叶绿素实验报告

叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定
食品092
一、实验目的：
1、从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率。

2、初步研究叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件。

3、分析叶绿素铜钠产品的纯度并计算其产率。

4、通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。

二、产品验收指标
项目和指标
───────────────┬──────────
项目│ 指标
───────────────┼──────────
pH │ 9.0～10.7
1％│
E 405nm ≥ │ 568
1cm │
消光比值│ 3.2～4.0
总铜(Cu),％│ 4.0～6.0
游离铜(Cu),％≤ │ 0.025
砷(As),％≤ │ 0.0002
铅(Pb),％≤ │ 0.0005
干燥失重,％≤ │ 4.0
硫酸灰分,％≤ │ 36.0
───────────────┴──────────
三、实验原理:
叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的绿叶和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必须的催化剂，叶绿素难溶于水，而易溶于极性有机溶剂。

叶绿素有a和b 两种，a为蓝黑色结晶
叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环．卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面．
叶绿素的结构如图l所示：
蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。

所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解，且又不溶于水。

110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。

叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：
Ｃ
55Ｈ
72
Ｏ
5
Ｎ
4
Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ
34
Ｈ
30
Ｏ
5
Ｎ
4
ＭｇＮａ
2
+ ＣＨ
3
ＯＨ + Ｃ
20
Ｈ
39
ＯＨ
Ｃ
55Ｈ
70
Ｏ
6
Ｎ
4
Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ
34
Ｈ
28
Ｏ
6
Ｎ
4
ＭｇＮａ
2
+ ＣＨ
3
ＯＨ + Ｃ
20
Ｈ
39
ＯＨ
在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸：
Ｃ
34Ｈ
30
Ｏ
5
Ｎ
4
ＭｇＮａ
2
+ 4Ｈ+ = Ｃ
34
Ｈ
34
Ｏ
5
Ｎ
4
+ Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+
Ｃ
34Ｈ
28
Ｏ
6
Ｎ
4
ＭｇＮａ
2
+ 4Ｈ+ = Ｃ
34
Ｈ
32
Ｏ
6
Ｎ
4
+ Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+
叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：
Ｃ
34Ｈ
34
Ｏ
5
Ｎ
4
+Ｃｕ2+ = Ｃ
34
Ｈ
32
Ｏ
5
Ｎ
4
Ｃｕ+ 2Ｈ+
Ｃ
34Ｈ
32
Ｏ
6
Ｎ
4
+Ｃｕ2+ = Ｃ
34
Ｈ
30
Ｏ
6
Ｎ
4
Ｃｕ+ 2Ｈ+
Ｃ
34Ｈ
32
Ｏ
5
Ｎ
4
Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ
34
Ｈ
30
Ｏ
5
Ｎ
4
CｕＮａ
2
+ 2Ｈ
2
Ｏ
Ｃ
34Ｈ
30
Ｏ
6
Ｎ
4
Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ
34
Ｈ
28
Ｏ
6
Ｎ
4
CｕＮａ
2
+ 2Ｈ
2
O
蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在360~700之间有2个吸收峰在波长440处有一最大吸收峰,其吸光度为114;在630处有一较小的吸收峰,其吸光度为017"在波长440的吸收峰为叶绿素铜钠盐特有,而在630处的
吸收峰为叶绿素特有,叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍，所以试验中均采用440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。

下图是蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性［5］。

四、仪器和试剂
（一）、试剂：
1、蚕沙（50克）
2、95%乙醇
3、NaOH 溶液
4、稀盐酸
5、
溶液 8、蒸馏水 9、40%乙醇(纯乙醇丙酮 6、石油醚 7、CuSO
4
与蒸馏水按2:3配) 10、5%NaOH-乙醇溶液 11、pH试纸 12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：4混合（二）、仪器：
A、叶绿素的提取叶绿素铜钠合成
1、温度计1支回流冷凝管1支 500ml 圆底烧瓶1个
恒温槽1台滤瓶及漏斗1个胶头胶管1个
玻璃棒1支 100mL量筒1个铁架台1台电热恒温水浴装置1套
2、减压蒸馏装置 1台
3、台氏天平 1台
4、PH试纸若干
B、叶绿素铜钠质量分析
1、751分光光度计 1台
2、台式天平、分析天平各1台
3、玻棒1支胶头滴管1支 10mL、50mL量筒各一个 100mL、50mL容量瓶各1个 25mL、1mL吸量管各一支
4、试纸若干吸耳球一个
五、实验步骤
（一）叶绿素铜钠的合成
1、叶绿素的提取：
（1）在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙，再加入95%乙醇100ml。

（2）将反应瓶用水浴加热，使水浴温度在60℃（防止叶绿素a和b分解），浸泡提取2小时，滤出提取液。

（3）按步骤2用乙醇重复2次。

（4）合并3次提取液，在减压、不超过60摄氏度下蒸出乙醇。

趁热倾出瓶中液体，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置）。

2、皂化：
将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用5%NaOH-C
2H
5
OH溶液调节使其pH=11，用
水浴加热在60℃下皂化回流1小时。

3、萃取：
将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质（黄色）静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取上层液检验是否完全皂化：取上层液少许置于小烧杯中，加入2—3倍石油醚静置，用玻棒沾取上层液去试纸上，呈绿色则不完全皂化。

取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。

平行萃取3次。

4、调酸铜代：
将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH=7后，加入10%的硫酸铜10ml，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，在水浴60℃下保温搅拌1小时。

