子宫内膜癌细胞表达纤维蛋白原的检测

子宫内膜癌细胞表达纤维蛋白原的检测
雷放;谢先丰
【摘要】目的探讨子宫内膜癌细胞是否表达纤维蛋白原.方法纳入于医院接受子宫切除手术的16例子宫内膜癌患者(内膜癌组),同期4例良性子宫肿瘤切除的病例(对照组),采用Western blot和qRT-PCR实验,分别检测各子宫内膜组织标本中纤维蛋白原蛋白和三链(a、b、g)mRNA表达水平.结果 Western blot检测结果显示,81.25％(13/16)的内膜癌组标本存在纤维蛋白原蛋白表达,而对照组未观察到其表达;qRT-PCR检测结果显示,内膜癌组有7例标本(43.8％)存在至少一个纤维蛋白原链mRNA的表达,而对照组均未观察到其表达.表达纤维蛋白原mRNA的全部7例标本在Western blot检测中均呈较高水平表达.结论绝大多数子宫内膜癌细胞具备表达纤维蛋白原的能力,是子宫内膜癌高纤维蛋白原血症的重要来源之一.%Objective To explore whether endometrial carcinoma cells express fibrinogen or not.Methods A total of 16 patients with endometrial carcinoma to receive hysterectomy in our hospital ("endometrial carcinoma group") and another four patients to receive Benign hysterectomy in the same period ("the control group") were
selected.Western Blot and qRT-PCR experiments were respectively conducted to detect the expression levels of the fibrinogen and triple-stranded (a,b and g) mRNA in specimens of endometrium.Results The results of Western Blot detection showed that 81.25％ (13/16) of endometrial carcinoma specimens had the expression of fibrinogen,while the expression thereof was not observed in the control group;the results of qRT-PCR detection showed that seven specimens (43.8％) in the
endometrial carcinoma group had the expression of at least one fibrinogen chain mRNA,but such expression was not observed in the control group.All of the seven specimens with the expression of fibrinogen mRNA were at high expression levels in Western blot detection.Conclusion Most endometrial carcinoma cells are capable of expressing fibrinogen,which is an important source of endometrial carcinoma hyperfibrinogenemia.
【期刊名称】《西南国防医药》
【年(卷),期】2017(027)012
【总页数】3页(P1301-1303)
【关键词】子宫内膜癌;纤维蛋白原;表达
【作者】雷放;谢先丰
【作者单位】610017成都,成都市第二人民医院妇产科;610017成都,成都市第二人民医院妇产科
【正文语种】中文
【中图分类】R737.33
子宫内膜癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一[1]。

近年来子宫内膜癌导致死亡风险急剧上升[2]。

因此，深入探讨子宫内膜癌的生物学行为，对改善其诊断和治疗策略具有重要价值。

纤维蛋白原是一类340 kD的二聚体蛋白，由三种多肽链构成（a、b和g链）。

通常认为，纤维蛋白原由肝脏产生分泌，进入血液循环，其浓度为200～380mg/L，半衰期为4 d[3]。

最近，子宫内膜癌的相关研究显示，
术前高纤维蛋白原水平与肿瘤临床分期较晚相关，是患者预后差、生存期短的标志物[4]。

然而，肿瘤组织是否产生纤维蛋白原，尚存在很多争议。

本研究拟通过Western blot和qRT-PCR技术检测子宫内膜癌的纤维蛋白原表达情况，探讨子
宫内膜癌细胞是否表达纤维蛋白原。

1.1 标本来源收集2014年1月～2015年4月在医院行子宫切除术的16例子宫
内膜癌和4例子宫良性肿瘤患者的子宫内膜组织标本，排除子宫内膜增生患者及
慢性炎症性疾病、凝血障碍疾病或其他原因造成的异常纤维蛋白原血症患者。

1.2 Western blot检测用蛋白裂解液[20mmol/L Tris （pH 8.0），
137mmol/LNaCl， 20mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），1%NP-40.2 mmol/L 钒酸钠，100 μg/ml苯甲基磺酰氟，1μg/ml抑蛋白酶肽]充分裂解组织标本，冰浴
30min，12 000转/min离心10min。

取上清，BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云
天生物公司）定量蛋白。

取等量蛋白上样，采用12%的SDS-PAGE凝胶电泳，半干式转移法转至硝酸纤维素膜。

用5%的脱脂牛奶封闭后，使用相应的抗体杂交后，采用BeyoECL Plus超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天生物公司)，在凝胶成像化
学发光检测仪ChemiDocTM XRS+(美国Bio-rad公司)显色检测，GAPDH作为
检测内参。

