ene，were cons truc ted a n d u s e d to k no c k d o w n the exp ressi on ofp53 gen e．Th en，t he rnRNA and protein expres sio n ofp53 g ene we re det ec ted by semi—quantitative RT-PCR and Wes tem bl o t t i n g after the RNAi plasmids we r e transiently transfected to the He p G2cells．It tu r ne d out that the RNAi efficiency ofpSL a nd pES L a re much hi gh er t ha n that of pSilencerTM 3．1一H1 hygro RNA i ve t or．T he r ef or e．the data sug gest ed that pS L a nd pE SL RNAi v e c t o r systems．which c o ul d s u pp r e ss s pe c i fi c ge ne expr ess ion w inl hi曲efficiency，are ne w u s e f u l tools to i de n t i fy g en e functions in cu l t u r ed mamma li an cells．
Key w ords RN A interference(RNAi)，H1 prom ote r，p53gene
+Th is w or k w as su pp os ed by g r a n t s fr om The Special Fu nds foe Major State B a si c R es e a r c h o f China(2002CB513103)and The National Natural Sciences Foundation of Chin a(30200073)．
++Co r re s po nd i ng aut h o r．T e l：86—10-66931237．E-ma i l：z h e n g xf@n i c．b m i．a c．c a
Rec ei ve d：N ov emb er12，2004 Ac ce pt ed：De cem be r31，2004
·+一+-+-+一—+一-—-+一-—+一-+一+-+-+-+-+一+-+-+-+-+-+一+-+-+-+-+-+-+-+一+-+-+-+-+-+·+—+-—+一-—+一-+-+-+-+．．--I---+·+-+-+·
第三届全国神经信息学研讨会
征文通知
第三届全国神经信息学研讨会由脑与认知科学国家重点实验室和中国生物物理学会神经生物物理学专
业委员会联合主办．欢迎参加会议进行学术交流．
一、时间：2005年11月．会期：3--4天．二、地点：珠海市三、征文范围：1．神经信息学的最新动
态；2．脑的感知觉信息加工；3．脑的高级功能；4．神经发育与
功能衰退；5．运动控制的神经机制．
四、回执请于2005年7月31日前寄出．北京朝阳区大屯路15号脑与认知科学国家
重点实验室，邮编：100101联系人：吴梅英Tel：************，Fax：010—64853625，E—
mail：lvip@sun5．ibp．ac．ca
将依据回执发第二轮通知．
回执
姓名性别职称通信地址邮编E．mail
拟投论文
题目。