HPLC法同时检测刺五加叶中原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E、金丝桃苷及槲皮苷的含量

HPLC法同时检测刺五加叶中原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E、
金丝桃苷及槲皮苷的含量
叶恒;孙帅婷;葛会奇
【摘要】建立HPLC同时定量刺五加叶中原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E、金丝
桃苷及槲皮苷五种主要成分的方法.方法:色谱柱:Agilent Extend
C18(4.6mm×25mm,5μm),柱温:30℃;流速1 mL/min;进样量:10μL;流动相A:0.3％磷酸-水溶液,流动相B:0.3％磷酸-乙腈;梯度洗脱,洗脱条件:0～3 min,95％A;3～10 min,95％～80％A;10～35 min,80％～70％A;35～40 min,70％～10％A;40～
50 min,10％A;紫外检测波长:265 nm.结果:金丝桃苷和槲皮苷在20～240μg/mL,
原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E分别在5～60μg/mL、167.2～2010μg/mL及
6～72μg/mL下与峰面积呈良好的线性关系;平均加样回收率在99.6％～
103.1％,RSD为1.5％～2.7％.结论:本方法简便可靠,适用于刺五加叶中的多成分
含量测定.
【期刊名称】《辽宁科技学院学报》
【年(卷),期】2019(021)002
【总页数】3页(P18-20)
【关键词】刺五加叶;原儿茶酸;绿原酸;刺五加苷E;金丝桃苷;槲皮苷
【作者】叶恒;孙帅婷;葛会奇
【作者单位】辽宁科技学院生物医药与化学工程学院,辽宁本溪117004;辽宁科技学院生物医药与化学工程学院,辽宁本溪117004;辽宁科技学院生物医药与化学工程学院,辽宁本溪117004
【正文语种】中文
【中图分类】R286.0
刺五加叶含有皂苷、黄酮、多糖、酚酸等丰富的化学成分，并具有抗肿瘤、抗炎、抗应激、抗疲劳、免疫调节及抗菌等广泛的药理作用〔1〕。

且相对刺五加过度采挖，资源枯竭，可再生性刺五加叶的研究具有重要的意义。

现代刺五加叶研究重点集中在化学成分及药理作用两方面，对黄酮类或皂苷类这两类化合物的测定在文献中报道较常见〔2〕，而有机酸类物质的测定相对较少，原儿茶酸、绿原酸等有机酸类化合物同样具有抗菌、抗炎药理作用。

本研究旨在建立同时测定原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E、金丝桃苷及槲皮苷各主要有机酸、皂苷及黄酮代表物质含量的高效液相方法，为综合评价刺五加叶的品质提供依据。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent HPLC 1200配有四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、ChemStation 32色谱工作站；数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)
对照品原儿茶酸(批号：110809-200102)、绿原酸(批号：110753-200413)、刺五加苷E(批号：111713-200502)、金丝桃苷(批号：111521-201205)及槲皮苷(批号：111538-200504)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，购于德国MERCK公司；水为纯水，购于沈阳娃哈哈饮料有限公司；其他试剂均为分析
纯。

刺五加叶药材采摘于本溪市南芬区，经辽宁科技学院制药工程研究室葛会奇教授鉴定，均为刺五加叶。

样品自然风干后，粉碎成细粉(过3号筛)待用。

1.2 色谱条件
Agilent Extend C18(4.6mm×25mm，5μm)，柱温：30℃；流速1 mL/min；
进样量：10μL；流动相A：0.3%磷酸-水溶液，流动相B：0.3%磷酸-乙腈，梯洗程序如表1所示。

表1 梯洗程序时间(min)A(%)B(%)09553955108020357030401090501090
1.3 标准溶液
精密称取干燥至恒重的原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E、金丝桃苷及槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的对照品储备溶液，使用前稀释成工作溶液。

1.4 样品制备
取刺五加叶粉末1.0 g，精密称定，精密加入70%甲醇20 mL，浸提12 h，超声
处理30 min取出，用70%甲醇补足失重，滤过，将续滤液过0.45 μm微孔滤膜，待进样分析。

2 方法与结果
2.1 线性范围及检出限
配置系列标准曲线浓度溶液，按上述色谱条件依次进样，以浓度为横坐标，峰面积作为纵坐标，得到各成分标准线性方程如表2所示，依据1.4项样品处理，计算出各离子检出限值。

