相差显微镜与泽尔尼克(1)

构造（特殊光学装置）
❖ a. 环状光阑（Ring slit /annular diaphragm ）:
位于光源与聚光器之间 作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标
本上。 装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体---相衬聚
光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内， 外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对 应倍数的物镜配合使用。
环状光阑、 相板等
实像
暗视野聚光 器
衍射光图像
观察活细胞
相差显微镜
位相差显微镜（phase contrast microscope） 一种将光线通过透明标本细节时所产生的 光程差（即相位差）转化为光强差的特种 显微镜。 1942年制造了第一台相差显微镜，由于此 项发明，泽尔尼克于1953年获诺贝尔奖。
泽尔尼克 （Frits Frederik Zernike, 1888-1966）
由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光 阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节 望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。
❖ D.绿色滤光片 由于使用的照明光线的波长不同，常引起相 位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用 波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源 的波长。
❖ 位相（相位）：任一时刻光的振动状态，（振幅相 同的光不同时刻振动状态不同，光是余弦函数变化 的）
❖ 光程：光在媒质中通过的路程和该媒质折射率的乘 积。将光在介质中传播的路程折合为光在真空中传 播的相应路程 。
❖ 光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微 镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板， 利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人 眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原 来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比 度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光 学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不 清的活细胞及细胞内的某些细微结构。
构造
❖ b. 相板（Phase plate）:
装在物镜的后焦平面处 两部分： 1共轭面：半透明的环状 未发生偏斜的直射光通过 将直射光推迟一定波长，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，
标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差 2补偿面： 通过衍射光的部分 将衍射光推迟一定波长，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，
示意图
Specimen:样本 Objective:物镜 Condenser:聚光镜 Deflected light: 相板（Phase ring） 环形光阑（annular phaseplate）
Байду номын сангаас
相差的产生
❖ 光通过透明物体时是要慢下来 的，为了把直接传播的光和被 物体衍射的光区分开来，在聚 光器的焦平面上放一环形光栅， 并在两个物镜之间插入一个相 板，使相板上的环形条纹与环 形光栅的象恰好重（通过合合 轴调节望远镜 ）。这样，直接 光全部穿过位相板上的环纹 （共轭面），而衍射光多半穿 过纹道的外部（补偿面）。
1888年7月16日出生于荷兰阿姆斯特丹 一个数学教师的家庭里。他父母都是数 学教师。
因论证相衬法，特别是发明相衬显微 镜，获得了1953年度诺贝尔物理学奖。
原理
❖ 人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度）， 对于无色通明的生物标本，未经染色的标本（如活 的细胞），其形态和内部结构往往难以分辨。
❖ 显微镜中所观察的许多物体，如生物切片、油膜和 位相光栅等，均具有较高的透明度。光波通过这些 物体时，只改变入射光波的位相而不改变它的振幅， 这种物体称为“位相物体”。
相衬法(相差法)
❖ 由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光 线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程 就会有差别。随着光程的增加或减少，加快 或落后的光波的相位会发生改变（产生相位 差）。
❖ 此时，整个视野是黑暗的，样品与背景差别 变大大，从而可以清楚看到透明微小颗粒。
应用
❖ 注意：在暗视野中所观察到的是被检物体的 衍射光图像．并非物体的本身，所以只能用 于观察物体的存在和运动，不能辨清物体的 细微结构。
原理 特殊构造 成像 应用
大致比较
相差显微镜 相差法
暗视野显微 镜
丁达尔现象
暗视野显微镜
原理
❖ 丁达尔现象：
在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被 看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门 缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了
特殊光学设备
❖ 使用中央遮光板或暗视野聚光器，使光源的 中央光束被阻挡．不能由下而上地直接通过 标本进入物镜。
❖ 从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的 标本上，标本遇光发生反射或散射，让散射 的光线投入物镜内。
振幅差的产生
❖ 两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光 路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干 涉，变相位差为振幅差。
❖ 这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体 的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼 可以分辨的振幅差（明暗差）。
应用
相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于 对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖 情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、 细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、 杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。
形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 有相板的物镜称”相衬物镜”，外壳上常有”Ph”字样。
❖ C.合轴调节望远镜 : 使环状光阑的像与相板共轭面完全吻合，实现对直射光和衍射
光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收 的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就 不能达到相差镜检的效果。