1.3 qRT-PCR检测按照总RNA提取试剂盒（大连宝生物公司）说明书，分别提
取组织标本的总RNA，所得RNA纯度经鉴定符合实验要求。

使用RT-PCR试剂
盒（大连宝生物公司）进行反转录和PCR扩增，GAPDH作为RT-PCR实验的内参。

参考文献[5]的方法，并经BLAST验证引物特异性，确定并合成纤维蛋白原a、b、g链的PCR扩增引物（英骏生物技术有限公司，中国上海），序列如表1所示。

使用CFX 96 TM rea-time system荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）
检测。

q-RT PCR切点阈值设置为对照组人群纤维蛋白原相应链均值加上3倍标准差，高于该值即为阳性表达。

1.4 统计学方法应用SPSS19.0统计软件分析数据，计量资料以±s表示，组间比
较采用t检验；计数资料以例和百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为
差异有统计学意义。

2.1 Western blot检测结果 16例子宫内膜癌标本中，3例呈现低表达，其余13
例（81.3%）呈现中高度表达（图1），而对照组4例标本均未观察到阳性表达，两组阳性表达率有显著差异（P＜0.01）。

2.3 qRT-PCR检测结果子宫内膜癌组中，7例（4
3.8%）存在至少一个纤维蛋白
原链mRNA的表达，其中2例（12.5%）表达a链mRNA，5例（31.3%）b链，4例g链（25.0%），4例同时表达b和g链。

而对照组未观察到纤维蛋白原链mRNA的表达。

表达纤维蛋白原mRNA的全部7例标本在Western blot检测中均呈较高水平表达。

见表2。

高纤维蛋白原血症参与调控肿瘤恶性生物学行为，可能与肿瘤引发全身炎症反应相关，因此，高纤维蛋白原血症是恶性肿瘤的潜在标志[6]。

但是，高纤维蛋白血症
的成因却存在争议。

本研究通过对子宫内膜癌组织进行Western blot和qRT-PCR检测，证明子宫内膜癌细胞具有产生纤维蛋白原的能力。

体外实验证明，恶性肿瘤细胞能够产生纤维蛋白原[7]；临床宫颈细胞、肺癌和肠
癌组织的细胞浆内可以检测到纤维蛋白原的mRNA[8-9]。

动物实验检测结果也显示，纤维蛋白原缺失的转基因小鼠的肿瘤细胞侵袭迁移能力较弱。

研究发现，纤维蛋白和血小板的聚合物，可以庇护肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监视[10]。

此外，纤维蛋白原可以结合参与新血管生成和细胞增殖的相关因子（如成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子），从而参与促进肿瘤的生长[11]。

此外，纤维蛋白原与肿瘤细胞外基质表达的受体整合素相互作用，从而使转移性肿瘤细胞定植到远处组织[11]。

上述研究结果都证明纤维蛋白原在肿瘤转移中发挥重要作用。

因此，肿瘤细胞通过表达纤维蛋白原可能导致恶性生物学行为，具有更高的侵袭转移能力。

子宫内膜癌患者的高纤维蛋白原血症与不良预后之间存在显著联系[4]，但尚未明
确的是纤维蛋白原水平上升导致的血浆高凝状态，是由于肝脏释放纤维蛋白原增加，还是肿瘤本身产生的所致。

本研究发现，43.8%的子宫内膜癌患者存在至少纤维蛋白原一个链的mRNA表达，而对照组均无表达。

Western blot分析显示，纤维
蛋白原高表达仅见于子宫内膜癌患者，而对照组没有。

纤维蛋白原是否可作为鉴别子宫内膜癌良恶性的指标，有待进一步的大样本、多中心、多病变组织的深入研究证实。

既往免疫组化和PCR分析支持肿瘤细胞具有合成纤维蛋白原的能力。

一项体内研
究证实，比较术中肺癌病变肺叶的肺静脉和上腔静脉的血浆，发现肿瘤组织是纤维蛋白原的来源之一[12]。

本研究进一步证明，在子宫内膜癌组织，癌细胞具有纤维蛋白原分泌功能，是子宫内膜癌患者血清纤维蛋白原的重要来源之一。

但本研究尚未发现纤维蛋白原三链mRNA阳性表达的病例，可能是由于患者数量偏少，或者是情况确实如此，有待扩大样本量进一步的验证。

总之，本研究证实了子宫内膜癌细胞具备合成并分泌纤维蛋白原的能力，是患者高纤维蛋白原血症的重要来源。

子宫内膜癌细胞分泌纤维蛋白原的相关机制及其治疗价值，是未来研究的重要内容。

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