实际样品与标准溶液对照图谱如图1所示。

表2 五种成分工作曲线浓度表离子种类工作曲线系列浓度(mg/mL)线性方程相关
系数检出限(mg/mL)原儿茶酸51020304060Y=42.197x+14.7860.99950.88绿
原酸168335670100513402010Y=8.6645x-96.2670.99942.63刺五加苷
E61224364872Y=86.322x-18.9980.99920.30金丝桃苷
204080120160240Y=30.104x+39.8850.99911.64槲皮苷204080120160240Y=30.015x+31.0060.99961.62
图1 标准溶液与样品色谱图
2.2 精密度和回收率
准确称量适量刺五加叶样品，加入高中低三浓度的各组分标准溶液，并按1.4下样品处理平行制备6份后进样检测。

结果表明平均加样回收率在99.6%～103.1%，RSD为1.5%～ 2.7%。

2.3 实际样品测定
选取了春季不同采摘时间为4月23日、4月28日、5月5日和5月10日四批样品，按 1.2项下方法进行 H PLC分析，每批样品平行制备5个测定各指标成分的
峰面积并计算含量，结果如图2所示，4月28日各组分含量较高，提示后续叶片深加工可以选取该时间。

图2 采摘时间对各化合物含量的影响
3 讨论
3.1 指标成分的选择
对刺五加叶的60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇及90%甲醇提取液分别进行液相色谱仪检测，显示刺五加叶中成分复杂，并结合现有对照品，最终确定了原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E、金丝桃苷及槲皮苷5个主要化合物，且均具较强抗菌、抗炎等药理活性，符合相关刺五加叶功效，故选取它们为指标成分。

3.2 样品提取条件优化
考察了不同提取方法(静置过夜、超声处理、加热回流)对各指标成分提取率的影响。

结果表明,甲醇溶液浓度考察中，以70%甲醇对各指标成分的提取效率最高；超声处理30 min与热回流提取2h对于5个目标化合物的提取效率相差不多，考虑到
方法的简易与绿原酸的热不稳定性质〔3〕，样品处理最终选择超声30 min。

3.3 色谱条件优化
3.3.1 柱温
图3 色谱柱的柱温对于各化合物峰值的影响
如图3所示，对比柱温为25℃、30℃、35℃，随着柱温升高，上述五种物质的保留时间缩短，兼顾出峰时间和分离度，选定最佳柱温为30℃。

3.3.2 波长
原儿茶酸最大吸收波长206、221、265、296 nm；绿原酸最大吸收波长221、243、326 nm；刺五加苷E最大吸收波长206 nm；金丝桃苷最大吸收波长206、256、356 nm及槲皮苷最大吸收波长206、256、356 nm。

金丝桃苷和槲皮苷的紫外吸收相似，256 nm处吸收较356 nm处稍强；原儿茶酸与绿原酸的最大吸收波长均有221 nm，故如图4考察了波长206、221、265、256 nm四个波长，
兼顾黄酮类成分的定量分析及基线漂移情况，如图所示最终选择 256 nm为检测
波长，此波长下各物质亦有较强吸收。

图4 波长对于各化合物峰值的影响
3.3.3 流动相
考察了各目标峰在甲醇-水或乙腈-水系统中均出现严重的拖尾现象，故水相中引入一定量的酸加以改善。

通过对比甲酸、冰醋酸、磷酸等与峰形的改善效果关系，各调节剂对于黄酮类化合物峰形影响不大，但是磷酸改善原儿茶酸峰形较明显，兼顾各组分峰形最终选择了0.3%磷酸。

4 结论
建立了液相色谱法同时测定检测刺五加叶中原儿茶酸、绿原酸、刺五加苷E、金丝桃苷及槲皮苷五种成分的含量，精密度和回收率等都符合规范，且样品中各组分分离度较好，本方法简便可靠，适用于刺五加叶中的多成分含量测定。

参考文献
【相关文献】
〔1〕董文婷,霍金海,张海燕,等.刺五加叶的药理作用研究发展〔J〕.中国实验方剂学杂志,2015,21(23)：23-28.
〔2〕吴笛,张勉,张朝凤,等．款冬花中黄酮和酚酸类成分的研究〔J〕.中国中药杂
志,2010,35(9):1142.
〔3〕罗旭,唐小龙,杨宋琪,等.不同产地刺五加药材高效液相色谱指纹图谱研究〔J〕.中国药业,2017,26(20):66-68.。