葡萄球菌和链球菌的微生物学检查

青岛农业大学兽医微生物实验报告
题目：葡萄球菌和链球菌的分离鉴定
姓名：阿芳
学院：动物科技学院
专业：动物科学
班级： 201X级X班
学号：（201XXXXX）
指导教师：任慧英
完成日期 2014年3月22日
葡萄球菌和链球菌的分离鉴定
摘要
目的：对实验提供的A、B两种细菌进行分离鉴定。

主要方法：通过对细菌的分离培养，形态的观察以及生化反应的现象等方法进行鉴定。

关键词：葡萄球菌；链球菌；分离鉴定
引言1
葡萄球菌是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名。

多数为非致病菌，少数可导致疾病。

葡萄球菌是最常见的化脓性球菌。

无鞭毛，无荚膜，不产生芽胞，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，在含有血液和葡萄糖的培养基中生长更佳，需氧或兼性厌氧，少数专性厌氧。

28～38℃均能生长，致病菌最适温度为37℃，PH为4.5～9.8，最适为7.4。

在琼脂平板上形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的菌落。

葡萄球菌在血琼脂平板上形成的菌落较大，有的菌株菌落周围形成明显的完全透明溶血环（β溶血），也有不发生溶血者。

多数葡萄球菌能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产生气。

致病性菌株能分解甘露醇。

葡萄球菌在自然界中分布很广，健康禽类的皮肤、羽毛、眼睑、粘膜、肠道等都有葡萄球菌存在。

链球菌是化脓性球菌的另一类常见的细菌，常排列成链状，无芽胞，无鞭毛，有菌毛样结构，革兰氏染色阳性。

需氧或兼性厌氧，有些为厌氧菌。

营养要求较高。

普通培养基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生长。

最适温度37℃，最适PH7.4～7.6，血琼脂平板上形成灰白色、有乳光、表面光滑、边缘整齐、直径0.5—0.75mm的细小菌落，不同菌株有不同溶血现象。

根据在血琼脂培养基上的溶血特征可分为三种不同类型：α型溶血性链球菌又称草绿色链球菌，菌落周围出现草绿色溶血环，致病力弱。

β型溶血性链球菌产生强烈的溶血毒素，在血琼脂培养基上，可使菌落周围出现宽2～4毫米、界限分明、无色透明的溶血环，致病力强。

γ型链球菌不溶血。

能发酵简单的糖类，产酸不产气。

链球菌与葡萄球菌不同，不产生过氧化氢酶。

广泛分布于自然界和人及动物粪便和健康人鼻咽部，大多数不致病。

1 材料与方法
1.1 材料
两种未知的细菌分别为A菌、B菌。

1.2培养基
1.2.1普通琼脂培养基的制作
（1）称量：牛肉膏 1克、蛋白胨 2克、NaCl 1克、蒸馏水200毫升于烧杯中。

（2）溶解：搅动，加热溶解。

（3）调节pH值：用NaOH溶液或HCl溶液来进行调节。

调pH 为7.5。

（4）分装：将制好的培养基分装入烧瓶或试管内，塞上瓶塞，用牛皮纸包扎瓶口。

在121℃高压蒸汽灭菌20～30min即成。

（5）制作平板:将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下瓶塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入3mm厚度。

铺放培养基后放置15分钟左右，待
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源自李一经.兽医微生物学【M】.北京：高等教育出版社，2011，第五章病原球菌。

培养基凝固后，即可接种。

1.2.2血琼脂培养基的制作
（1）兔子心脏取血：取一只兔子，找到心跳最快的位置，先用碘酒棉擦，再用酒精棉擦。

垂直于兔子的心脏将已有0.5ml柠檬酸钠溶液的一次性针管插入，抽取血液到5ml处。

（2）制作血平板：按照1.2.1的方法制作普通琼脂培养液，至不烫手后，向装有普通琼脂培养液的锥形瓶里注入3ml,混合均匀。

将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下瓶塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入3mm厚度。

铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，即可接种。

1.3细菌的划线分离
1.3.1平板的用途
（1）供分离划线；分离划线的目的是为了得到单个菌落，以备进一步鉴定。

（2）扩大培养，得到更多的菌苔。

1.3.2无菌操作
培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种环等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品菌）于培养基上。

1.3.3分区划线
四个方向用接种环蛇形分区划线，每划一次之前都要先用酒精灯灭菌，且操作要在无菌环境下进行。

2 结果与分析
2.1普通琼脂平板
2.1.1 A、B菌的生长情况如图1
图1
2.1.2 A、B菌的生长情况分析
葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好。