趁热过滤，用95%乙醇洗涤3次后抽干。

合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水，析出叶绿素铜，静置过夜后过滤，滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚
洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+、及残留的叶黄素和其
他有机杂质。

5、成盐：
洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH=11，搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐），将其在60℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物，然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。

流程图:
溶剂NaOH溶液不皂化物溶剂酸 CuSO4溶液滤渣
↓↓↑↓↓↓↓
蚕砂→
水稀酒精 NaOH
↓↓↓
成品
（二）、纯度分析：
1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线
称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。

准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，即为0.001%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm
波长处测定吸光值（A），以缓冲液作空白对照。

类似地配制0.0005%溶液、0.0015%溶液、0.002%溶液、0.0025%溶液，用分光光度计测定，在15分钟内用1cm 的比色杯，在405nm波长处测定它们的吸光值（A），以缓冲液作空白对照，并绘制标准曲线。

2、标准叶绿素铜钠盐的吸收曲线
称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。

准确取1mL溶液以pH=7.5磷酸盐缓冲液定容为100mL，摇匀，
为即为0.001%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm，吸光比A405nm/A
630nm
3.2～
4.0。

用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A（每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。

3、产品叶绿素铜钠盐的吸光比测定
称取烘干成品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。

从容量瓶中准确取2mL溶液移入50mL容量瓶，用pH=7.5磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即为0. 004%溶液，此液最大吸收峰为405nm与630nm。

用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm或10nm测定一次），以缓冲液作空白对照，并绘制吸收曲线。

一、标准叶绿素铜钠盐标准曲线
标准曲线的测定方法：取标准样品配制0.1%叶绿素铜钠盐溶液，用移液管分别精确量取2.5 mL ；
2.0mL ；1.5mL ；1.2mL ；1.0mL ；0.5mL 移至5个加入100mL 的容量瓶中，向其中各加入pH=7.5的Na 2HPO 4－NaH 2PO 4缓冲液，摇匀定容至刻度，即0.0025%；0.002%；0.0015%； 0.001%；0.0005%。

以缓冲液作空白对照，分别测以上溶液在波长405nm 下的吸光度值A 405 。

如表1、图1所示。

表1 叶绿素铜钠盐标准曲线的测定数据表（光波长405nm ） 溶液百分数（%） A 405
0.0005 0.198
0.001 0.362
0.0015 0.552 0.002 0.716 0.0025 0.924
二、叶绿素铜钠盐的吸收曲线
（一）标准样品：
取标准样品配制0.001%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm 波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm 或10nm 测定一次），以缓冲液作空白对照。

测定数据如表2所示，吸收曲线如图2所示。

（二）产品：
取产品配制0.004%叶绿素铜钠盐溶液，用分光光度计测定，用1cm 的比色杯，在400nm-700nm 波长处测定溶液吸光值A （每隔5nm 或10nm 测定一次），以缓冲液作空白对照。

测定数据如表3所示，吸收曲线如图3所示。

数据记录: 1、产品的质量是0.0483g（借第12组：冯奕淇和雷春雨的实验结果）
2、产品产率：W=0.0483/50*100%=0.0966%
3、吸光比=A410nm/A630nm=0.065/0.037=1.8
八、实验分析
本实验所测得的吸光值相对较小，对比于标准的吸光曲线，在波峰（405nm与630nm）处的值仅为0.065和0.037，比标准吸光曲线的值小了4--5倍。

其中的原因可能为：所制备的产品的原因:一个原因是产品的纯度较低；二个是可能产品没
有完全烘干，实际用于配制溶液的产品的质量小于称量的质量。

配制溶液的原因:由于产品纯度较低，所以相应的用于配制溶液的产品的质量也应该增多，而配的溶液的含量较小，这可能就造成了所测得的吸光度较小的原因。

实验失败的原因：
1、蚕沙不过粉碎，可能导致叶绿素溶解不过充分，加乙醇回流时，时间2小时每次，因浸提不充分，浸提时间不够会导致提取率过低。

2、皂化1小时后，用石油醚萃取，上层杂质还是绿色，可能是皂化时间不够，这步导致了大量叶绿素的流失，以致最终产率只有微量而无法配置叶绿素溶液测吸光度。

3、整个实验过程中洗涤与过滤次数较多，而叶绿素盐粘稠易粘附在滤纸上，很不容易取下，且在洗涤过程也有叶绿素盐的损失。

以上两项操作直接影响到产率的高低。

4、调酸铜代这步时，由于保温后趁热过滤时过滤速度比较慢，还没过滤完就用95%的乙醇边洗涤变过滤，乙醇作用是析出叶绿素的，这就导致了大量的叶绿素留在滤渣里，而我们实验要的是滤液。

5、调酸铜代这步时，由于静置过夜后进行减压过滤，由于叶绿素铜分子太小，滤纸并不能完全的保留住其在滤饼里而流失过多，使最终产率很少。

6、在成盐这步时，加入缓冲液调pH时，由于滴加速度控制不好，使pH超过12，后又用稀盐酸调到PH=11.55；成盐时静置半个钟以上不定期检测是否完全成盐，可是用玻棒点些许溶液放在滤纸一直都是显淡淡的绿色，这两方面可能导致成盐效果不好。

这也是产率低的关键因素之一。

九、参考文献:
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