链球菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良。

可以初步断定A菌可能为链球菌，B均可能为葡萄球菌。

2.2血琼脂平板
2.2.1 A、B菌的生长情况如图2
图2
2.2.2 A、B菌的生长情况分析
葡萄球菌在血琼脂平板上形成的菌落较大，菌株菌落周围形成明显的完全透明溶血环（β溶血），链球菌营养要求较高，血琼脂平板上形成灰白色、有乳光、表面光滑、边缘整齐的细小菌落。

可以初步断定A菌可能为链球菌，B均可能为葡萄球菌。

2.3革兰氏染色2
2.3.1基本原理
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。

2.3.2器材准备
（1）试剂：草酸铵结晶紫、革兰氏碘溶液、乙醇（95%）、沙黄水溶液、生理盐水、香柏油。

（2）器材:载玻片、光学显微镜、接种环、酒精灯等。

2.3.3实验步骤
载玻片固定。

在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的已滴上生理盐水的载玻片上涂布均匀，在火焰上稍加热并使其粘附固定。

用草酸铵结晶紫染1～2分钟，水洗。

再用革兰氏碘溶液媒染1～3分钟，水洗。

用乙醇（95%）脱色30秒，水洗。

最后用沙黄复染30秒，水洗。

在光学显微镜下，用油镜，镜检。

2.3.4试验结果与分析
葡萄球菌和链球菌均呈现蓝紫色，都是革兰氏阳性菌。

两菌试验结果见图3
图3
2.4触酶（H
2O
2
）试验3
2胡桂学.兽医微生物学实验教程【M】.北京：中国农业出版社，2006，革兰氏染色原理。

2胡桂学.兽医微生物学实验教程【M】.北京：中国农业出版社，2006，触酶试验介绍。

2.4.1基本原理
葡萄球菌含有接触酶（或H2O2），能催化H2O2产生水和初生态的氧，继而形成氧分子，出现气泡，而链球菌则不能产生气泡。

2.4.2器材准备
（1）试剂：3% H2O2，即1ml 30% H2O2 加入9ml 蒸馏水中即成。

（2）器材:小试管、细玻棒、接种环、酒精灯等。

2.4.3实验步骤
取2ml 3%H2O2 ,加入干净的小试管中，用细玻棒或接种环分别蘸取A、B两种试验菌，插入
H2O2液面下，若有气泡产生着为阳性。

2.4.4试验结果与分析
A菌没有产生气泡，触酶阳性，而B菌产生气泡。

初步断定A菌为链球菌，B菌为葡萄球菌。

B菌试验结果见图4
图4
2.5凝固酶试验4
2.5.1基本原理
致病性葡萄球菌可产生凝固酶。

是一种分泌至菌体外的游离凝固酶。

作用类似凝血酶原物质，可被血浆中的协同因子激活变为凝血酶样物质，而使纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而使血浆凝固，可用试管法测出。

2.5.2器材准备
（1）试剂：0.5mL兔血浆、葡萄球菌。

（2）器材:小试管、接种环、酒精灯。

2.5.3实验步骤
挑取细菌菌苔，混悬于1:4稀释的0.5mL兔血浆与初步确定为的金黄色葡萄球菌混合物中，充分混匀，置36±1°C培养，培养2～4小时，查看结果。

2.5.4试验结果与分析
B菌出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。

B菌试验结果见图5
4胡桂学.兽医微生物学实验教程【M】.北京：中国农业出版社，2006，凝固酶试验介绍。

图5
2.6甘露醇发酵试验
2.6.1基本原理
金黄色葡萄菌发酵甘露醇产酸，使培养基变混浊，颜色由紫色变黄色，是为甘露醇发酵试验阳性。

2.6.2器材准备
（1）试剂：甘露醇。

（2）器材:甘露醇发酵管、接种环。

2.6.3实验步骤
无菌操作取初步确定为的金黄色葡萄球菌混合物接种于甘露醇发酵管，密封保存，37℃培养18～24小时，观察结果。

2.6.4试验结果与分析
B菌使培养基变混浊，颜色由紫色变黄色，是为甘露醇发酵试验阳性。

B菌试验结果见图6
图6
3 讨论
3.1兔子抽血量不够
由于实验兔子多次使用，产血量跟不上，导致在心脏跳动最快的位置却抽不出来血。

3.2油镜观察不到或出现大片染色区域
（1）观察不到：取菌的量太少，或者革兰氏染色过程中操作不当造成菌被冲洗掉了。

（2）出现大片染色区域：所看到的不是细菌，可能由于革兰氏染色不均匀，看到了大片的染剂。

4 结论
通过上述实验证明A为链球菌，B为葡萄球菌。

参考文献
1.李一经.兽医微生物学【M】.北京：高等教育出版社，2011
2.胡桂学.兽医微生物学实验教程【M】.北京：中国农业出版社，2006。